一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法：(1)采集氣溶膠樣本；(2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA；(3)檢測：進行PCR擴增；(4)建立標準曲線和溶解曲線：建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線；(5)判斷氣溶膠樣本中是否含有口蹄疫病毒。本發(fā)明還公開了特異性引物(如SEQ?ID?NO.1～8所示)以及試劑盒(由特異性引物、RT反應緩沖液、AMV反轉錄酶、?Premix?Ex?TaqTM?II、標準陽性質粒、無RNase的水組成)。本發(fā)明的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒既可用于養(yǎng)殖場氣溶膠的口蹄疫病毒檢測和血清型分型，也可用于臨床樣本的直接檢測，還可用于科學研究等非疾病的診斷。
【專利說明】一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種通過熒光定量SYBR Green I方法分型檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，以及特異性引物、試劑盒，屬于生物檢測領域。
【背景技術】
[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄類動物發(fā)生急性、熱性、高度接觸性傳染病，一旦暴發(fā)，必須撲殺感染及接觸感染的動物?？谔阋弑皇澜鐒游镄l(wèi)生組織列為法定報告疫病，被我國列為一類動物疫病之首，不僅會造成巨大的直接經(jīng)濟損失，而且嚴重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及相關產(chǎn)品的對外貿易，對國家的政治、經(jīng)濟具有深遠的影響。
[0003]口蹄疫病毒有7個血清型和65個以上的血清亞型，血清型之間無交叉免疫現(xiàn)象，因而難以控制。我國為口蹄疫流行國家，主要流行O型、A型和Asial型口蹄疫。2005年我國大面積爆發(fā)了 Asial型口蹄疫，2009年和2013年爆發(fā)了 A型口蹄疫，近年來，均有O型口蹄疫的散發(fā)和流行，特別是隨著我國養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)?；难该桶l(fā)展，口蹄疫的傳播風險也來越大。
[0004]由于養(yǎng)殖動物高度密集，患病動物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍內高濃度微生物氣溶膠的積聚，而且通過舍內外氣體的交換，病原微生物隨著大氣傳播、擴散，造成環(huán)境生物污染和傳染病傳播?？谔阋卟《灸茉诳諝庵行纬蓺馊苣z，病毒可隨風散播到50~100公里外的地方，傳播速度快，距離遠，難于防御。因此，通過建立一種適用于口蹄疫病毒氣溶膠的檢測方法， 將為口蹄疫預報預警提供配套技術。
[0005]目前應用于氣溶膠病毒的檢測方法主要有培養(yǎng)法和分子生物學方法，實時突光定量PCR是目前確定樣品中DNA (或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準確的分子生物學方法，具有靈敏度和特異性高、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，可應用于病原微量檢測。然而關于氣溶膠的口蹄疫病毒突光定量PCR檢測及其分型方法未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006]針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種通過熒光定量SYBRGreenI方法分型檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，以及特異性引物、試劑盒。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0008]一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，步驟如下:
[0009](I)采集氣溶膠樣本；
[0010]進一步地，采集氣溶膠樣本的方法為:采用MS-1型多功能微生物采樣器，以IOmLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集養(yǎng)殖場環(huán)境中的氣溶膠樣本；
[0011](2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA ；
[0012]進一步地，提取cDNA的方法為:取2mL氣溶膠樣本，應用病毒RNA提取試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術中的常規(guī)試劑盒)提取總RNA ;再參照反轉錄試劑盒(商業(yè)化產(chǎn)品，現(xiàn)有技術中的常規(guī)試劑盒)說明書進行反轉錄，獲得cDNA ;
[0013](3)檢測:以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreen I實時熒光定量PCR,具體如下:
[0014]所述試劑盒由特異性引物、RT反應緩沖液、AMV反轉錄酶、SYBfT Premix Ex Taq?
I1、標準陽性質粒、無RNase的水組成。
[0015]所述標準陽性質粒包括陽性質粒pEASY-T3-5’ UTR、pEASY-T3-0_VPl、PEASY-T3-A-VP1和pEASY_T3-Al_VPl ;用于標準曲線的制備及氣溶膠口蹄疫病毒拷貝數(shù)的計算。
[0016]所述陽性質粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID N0.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段與PEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規(guī)技術。
[0017]所述陽性質粒pEASY-T3-0-VPl是由ID N0.10所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規(guī)技術。
[0018]所述陽性質粒pEASY-T3-A-VPl是由SEQ ID N0.11所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后 得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規(guī)技術。
[0019]所述陽性質粒pEASY-T3-Al-VPl是由SEQ ID N0.12所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規(guī)技術。
[0020]所述特異性引物選自口蹄疫病毒檢測的通用引物對或/和O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對；
[0021]所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下:
[0022]引物1-5，UTR-F:5，-CGTTGCACTCCACACTTAC-3，(SEQ ID N0.1)；
[0023]引物2-5，UTR-R:5，-GACCAAGTAGGCGGAAAG-3，(SEQ ID N0.2)；
[0024]O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
[0025]O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
[0026]引物3-0-VP1F:5，-GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’ (SEQ ID N0.3)；
[0027]引物4-0-VP1R:5，-CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’ (SEQ ID N0.4)；
[0028]A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
[0029]引物5-A-VP1F:5，-AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0030]引物6-A-VP1R:5，-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3’ (SEQ ID N0.6)；
[0031]Asial型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
[0032]引物7-A1-VP1F:5，-GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3，(SEQ ID N0.7)；
[0033]引物8-A1-VP1R:5，-CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0034]擴增反應體系為:20yL的擴增體系，包括2XSYBR Premix Ex Taq IIlOyL,10 μ mo I/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，陽性質粒I μ L，RNaseFreeddH2O補足20 μ L。
[0035]擴增條件為:預變性95 °C 30s，然后按照95°C變性5s、65°C退火延伸30s，進行40個循環(huán)；溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結束反應。
[0036](4)建立標準曲線和溶解曲線:建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線；
[0037](5)判斷:當所用特異性引物為口蹄疫病毒檢測的通用引物對時，若溶解曲線為S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有口蹄疫病毒；
[0038]當所用特異性引物為O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對時，若對應于O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有O型口蹄疫病毒；
[0039]若對應于A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有A型口蹄疫病毒；
[0040]若對應于Asial型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有Asial型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有Asial型口蹄疫病毒。
[0041]本發(fā)明的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法及試劑盒既可用于養(yǎng)殖場氣溶膠的口蹄疫病毒檢測和血清型分型，也可用于臨床樣本的直接檢測，還可用于科學研究等非疾病的診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1: 口蹄疫病毒SYBRGreenI實時定量PCR的標準曲線，圖中各點對應的拷貝數(shù)為:A:3.0XlO0 拷貝；B:3.0XlO1 拷貝；C:3.0XlO2 拷貝；D:3.0XlO3 拷貝；E5:3.0XlO4拷貝；F:3.0 X IO5拷貝。
[0043]圖2: 口蹄疫病毒SYBR Green I實時定量PCR的溶解曲線，其中，陰性對照以等量空載體pEASY-T3為模板，其他模板為標準陽性質粒分別為3.0 X 105-3.0 X 10°拷貝。
[0044]圖3: 口蹄疫病毒SYBR Green I實時定量PCR的特異性曲線，其中，1:3.0 X IO4拷貝的標準陽性質粒；2:0型口蹄疫病毒；3:A型口蹄疫病毒；4 =Asial型口蹄疫病毒；5:牛傳染性鼻氣管炎病毒；6:牛腸道病毒；7:牛流熱病毒；8:牛病毒性腹瀉病毒；9:水皰性口炎病毒；10:豬瘟病毒；11:豬皰疹病毒；12:ddH20。
[0045]圖4: 口蹄疫病毒SYBRGreenI實時定量PCR的靈敏度檢測，其中，1:3.0X IO6拷貝；2:3.0X IO5 拷貝；3:3.0X IO4 拷貝；4:3.0X IO3 拷貝；5:3.0X IO2 拷貝；6:3.0X IO1 拷貝；7:3.0X10°拷貝；8 =LOXlO0拷貝；9:陰性對照(以等量pEASY_T3為模板)。
[0046]圖5:0型口蹄疫病毒的SYBR Green I實時定量PCR溶解曲線。
[0047]圖6:A型口蹄疫病毒的SYBR Green I實時定量PCR溶解曲線。
[0048]圖7 =Asial型口蹄疫病毒的SYBR Green I實時定量PCR溶解曲線。
[0049]圖8:氣溶膠樣本口蹄疫病毒的檢測曲線，其中，A和B為檢測陽性的樣本。
【具體實施方式】
[0050]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0051]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052]反轉錄試劑盒(CodeN0.:D2639A) > SYBR'" PremixExTaq? II 試劑盒(Code N0.:RR820A)，購自寶生物工程(大連)有限公司。通用檢測引物(引物I和引物2) ;0型、A型、Asial型3種血清型分型引物(引物3和引物4，引物5和引物6，引物7和引物8)，引物由上海生工生物技術有限公司合成。[0053]實施例1標準品陽性質粒的制備
[0054]1.引物的設計與合成
[0055]通過對GeneBank中口蹄疫病毒5’ UTR基因進行序列比對，確定保守區(qū)域，設計I對通用引物，為序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，可對口蹄疫病毒7個血清型檢測，擴增出PCR片段，用于陽性標準質粒的構建；然后根據(jù)口蹄疫病毒VPl序列的差異，分別設計3對引物，可對O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒分型。O型口蹄疫病毒分型引物為序列表中的SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4 ;A型口蹄疫病毒分型引物為序列表中的序列SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6 ;Asial型口蹄疫病毒分型引物分別為序列表中的SEQ IDN0.7和SEQ ID N0.8。3種血清型分型引物所擴增的PCR片段，用于陽性標準質粒的構建。所有引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0056]2.口蹄疫病毒cDNA的制備
[0057]參照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，分別提取O型、A型、Asial型口蹄疫病毒RNA,參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄 ，獲得cDNA。
[0058]3.標準品的制備
[0059]以上述方法制備的cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為50μ L:10XPCRBuffer II (Mg2+Plus) 5 μ L、2.5mM dNTP Mixture8 μ L、rTaq0.5 μ L (5U/ μ L)、cDNA 模板2 μ L，分別加入10μ mol/L的上下游引物對各2 μ L (引物I和引物2，引物3和引物4，引物5和引物6，引物7和引物8)，滅菌超純水加至50 μ L0反應程序為94°C預變性3min，然后940C 20s, 550C 20s, 72°C 20s, 35 個循環(huán)；72°C延伸 5min，4°C保存。
[0060]PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷，克隆至pEAST-T3載體，重組質粒送上海生工測序，將測序結果與序列表中的SEQ ID N0.9、10、ll、12所示的序列進行比對，正確的重組質粒為陽性，將其分別命名為PEASY-T3-5 ’ UTR、pEASY-T3-0_VP 1、PEASY-T3-A-VP1、pEASY-T3_Al_VPl。
[0061]將pEASY-T3-5’ UTR質粒作為陽性標準品，用核酸蛋白分析儀(NanoPhotometer?P300)測定質粒濃度,按照下述公式計算出每μ L質粒中的DNA拷貝數(shù)，結果拷貝數(shù)為3.2X 101°拷貝/y L，將該質粒作為標準品。
[0062]拷貝數(shù)(拷貝/μL)=濃度(g/yL)+ 分子量(g/mol)X6X1023
[0063]實施例2 口蹄疫病毒通用引物的SYBR Green I熒光定量RT-PCR反應體系和條件的優(yōu)化
[0064]1.AMV反轉錄酶用量的優(yōu)化
[0065]經(jīng)過使用不同濃度AMV反轉錄酶的試驗結果比較，選定5U作為反應體系中AMV的
最佳用量。
[0066]2.引物濃度的優(yōu)化
[0067]在反應體系中,將引物濃度分別從0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋,互
相組合后經(jīng)熒光定量PCR儀(LightCycle/ 480II)檢測，通過試驗結果的分析比較，確定
的最佳引物終濃度0.3 μ mol/L。而口蹄疫病毒分型復合SYBRGreenI熒光定量RT-PCR的反應體系，引物3、引物4、引物7和引物8最佳引物終濃度0.2 μ mol/L，引物5和引物6最佳終濃度為0.3 μ mol/L。
[0068]3.反應條件的優(yōu)化[0069]進行退火溫度從60°C、61°C、62 V、63°C、64V、65°C、66 V、67 V 的優(yōu)化，所有引物
在65 °C退火溫度時,突光信號最好。
[0070]實施例3 口蹄疫病毒通用引物的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
[0071]1.標準曲線的確定和溶解曲線分析
[0072]熒光定量PCR標準曲線的確定，對質粒pEAST-T3_5’UTR進行定量，然后按10倍進行稀釋至3X10°-3X109拷貝數(shù)/yL，將稀釋的拷貝數(shù)作為模板進行SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增，建立標準曲線。擴增反應體系為20μ L:2XSYBR Premix Ex Taq ΙΙΙΟμ L,濃度為 10 μ mol/L 的 5，UTR-F 和 5，UTR-R 各 0.5 μ L，陽性質粒 pEAST_T3_5，UTRl μ L, RNaseFree ddH20補足20yL。同時設置陰性對照(以等量pEAST_T3代替模板)。然后進行標準曲線的擴增，反應條件為預變性95°C 30s，然后按照95°C變性5s、65°C退火延伸30s進行40個循環(huán)；溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結束反應。
[0073]標準曲線如圖1所示，各點在一直線上，即表明標準曲線好。
[0074]溶解曲線如圖2所示，溶解曲線峰單一，表明特異性擴增出陽性峰，沒有引物二聚體或其它非陽性峰出現(xiàn)。
[0075]2.SYBR Green I實時熒光定量PCR的特異性試驗
[0076]參照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取牛傳染性鼻氣管炎病毒和豬皰疹病毒的DNA ;提取牛腸道病毒、牛流熱病毒、牛病毒性腹瀉病毒、水皰性口炎病毒、豬瘟病毒RNA，參照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，獲得cDNA。
[0077]按照上述步驟建立的SYBR Green I實時熒光定量PCR方法進行特異性試驗，分別以口蹄疫病毒cDNA、牛傳染性鼻氣管炎病毒DNA、牛腸道病毒cDNA、牛流熱病毒cDNA、牛病毒性腹瀉病毒cDNA、水皰性口炎病毒cDNA、豬瘟病毒cDNA、豬皰疹病毒的DNA為模板，以ddH20為陰性對照，進行SYBR Green I實時熒光定量PCR。
[0078]在530nm激發(fā)光下檢測口蹄疫病毒的特異性的結果，如圖3所示，1:0型口蹄疫病毒；2:A型口蹄疫病毒；3:Asial型口蹄疫病毒；4:牛傳染性鼻氣管炎病毒；5:牛腸道病毒；6:牛流熱病毒；7:牛病毒性腹灣病毒；8:水皰性口炎病毒；9:豬痕病毒；10:豬皰疫病毒；11:3.0X IO4拷貝數(shù)/μ L標準陽性質粒；12:ddH20。從圖中可以看出，1_4有相應細菌的特異性熒光曲線，而5-12均沒有特異性熒光曲線，證實所設計的引物擴增口蹄疫病毒特異性好，與其它檢測病毒無交叉反應。因此，步驟I所用口蹄疫病毒的通用引物5’ UTR-F,5’ UTR-R，建立的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法可用于鑒定未知樣本是否存在口蹄疫病毒核酸。
[0079]3.SYBR Green I實時熒光定量PCR的靈敏度重復性試驗
[0080]以10倍系列稀釋上述步驟一制備的pEASY-T3-5 ’ UTR質粒，得到拷貝數(shù)為IX IO5-1X 10°拷貝/ μ L的系列稀釋液，將含有不同的質?？截悢?shù)的稀釋液作為模板，同時設置一等量PEASY-T3質粒為陰性對照，進行SYBR Green I熒光定量PCR擴增。其中，SYBRGreen I熒光定量PCR采用實施例2優(yōu)化后的反應體系和反應條件。
[0081] 在530nm激發(fā)光下檢測SYBR Green I熒光定量PCR擴增結果，如圖4所示，1:3.0XlO6 拷貝數(shù) / μ L ;2:3.0XlO5 拷貝數(shù)/μ L ;3:3.0XlO4 拷貝數(shù) / μ L ；4:3.0XlO3 拷貝數(shù)/μ L ；5:3.0X IO2 拷貝數(shù)/μ L ；6:3.0 X IO1 拷貝數(shù) / μ L ；7:3.0 X 10° 拷貝數(shù) / μ L ；8:1.0X10°拷貝數(shù)/yL;9:陰性對照(以等量pEASY_T3為模板)。從圖中的熒光曲線可見，對口蹄疫病毒的監(jiān)測3個拷貝仍有熒光曲線，表明本發(fā)明的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法對口蹄疫病毒的靈敏度為3個拷貝，遠高于常規(guī)PCR方法檢測靈敏度。
[0082]4.SYBR Green I實時熒光定量PCR的重復性試驗
[0083]按照上述步驟I中建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法，選取3.0 X IO4拷貝數(shù)/ μ L和3.0 X IO2拷貝數(shù)/ μ L兩個不同濃度PEASY-T3-5’ UTR質粒為模板，同時以等量PEASY-T3為陰性對照，每個模板濃度做三個重復，通過計算Ct值的標準差(S)和變異系數(shù)(CV)來驗證熒光定量PCR的批內重復性；另選取一個濃度的pEASY-T3-5’ UTR質粒DNA作為模板，進行熒光PCR擴增，間隔7d重復一次，共進行3次重復，然后計算Ct值的變異系數(shù)(CV)，驗證熒光定量PCR的批間重復性。
[0084]選取3.0X IO4 拷貝數(shù) / μ L 和 3.0 X IO2 拷貝數(shù) / μ L 二個濃度的 pEASY-T3_5’UTR質粒作重復試驗，其所得的Ct值分別為16.25、16.78和18.92、18.47，其Ct值變異系數(shù)均小于5% ;選取1.0X IO4拷貝數(shù)/ μ L的pEASY-T3-5’ UTR質粒，每間隔7天共三次進行熒光PCR測定，其Ct值的變異系數(shù)也小于5%。結果表明，建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法重復性好。
[0085]實施例4 口蹄疫病毒分型SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法的建立
[0086]將陽性質粒pEAST-T3-0-VPl、pEAST-T3-A-VPl、pEAST-T3-Al-VPl 稀釋，取 IX IO2拷貝數(shù)/ μ L的稀釋 液為模板，分別進行O型、A型、Asial型口蹄疫病毒的分型檢測。單分型檢測的擴增反應體系為20 μ L:2X SYBR Premix Ex Taq IIlO μ L，10 μ mol/L各引物對各
0.3 μ L，與引物相對應的陽性質粒I μ L7RNase Free ddH20補足20 μ L，以等量pEAST_T3為陰性對照。溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結束反應。
[0087]O型、A型、Asial型口蹄疫病毒分型的溶解曲線如圖5~圖7所示，溶解曲線峰單一，沒有引物二聚體或其它非陽性峰出現(xiàn)。經(jīng)軟件計算每個血清型病毒的Tm值，O型、A型、Asial型口蹄疫病毒的溶解曲線Tm值分別為:88.53+0.02，88.53+0.03,84.21+0.04。
[0088]實施例5氣溶膠樣本的檢測
[0089]1.氣溶膠樣品采集
[0090]選擇奶牛場的不同區(qū)域(奶牛舍、運動場、擠奶廳等)，應用MS-1型空氣微生物采樣箱，通過多功能微生物采樣器(青島，MS-1型)的Porton采樣器采集空氣樣品。首先安裝三腳架，采樣器放置高度為距地面L 5m，然后將IOmL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)注入Proton米樣器，同時滴加一滴橄欖油，放入三腳固定支架內固定。將Porton沖擊式穩(wěn)流器的一端接到主機入氣口上，另一端用橡膠管連接到Proton采樣器的出氣口上。采樣流量為5~35L/min，采樣時間為30min。采樣結束后將采樣器內的采集液收集到15mL離心管保存用于檢測。
[0091]2.模板的制備
[0092]氣溶膠吸收液，取約lmL，采用病毒RNA提取試劑盒，提取RNA。反轉錄獲得cDNA，_20°C存儲備用。
[0093]3.臨床氣溶膠樣本的檢測
[0094]待測樣本為山東省不同地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場不同地點收集的氣溶膠樣本，共計36份，分別提取這些氣溶膠樣本的基因組RNA，反轉錄cDNA。
[0095]以提取的36份氣溶膠樣本的cDNA分別為模板，按照實施例3建立的SYBRGreenI熒光定量PCR方法進行檢測。若在530nm激發(fā)光下的反應結果為S型曲線，則待測樣本中含有口蹄疫病毒；若反應結果為一條直線，待測樣本中沒有口蹄疫病毒。
[0096]經(jīng)測定，在530nm激發(fā)光下，檢測樣本中出現(xiàn)S型曲線的樣品有2份，為A和B，檢測樣本為一條直線的有34份(見圖8)，說明樣品中有2份為口蹄疫病毒陽性，34份樣品為口蹄疫病毒陰性，即不含有口蹄疫病毒。
[0097]發(fā)明人同時將以上36份氣溶膠樣本分別提取基因組RNA后，采用針對口蹄疫5’UTR基因(SEQ ID N0.9))進行序列測定的方法進一步證實本發(fā)明所提供的SYBRGreenI熒光定量PCR檢測方法的正確性。測序結果顯示，2份樣品為口蹄疫病毒陽性，其余34份樣品為口蹄疫病毒陰性， 測序結果與SYBRGreenI熒光定量PCR檢測方法結果完全一致。
【權利要求】
1.一種檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:步驟如下: (1)采集氣溶膠樣本； (2)提取氣溶膠樣本中病毒的cDNA； (3)檢測:以上述提取的cDNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR,具體如下: 所述試劑盒由特異性引物、RT反應緩沖液、AMV反轉錄酶、SYBIf Premix Ex Taq? I1、標準陽性質粒、無RNase的水組成； 所述標準陽性質粒包括陽性質粒 pEASY-T3-5’ UTR、pEASY-T3-0_VPl、pEASY-T3-A_VPl和 pEASY-T3-Al-VPl ； 所述陽性質粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID N0.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段與PEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述陽性質粒PEASY-T3-0-VP1是由ID N0.10所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述陽性質粒PEASY-T3-A-VP1是由SEQ ID N0.11所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒；
所述陽性質粒PEASY-T3-A1-VP1是由SEQ ID N0.12所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述特異性引物選自口蹄疫病毒檢測的通用引物對或/和O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對； 所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下:
引物 1-5，UTR-F:5’ -CGTTGCACTCCACACTTAC-3，；
引物 2-5’ UTR-R:5’ -GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’ ； O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下: O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 3-0-VP1F:5’ -GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’ ；
引物 4-0-VP1R:5’ -CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’ ； A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 5-A-VP1F:5’ -AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’ ；
引物 6-A-VP1R:5，-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3，； Asial型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 7-A1-VP1F:5’ -GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’ ；
引物 8-A1-VP1R:5’ -CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’ ； (4)建立標準曲線和溶解曲線:建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線； (5)判斷:當所用特異性引物為口蹄疫病毒檢測的通用引物對時，若溶解曲線為S型曲線，貝1J表明氣溶膠樣本中含有口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有口蹄疫病毒； 當所用特異性引物為O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對時，若對應于O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有O型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有O型口蹄疫病毒；若對應于A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有A型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有A型口蹄疫病毒；若對應于Asial型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的溶解曲線為S型，則表明氣溶膠樣本中含有Asial型口蹄疫病毒；若溶解曲線為一條直線,貝U表明氣溶膠樣本中不含有Asial型口蹄疫病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，采集氣溶膠樣本的方法為:采用MS-1型多功能微生物采樣器，以IOmLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集30min，收集氣溶膠樣本。
3.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，提取cDNA的方法為:取2mL氣溶膠樣本，應用病毒RNA提取試劑盒提取總RNA ;再應用反轉錄試劑盒進行反轉錄，獲得cDNA。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，PCR的擴增反應體系為:20μ L的擴增體系，包括2XSYBR Premix Ex Taq IIlOyL,10 μ mo I/L的上游引物和下游引物各0.5 μ L，陽性質粒I μ L7RNase Free ddH20補足20 μ L。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中口蹄疫病毒的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，PCR的擴增條件為:預變性95°C 30s，然后按照95°C變性5s、65°C退火延伸30s，進行40個循環(huán)；溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結束反應。
6.用于檢測口蹄疫病毒的特異性引物，其特征在于:所述特異性引物選自口蹄疫病毒檢測的通用引物對或/和O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對； 所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下:
引物 1-5，UTR-F:5’ -CGTTGCACTCCACACTTAC-3，；
引物 2-5’ UTR-R:5’ -GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’ ； O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下: O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 3-0-VP1F:5’ -GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’ ；
引物 4-0-VP1R:5’ -CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’ ； A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 5-A-VP1F:5’ -AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’ ；
引物 6-A-VP1R:5，-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3，； Asial型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 7-A1-VP1F:5’ -GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’ ；
引物 8-A1-VP1R:5’ -CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’。
7.權利要求6所述的特異性引物在制備檢測口蹄疫病毒的試劑盒中的應用。
8.權利要求6所述的特異性引物在檢測口蹄疫病毒中的應用。
9.一種用于檢測口蹄疫病毒的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒由特異性引物、RT反應緩沖液、AMV反轉錄酶、SYBRs Premix Ex Taq? I1、標準陽性質粒、無RNase的水組成； 所述標準陽性質粒包括陽性質粒 pEASY-T3-5’ UTR、pEASY-T3-0_VPl、pEASY-T3-A_VPl和 pEASY-T3-Al-VPl ；所述陽性 質粒pEASY-T3-5’UTR是由SEQ ID N0.9所示序列的第28-203位核苷酸的序列片段與PEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述陽性質粒PEASY-T3-0-VP1是由ID N0.10所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述陽性質粒PEASY-T3-A-VP1是由SEQ ID N0.11所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述陽性質粒PEASY-T3-A1-VP1是由SEQ ID N0.12所示的序列片段與pEASY_T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述特異性引物選自口蹄疫病毒檢測的通用引物對或/和O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對； 所述口蹄疫病毒檢測的通用引物對的序列如下: 引物 1-5，UTR-F:5’ -CGTTGCACTCCACACTTAC-3，；
引物 2-5’ UTR-R:5’ -GACCAAGTAGGCGGAAAG-3’ ； O型、A型、Asial型3種血清型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下: O型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 3-0-VP1F:5’ -GCAACTCAGGTCCAGAGGCGTC-3’ ；
引物 4-0-VP1R:5’ -CAGTGTGTGAGCAGGGATCTGCATC-3’ ； A型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 5-A-VP1F:5’ -AGACACAGGCTCAGCGACGTC-3’ ； 引物 6-A-VP1R:5，-GGCTGCACGCAAAAGGGCACCCACC-3，； Asial型口蹄疫病毒鑒別檢測引物對的序列如下:
引物 7-A1-VP1F:5’ -GAAACTCAGACAGCCAGGCGGC-3’ ；
引物 8-A1-VP1R:5’ -CGCAGACCGCAGCAGGCTCCAACC-3’。
10.權利要求9所述的試劑盒在檢測口蹄疫病毒中的應用。
【文檔編號】C12R1/93GK103981284SQ201410188272
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權日:2014年5月6日
【發(fā)明者】王洪梅, 何洪彬 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院奶牛研究中心