一種口服豬生長激素融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種口服豬生長激素融合蛋白及其應(yīng)用。所述口服豬生長激素融合蛋白由豬生長激素和Tat?PTD序列融合而成，所述Tat?PTD序列連接在豬生長激素的N端。本發(fā)明的口服豬生長激素融合蛋白能夠很好地克服胃腸道蛋白酶屏障和黏膜物理屏障進(jìn)入動物血液。利用該口服豬生長激素融合蛋白制備的飼料添加劑，能夠顯著改善斷奶仔豬和育肥豬的日增重量和料肉比指標(biāo)，提高生產(chǎn)率。
【專利說明】一種口服豬生長激素融合蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種口服豬生長激素融合蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個以食用豬肉為主的養(yǎng)豬大國，存欄數(shù)達(dá)5億頭，豬肉產(chǎn)量占世界的55%以上。由于消費(fèi)人群龐大，豬肉品質(zhì)安全至關(guān)重要。生豬“瘦肉精”的殘留已在我們造成多起中毒事件，因此尋找更為安全的生長調(diào)節(jié)劑具有重要意義。
[0003]豬生長激素(pig growth hormone,簡稱pGH)是由豬腦垂體合成并分泌的一種蛋白類激素，具有調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)生長的功能。PGH能夠提高豬生長速度15-20%，增加胴體瘦肉率10%，效益極其顯著(王索柱，養(yǎng)殖技術(shù)顧，2012-4:248)。最重要的是，pGH作為一種蛋白質(zhì)類激素，與曾被廣泛用作飼料添加劑的各種抗生素、類固醇類激素、人工合成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(如瘦肉精)不同 ，豬生長激素在促進(jìn)豬生長發(fā)育的同時，不會在動物體內(nèi)殘留，使豬肉產(chǎn)品更為安全，不會威脅人類的健康。
[0004]我國重組豬生長激素的研制，上個世紀(jì)90年代初已經(jīng)取得突破(余旭平等，生物工程學(xué)報，1991，7:307)，但迄今實(shí)際應(yīng)用的規(guī)模非常之小。其原因在于，重組豬生長激素，需要每日注射，不僅操作困難，成本費(fèi)用也相當(dāng)不菲。雖然有豬生長激素脂質(zhì)體的研究報導(dǎo)，但其長效緩釋效果沒有大幅度提高，仍難以實(shí)際應(yīng)用(方希修等，山東飼料，2005-3:30)。在此背景下，研制開發(fā)出可供口服吸收的豬生長激素，意義重大。
[0005]而蛋白口服吸收(穿腸吸收)存在障礙，包括胃腸道蛋白酶屏障和黏膜物理屏障。口服蛋白首先要抵御胃腸道蛋白酶的降解，然后透過小腸粘膜進(jìn)入血液，才能發(fā)揮作用。數(shù)十年來，為解決蛋白口服吸收的難題，有關(guān)專家傾注了大量精力，卻一直無法有效突破，極大地限制了蛋白類藥物的臨床應(yīng)用，也限制了一些功能蛋白直接作為飼料添加劑的應(yīng)用，如動物生長激素和抗菌肽等。
[0006]Tat PTD是一個存在于HIV Tat蛋白內(nèi)部、富含堿性氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域(YGRKKRRQRRR)，不僅具有廣譜的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，而且轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快、效率高、溫度適應(yīng)性廣；所引導(dǎo)的蛋白質(zhì)可以具有很大的分子量且不增加其免疫原性(Schwzrez SR., etal.，Science, 1999，285:1569)。目前對其作用機(jī)制尚不清楚，但不同于一般的經(jīng)受體、通道或內(nèi)吞作用的入胞方式(Foged, C.et al., Expert Opin.Drug Deliv.2008，5:105)。
[0007]由于蛋白口服吸收存在的障礙遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單純的跨膜(細(xì)胞膜)遞送，因此，TatPTD序列雖然具有非凡的跨膜遞送功能，但該序列能否帶領(lǐng)所引導(dǎo)的蛋白穿腸吸收，目前為止還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種口服豬生長激素融合蛋白，該融合蛋白能被口服吸收。
[0009]一種口服豬生長激素融合蛋白，由豬生長激素和Tat PTD序列融合而成，所述TatPTD序列連接在豬生長激素的N端。
[0010]本發(fā)明中，所述豬生長激素是pGH全長序列(GenBank號為:ACH99977.1)中第36-214位、共179個氨基酸長度的成熟肽段?？紤]到該成熟肽段的C末端具有半胱氨酸殘基(Cys)，是參與二級結(jié)構(gòu)形成的重要?dú)埢?，故而確定將Tat PTD序列置于pGH的N端；為實(shí)現(xiàn)在原核細(xì)胞和酵母細(xì)胞胞內(nèi)的表達(dá)，在Tat PTD之前再加上起始甲硫氨酸(Met)。最終設(shè)計的口服豬生長激素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，共191個氨基酸，分子量22kd，其中，第一位為Met，第2-12位為Tat PTD序列(YGRKKRRQRRR)，第13-191位為豬生長激素成熟肽段序列。
[0011]對比試驗(yàn)也證實(shí)，當(dāng)把Tat PTD序列置于pGH成熟肽段的C端時，融合蛋白的表達(dá)和提取復(fù)性效果均不理想。
[0012]本發(fā)明還提供了編碼所述口服豬生長激素融合蛋白的基因。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)所述口服豬生長激素融合蛋白在原核細(xì)胞和酵母細(xì)胞中的高效表達(dá)，依據(jù)SEQ ID N0.1所所示的氨基酸序列，進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，設(shè)計并合成了兩種編碼基因，其堿基序列分別如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，分別用于大腸桿菌和畢赤酵母的表達(dá)。[0014]本發(fā)明還提供了含有基因的重組工程菌。
[0015]相應(yīng)地，本發(fā)明提供了兩種重組工程菌，其中重組工程菌A的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，所導(dǎo)入的基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。重組工程菌B的宿主細(xì)胞為酵母菌，所導(dǎo)入的基因的堿基序列如SEQ ID N0.3所示。
[0016]本發(fā)明還提供了一種飼料添加劑的制備方法，包括:
[0017](I)將重組工程菌A活化后接種至大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵至0D_為3.0以上后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0018]將重組工程菌A活化后按2%比例接種至20L大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液(如M9培養(yǎng)液)中，37°C發(fā)酵至OD6c?為3.0以上后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，誘導(dǎo)表達(dá)開始的同時開始補(bǔ)料，4h內(nèi)補(bǔ)料4L。
[0019](2)收集菌體，破菌后離心收集包涵體，包涵體經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性純化后，獲得口服豬生長激素融合蛋白原液；
[0020]菌體被破碎后，脂體及部分破碎的細(xì)胞膜及膜蛋白仍與包涵體粘連在一起，因此在溶解包涵體(變性)之前先洗滌包涵體。
[0021]變性時可選用8M的尿素作變性劑，待包涵體被全部溶解后，加入19倍體積的20mMTris-HCl (pH8.0)稀釋復(fù)性，在pH8.0下經(jīng)“陰離子交換-陽離子交換”串聯(lián)層析，陽離子柱用2x PBS(pH7.5)洗脫，獲得口服豬生長激素融合蛋白原液。
[0022]本發(fā)明選擇的原核表達(dá)方式為包涵體表達(dá)，不僅因?yàn)榘w表達(dá)量高，還因?yàn)閜GH含兩對二硫鍵，結(jié)構(gòu)相對簡單，不會出現(xiàn)錯配，加之TatPTD序列呈強(qiáng)堿性，復(fù)性并不復(fù)雜，其后的純化和去細(xì)菌內(nèi)毒素簡單許多。其后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在合適的發(fā)酵條件下，口服豬生長激素融合蛋白的表達(dá)量可占全菌蛋白的30 %，復(fù)性純化后每升發(fā)酵液能獲得純度95%的重組蛋白I克以上，細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于10IU/mg。
[0023]并且，當(dāng)利用大腸桿菌表達(dá)的口服豬生長激素融合蛋白(PBS稀釋至lmg/ml)對SD大鼠進(jìn)行穿腸活性試驗(yàn)時，發(fā)現(xiàn)口服后0.5至4小時大鼠血清中都檢測到明顯的ELISA信號，且在兩個小時達(dá)到峰值濃度^9ng/mL)，表明本發(fā)明的口服豬生長激素融合蛋白能夠有效地被動物穿腸吸收。
[0024](3)向所述口服豬生長激素融合蛋白原液中加入玉米淀粉，混勻后常溫風(fēng)干，獲得所述飼料添加劑；
[0025]用PBS(pH7.5)將所述口服豬生長激素融合蛋白原液稀釋至0.12mg/mL,向每毫升原液稀釋液中加入Ig玉米淀粉，充分混勻，室溫下自然風(fēng)干后粉碎，過40目篩，即獲得飼料添加劑pGHTJ-Ι。每克飼料添加劑pGHTJ-Ι含口服豬生長激素融合蛋白0.1mgo
[0026]或者，包括:
[0027](I)將重組工程菌B經(jīng)活化后接種至酵母發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵后收集菌體；
[0028]所述酵母為畢赤酵母GSl 15，所述酵母發(fā)酵培養(yǎng)液可選用YPD培養(yǎng)基，發(fā)酵條件優(yōu)選為28°C下發(fā)酵120h。
[0029](2)將菌體常溫風(fēng)干，和玉米淀粉混勻后獲得所述飼料添加劑。
[0030]先將菌體常溫風(fēng)干至水分含量少于20%，然后將發(fā)酵菌體與玉米淀粉以1:500的重量比混合，即獲得飼料添加劑pGHTJ-2。
[0031]經(jīng)SDS-PAGE檢測，口服豬生長激素融合蛋白的表達(dá)量占總蛋白含量的16%，而酵母菌中總蛋白含量可占其干物質(zhì)總量的40%左右，大致估算每克風(fēng)干菌體約含50mg所述口服豬生長激素融合蛋白，即每克飼料添加劑(PGHTJ-2)中約含0.1mg所述口服豬生長激素融合蛋白。
[0032]本發(fā)明還提供了所述制備方法制得的飼料添加劑以及所述飼料添加劑在制備豬飼料中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括:在豬基礎(chǔ)日糧中添加I~8%的飼料添加劑，獲得所述豬飼料。
[0033]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加量為1-8%的飼料添加劑pGHTJ-Ι均能顯著提高斷奶仔豬的生產(chǎn)率，其中，2%的添加量能夠使斷奶仔豬的日增重提高27.3%，料肉比降低13.0%;繼續(xù)增加添加量沒有取得更好的促生長效果，故而飼料添加劑的添加量優(yōu)選為2%。
[0034]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加量為2%的飼料添加劑pGHTJ-Ι和pGHTJ-2均能顯著改善育肥豬的日增重和料肉比，日增重分別增加33.3%和43.6%，均達(dá)極顯著水平；料肉比分別下降
7.6%和8.3%，差異顯著。
[0035]飼料添加劑pGHTJ-2的改善效果更為明顯，這可能是因?yàn)榻湍妇w經(jīng)過腸胃道破碎降解后才釋放出其中的口服豬生長激素融合蛋白，使得更多的口服豬生長激素融合蛋白能夠到達(dá)小腸，繼而被穿腸吸收。
[0036]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0037]本發(fā)明在豬生長激素成熟肽段的N端連接Tat PTD序列，獲得的口服豬生長激素融合蛋白能夠很好地克服胃腸道蛋白酶屏障和黏膜物理屏障進(jìn)入動物血液。利用該口服豬生長激素融合蛋白作為飼料添加劑，能夠顯著改善斷奶仔豬和育肥豬的日增重量和料肉比指標(biāo)，提聞生廣率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為口服豬生長激素融合蛋白在大腸桿菌(E.coli BL21/pET22b-Tat PTD-pGH)中的表達(dá)和純化結(jié)果圖；其中，I表示E.coli BL21/pET22b-Tat PTD-pGH誘導(dǎo)前，2表示E.coli BL21/pET22b-Tat PTD-pGH誘導(dǎo)后，3表示Tat PTD-pGH純化后樣品，4表示分子量標(biāo)記(自上至下分別為 250、130、100、70、55、40、35、25、15kd)；
[0039]圖2A為大鼠口服豬生長激素融合蛋白后血清中融合蛋白含量的ELISA測定結(jié)果；其中，I和2為標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)(自上而下濃度依次為125，62.5，31.25，16.1, 7.9，3.9，2，Ing/ml) ;3和4為樣品和對照重復(fù)(自上而下依次為空白對照，陰性對照，Ohr血清，Ihr血清，2小時血清，4小時血清，陰性對照，空白對照；血清樣品為PBS十倍稀釋)；
[0040]圖2B為大鼠口服豬生長激素融合蛋白后血清中融合蛋白含量的ELISA測定標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0041]圖2C為大鼠口服豬生長激素融合蛋白后血清中融合蛋白的濃度；
[0042]圖3為口服豬生長激素融合蛋白在畢赤酵母(Pichia pastoris GS115/pGAP_TatPTD-pGH)中的表達(dá):其中，I表示分子量標(biāo)記(自上至下分別為250、130、100、70、55、40、35、25、15kd) ;2 表不 Pichia pastoris GS115 ;3 表不 Pichia pastoris GS115/pGAP_TatPTD-pGH 搖瓶表達(dá)；4 表示 Pichia pastoris GS115/pGAP_Tat PTD-pGH 發(fā)酵罐中表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合附圖和 【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0044]下述實(shí)施例中，所采用的分子生物學(xué)技術(shù)，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，為業(yè)內(nèi)人士所公知，或可參見薩姆布魯克拉塞爾所著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(黃培堂譯，科學(xué)出版社，2002 年)。
[0045]實(shí)施例1利用大腸桿菌制備口服豬生長激素融合蛋白
[0046]根據(jù)Tat PTD序列及豬生長激素成熟肽氨基酸序列，設(shè)計口服豬生長激素融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID N0.1)。根據(jù)SEQ ID N0.1序列并考慮大腸桿菌的密碼子偏好性設(shè)計堿基序列SEQ ID N0.2。在SEQ ID N0.2前后分別設(shè)計NdeI與EcoRI酶切位點(diǎn)，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因合成。
[0047]合成的全基因序列經(jīng)NdeI與EcoRI酶切并回收酶切片段，與同樣酶切并回收的pET22b質(zhì)粒載體片段連接。連接產(chǎn)物通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定。
[0048]將測序正確的表達(dá)質(zhì)粒pET22b-Tat_pGH通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得表達(dá)菌株E.coliBL21/pET22b-Tat-pGH。
[0049]將表達(dá)菌株E.coli BL21/pET22b-Tat_pGH接種至含100μ g/mL氨芐青霉素的400ml LB培養(yǎng)基，于37°C、200rpm搖床過夜培養(yǎng)。次日按2%比例轉(zhuǎn)接至20L含100 μ g/mL氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，維持37°C、pH7.0、溶氧(DO) 40%培養(yǎng)至0D_達(dá)3.0，加入異丙基_β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.5mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4h，誘導(dǎo)開始的同時開始補(bǔ)料，4小時內(nèi)補(bǔ)料4L。
[0050]發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體并稱重，使用高壓均質(zhì)機(jī)充分破菌(聚能生物JN-3000PLUS, 30C，140Mpa)，離心收集包涵體。
[0051 ] 包涵體使用8M尿素溶解(20mL/g包涵體)，離心去除不溶物后緩慢加入19倍體積的20mM Tris-Cl (pH8.0)。復(fù)性溶液在pH8.0條件下經(jīng)“陰離子交換-陽離子交換”串聯(lián)層析，陽離子柱用2XPBS洗脫，得口服豬生長激素融合蛋白原液(圖1)，濃度在10mg/ml以上，純95%，內(nèi)毒素低于10EU/mg。
[0052]實(shí)施例2 口服豬生長激素融合蛋白口服穿腸活性試驗(yàn)
[0053]實(shí)驗(yàn)動物為SD大鼠(購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，雄性，3只，體重200克左右。試驗(yàn)開始前，動物禁食不禁水12小時。取實(shí)施例1所制備的口服豬生長激素融合蛋白原液，PBS稀釋至lmg/ml，每只動物灌胃給予Img豬生長激素融合蛋白。分別于試驗(yàn)開始前(O小時)和灌胃后0.5、1、2、3、4小時眼眶取血500微升，冰浴靜止I小時，4000rpm離心分離血清，凍存于負(fù)70°C下。
[0054]按Cusabio kit (CSB_E06813p)說明書操作，測定大鼠血清中口服豬生長激素融合蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A、圖2B、圖2C所示?？梢奡D大鼠口服豬生長激素融合蛋白后0.5小時血液中開始出現(xiàn)陽性信號，至2小時達(dá)到峰值濃度(69ng/mL)，4小時已經(jīng)開始下降。由于沒有做出最夠的時間點(diǎn)，不能夠用峰下面積擬合計算總吸收量。
[0055]實(shí)施例3利用畢赤酵母制備口服豬生長激素融合蛋白
[0056]根據(jù)SEQ ID N0.1的氨基酸序列和畢赤酵母密碼子偏好性設(shè)計了 SEQ ID N0.3所示的堿基序列，在SEQ ID N0.3序列前后分別添加EcoRI與XhoI酶切位點(diǎn)，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因合成。
[0057]合成的全基 因序列經(jīng)EcoRI與XhoI酶切并回收酶切片段，與同樣酶切并回收的pGAPZ質(zhì)粒載體片段連接。連接產(chǎn)物通過氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并測序鑒定。大量提取測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒pGAPZ-Tat-pGH，經(jīng)BspHI線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，篩選獲得高表達(dá)菌株 P.pGS115/pGAPZ-Tat-pGH。
[0058]將P.pGS115/pPIC3.5K_Tat-pGH活化后接種在含24升YPD培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，于28°C發(fā)酵120小時，收獲菌體并常溫風(fēng)干至水分含量20%以下。
[0059]經(jīng)SDS-PAGE檢測，酵母菌中總蛋白含量可占其干物質(zhì)總量的40%左右，口服豬生長激素融合蛋白的表達(dá)量為總蛋白含量的16%，大致估算每克干菌體約含口服豬生長激素融合蛋白50mg。
[0060]實(shí)施例4利用口服豬生長激素融合蛋白制備飼料添加劑
[0061](I)用大腸桿菌表達(dá)的口服豬生長激素融合蛋白制備飼料添加劑
[0062]取實(shí)施例1制備的口服豬生長激素融合蛋白原液，用PBS稀釋至0.12mg/ml，每毫升原液稀釋液中加入I克玉米淀粉(食品級，河南金潤食品添加劑有限公司)，充分混勻，室溫下自然風(fēng)干后粉碎，過40目篩，密封包裝后低溫(2-8°C)干燥處存放，可直接作為飼料添加劑使用，編號標(biāo)注為pGHTJ-Ι。
[0063]所制備的pGHTJ-1，干燥失重法測定其水分含量為15%以下，每克pGHTJ-Ι中約含口服豬生長激素融合蛋白0.1mg0
[0064]所制備的pGHTJ-1，2-8 V干燥處存放，分別在存放后1、3、6、12個月時，隨即從3個包裝中取樣進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn):干燥失重法測定水分含量，Bradford法檢測其蛋白含量(碧云天公司試劑盒)，SDS-PAGE法檢測其純度，結(jié)果如表1所示。
[0065]表1pGHTJ-1 穩(wěn)定性試驗(yàn)(χ士sd，n=3 )
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種口服豬生長激素融合蛋白，其特征在于，由豬生長激素和TatPTD序列融合而成，所述Tat PTD序列連接在豬生長激素的N端。
2.如權(quán)利要求1所述的口服豬生長激素融合蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDN0.1所示。
3.編碼如權(quán)利要求1~2任一所述口服豬生長激素融合蛋白的基因。
4.含有如權(quán)利要求3所述基因的重組工程菌。
5.權(quán)利要求4述的重組工程菌，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌，所述基因的堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
6.權(quán)利要求4述的重組工程菌，其特征在于，宿主細(xì)胞為酵母菌，所述基因的堿基序列如 SEQ ID N0.3 所示。
7.—種飼料添加劑的制備方法，其特征在于，包括: (1)將如權(quán)利要求5所述的重組工程菌活化后接種至大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵至OD600為3.0以上后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； (2)收集菌體，破菌后離心收集包涵體,包涵體經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性純化后,獲得口服豬生長激素融合蛋白原液； (3)向所述口服豬生長激素融合蛋白原液中加入玉米淀粉，混勻后常溫風(fēng)干，獲得所述飼料添加劑； 或者，包括: (1)將如權(quán)利要求6所述的重組工程菌經(jīng)活化后接種至酵母發(fā)酵培養(yǎng)液中，發(fā)酵后收集菌體； (2)將所述菌體常溫風(fēng)干，和玉米淀粉混勻后獲得所述飼料添加劑。
8.如權(quán)利要求7所述制備方法制得的飼料添加劑。
9.如權(quán)利要求8所述飼料添加劑在制備豬飼料中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，在豬基礎(chǔ)日糧中添加I~8%的飼料添加劑，獲得所述豬飼料。
【文檔編號】C12N15/62GK103936864SQ201410188634
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】路遙, 桂向東, 李曉祥 申請人:安徽新星生物工程有限公司