Dna條形碼鑒別溪黃草及其近屬的方法【專利摘要】本發(fā)明提供一種包括唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜的IST2基因序列片段的基因庫(kù)。本發(fā)明還提供一種鑒別唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜植物物種的方法，所述方法包括將待鑒別植物物種的植物樣品的IST2基因或其序列片段與本發(fā)明的基因庫(kù)進(jìn)行比較的步驟。本發(fā)明還提供IST2基因或其序列片段在鑒別唇形科植物線紋香茶菜和唇形科植物溪黃草中的用途。本發(fā)明證明了IST2序列具有通用、易擴(kuò)增、易比對(duì)的特點(diǎn)，并且在唇形科植物線紋香茶菜與唇形科植物溪黃草中，具有良好的擴(kuò)增性和鑒別效果。【專利說明】DNA條形碼鑒別溪黃草及其近屬的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于植物物種鑒定領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜的物種鑒別方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]中藥溪黃草是廣東福建一帶居民傳統(tǒng)用藥，其利濕退黃，用于肝炎、急慢性膽囊炎、痢疾等疾病的治療，并作為涼茶日常保健食用。[0003]在中藥界，部分中藥材的名字與其基原，即植物分類學(xué)名字不一致。中藥溪黃草就存在著這種狀況，民間傳統(tǒng)使用的中藥溪黃草是唇形科植物線紋香茶菜[拉丁名為Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Hara或Isodonstriatus(Benth.)Kudo]及其變種纖花香茶菜[拉丁名為Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)H.Haravar.graciliflora(Benth.)Η·Hara或lsodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)Η·Haravar.gracilifIora(Benth.)H.Hara];同時(shí)，由于沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，在藥材市場(chǎng)上有唇形科植物溪黃草[拉丁名為lsodonserra(Maxim.)Kudo或Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara]混同使用；另外，相關(guān)學(xué)術(shù)專著及地方標(biāo)準(zhǔn)專著中收錄的溪黃草的基原不一致，關(guān)于基原的確定及品種的鑒別都有矛盾之處：《常用中草藥手冊(cè)》、《廣東中獸醫(yī)常用草藥》、《全國(guó)中草藥匯編》（上冊(cè)）、《中藥大辭典》及廣東、廣西、湖南等地方的中藥材標(biāo)準(zhǔn)，均記載為溪黃草的基原是線紋香茶菜lsodonlophanthoides(Buch.-Ham.exD.Don)Hara)，其中《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)同時(shí)將植物溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara作為基原之一收錄進(jìn)去，但是在植物鑒別中，溪黃草Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara的一些生藥特征不符合標(biāo)準(zhǔn)。（本專利申請(qǐng)下文中所述"溪黃草"均指的是唇形科植物溪黃草[拉丁名為Isodonserra(Maxim.)Kudo或Rabdosiaserra(Maxim.)H.Hara]，而不是中藥溪黃草）[0004]植物溪黃草與線紋香茶菜為雙子葉植物唇形科下的兩個(gè)種，新鮮的植株上兩者的莖、葉等形態(tài)外觀上差異大，但經(jīng)干燥或切段后兩者不易分辨。在市場(chǎng)流通的中藥材通常為干品。有效的鑒別方法既能區(qū)別植物溪黃草與線紋香茶菜，又能在基原的確立研究中提供部分技術(shù)手段。[0005]目前針對(duì)這兩種植物及飲片的鑒別方法有性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等方法。這些現(xiàn)有技術(shù)對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)依賴度高，而傳統(tǒng)鑒定方法的理論基礎(chǔ)建立于分類群的性狀特征分析，這些性狀特征是與環(huán)境緊密相關(guān)的表現(xiàn)型，在鑒別時(shí)易受環(huán)境因素影響及樣品形態(tài)和材料部位的限制，出現(xiàn)誤差。[0006]中藥的品種真?zhèn)舞b別直接關(guān)系到用藥安全及臨床療效。因此，目前迫切需要提供能夠準(zhǔn)確鑒定溪黃草植物物種、從而能夠幫助準(zhǔn)確用藥的新方法。[0007]分子生物學(xué)鑒定是目前應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)來鑒定中藥原植物及其藥材和飲片的新方法。簡(jiǎn)而言之，從分子遺傳角度來看，物種的表現(xiàn)型歸根結(jié)底應(yīng)追溯到基因型的差異，即在DNA序列上的差異。因此，對(duì)基因組序列差異的比較研究為植物分類和鑒定提供了最本質(zhì)的依據(jù)。[0008]近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于藥用植物遺傳多樣性、系統(tǒng)學(xué)、分類學(xué)研究，并逐漸滲透到中草藥的鑒定領(lǐng)域，推動(dòng)了中草藥鑒定研究的發(fā)展。DNA分子作為遺傳信息的載體，信息含量大，在同種內(nèi)具有高度的遺傳穩(wěn)定性，且不受外界環(huán)境因素和生物發(fā)育階段及器官組織差異的影響，因此用DNA分子特征作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行中草藥鑒別具有更為準(zhǔn)確可靠，非常適用于近緣種、易混淆品種、珍稀品種等的植物鑒定。[0009]目前，用于中草藥鑒定的分子標(biāo)記技術(shù)主要有"限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性"(RFLP)技術(shù)、"隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA"（RAPD)技術(shù)、"微衛(wèi)星"（SSR)技術(shù)、ISSR標(biāo)記技術(shù)、"擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性"（AFLP)技術(shù)等等，及DNA條形碼技術(shù)（DNAbarcoding)。其中，DNA條形碼鑒定是分子鑒定的最新進(jìn)展，其定義為利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定分子診斷新技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)在于，只需一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)合適的基因片段即可對(duì)整個(gè)屬、科的絕大部分物種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別；鑒別速度更快；重復(fù)性和穩(wěn)定性高；實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)單化、標(biāo)準(zhǔn)化，更易實(shí)現(xiàn)物種鑒別的自動(dòng)化。DNA條形碼鑒定技術(shù)是傳統(tǒng)鑒別方法的有效補(bǔ)充，能夠?qū)崿F(xiàn)中藥基原鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化，有助于緩解傳統(tǒng)鑒定人才缺乏的現(xiàn)狀。[0010]在利用DNA條形碼技術(shù)鑒定植物時(shí)，DNA條形碼的篩選及確定是重要一環(huán)。通常，DNA條形碼篩選有以下標(biāo)準(zhǔn)：（1)標(biāo)準(zhǔn)的短片段；（2)要有足夠的變異可將物種分開來，種間差異比較大，便于進(jìn)行種與種的區(qū)分，種內(nèi)序列變異盡量小，從而使種間和種內(nèi)變異有一個(gè)明晰的界定；（3)序列兩段相對(duì)保守，以方便引物的設(shè)計(jì)。[0011]因?yàn)槿狈νㄓ靡锸蛊涑晒U(kuò)增，植物核基因組的大多數(shù)單拷貝基因和它們的內(nèi)含子首先被排除作為條形碼的候選者。另有研究者提出，核DNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄空間ITS和ITS2則可能成為潛在的DNA條形碼序列。并且，葉綠體基因組的基因及其內(nèi)含子的研究發(fā)現(xiàn)，psbA-trnH的非編碼區(qū)和ITS可能作為潛在的DNA條形碼序列用于鑒定多樣性的被子植物物種。還有人提出，matK基因可以作為通用條形碼鑒定有花植物，而matK和psbA-trnH兩者都適用于肉豆蘧科植物。因此，迄今為止，對(duì)于適用于植物鑒定的DNA條形碼，目前已先后提出了matK、psbA-trnH、rbcL、rpoCl、rpoB、matK、ITS2等序列，但是沒有一個(gè)條形碼能在所有植物科屬種內(nèi)適用。[0012]已有一些研究者嘗試將DNA分子生物學(xué)鑒定方法用于鑒定溪黃草，如利用RAro技術(shù)來進(jìn)行鑒定。RAro技術(shù)是第二代分子標(biāo)記技術(shù)，沒有DNA條形碼技術(shù)穩(wěn)定。并且，雖然研究者不斷地完善DNA條形碼技術(shù)在植物物種鑒定中的應(yīng)用，但是由于目前還有報(bào)道任何一條DNA條形碼可以適用所有植物的鑒別，因此對(duì)具體的植物物種，仍需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來尋找到合適的基因序列作為DNA條形碼使用。[0013]基于上述情況，目前如要利用DNA條形碼技術(shù)來對(duì)唇形科植物線紋香茶菜與唇形科植物溪黃草進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，需要對(duì)可能使用的DNA條形碼進(jìn)行篩選，找到最適合的基因序列作為DNA條形碼?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供最適合鑒別溪黃草和線紋香茶菜的DNA條形碼，即特定的DNA序列。[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，通過采集已確定物種的溪黃草、線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）原產(chǎn)地的多份樣品，建立溪黃草、線紋香茶菜的DNA條形碼基因庫(kù)。[0016]本發(fā)明的又一個(gè)目的是，通過將新的待檢樣品與該DNA條形碼基因庫(kù)的基因片段進(jìn)行比對(duì)，建立該未知樣品的鑒別方法。[0017]本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供該DNA條形碼或基因庫(kù)在溪黃草和線紋香茶菜中的用途。[0018]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：[0019]一方面，本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，就溪黃草、線紋香茶菜和纖花香茶菜的DNA條形碼基因的篩選，從ITS2、matK、pSbA-trnH3個(gè)序列中篩選出最適合溪黃草、線紋香茶菜鑒別的DNA條形碼，即ITS2基因或ITS2基因的序列片段。[0020]ITS2為高等植物的核糖體DNA的組成部分，為第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。目前，核基因組序列在藥用植物鑒定和品質(zhì)研究中的應(yīng)用主要集中在編碼核糖體RNA基因（nrDNA)重復(fù)區(qū)內(nèi)。高等植物細(xì)胞核中nrDNA是一些高度重復(fù)的串聯(lián)序列組成的多基因家族，每個(gè)重復(fù)單位從5'端開始，包括外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ETS)、18S基因、第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITSl)、58S基因、第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2)和26S基因，重復(fù)單位之間為基因間隔區(qū)（IGS)或稱為非編碼區(qū)(NTS)。nrDNA的編碼區(qū)序列（18S、58S和26S基因）為高度保守區(qū)，序列差異主要表現(xiàn)在非編碼區(qū)序列上，而ITS區(qū)是中度保守區(qū)，序列的變異度處于兩者之間。nrDNA高度保守的編碼區(qū)序列主要用于種、屬以上分類層次的研究中，非編碼區(qū)序列（ETS、IGS/NTS)和中度保守的重復(fù)序列則比較適合于近緣類群和居群間關(guān)系的研究。[0021]本發(fā)明人經(jīng)過篩選研究發(fā)現(xiàn)，相比于其它基因諸如matK、psbA-trnH，ITS2序列具有通用、易擴(kuò)增、易比對(duì)的特點(diǎn)。并且，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在唇形科植物線紋香茶菜和唇形科植物溪黃草中，ITS2基因有良好的擴(kuò)增性和鑒別效果，可以作為DNA條形碼而用于鑒別上述植物物種。[0022]因此，本發(fā)明在此方面提供ITS2基因或其序列片段在鑒別唇形科植物線紋香茶菜和唇形科植物溪黃草中的用途。其中，所述ITS2基因序列片段優(yōu)選通過采用下述序列作為引物從待鑒別植物樣品的基因組DNA中擴(kuò)增得到：SEQIDNO.37和SEQIDNO.38。[0023]另一方面，本發(fā)明提供了包括溪黃草和線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）的ITS2基因序列片段的基因庫(kù)。具體而言，首先采集溪黃草、線紋香茶菜原產(chǎn)地的多份樣品，以植物傳統(tǒng)分類學(xué)方法鑒別各自的物種，然后分別提取其基因組DNA，以其基因組DNA為模板，采用特定引物序列、優(yōu)選SEQIDNO.37和SEQIDNO.38擴(kuò)增樣品的ITS2基因序列片段，由此建立包括溪黃草和線紋香茶菜的ITS2基因序列片段的基因庫(kù)。所述基因庫(kù)包括下述序列編號(hào)所示的ITS2基因序列片段：SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。其中，SEQIDNO.1-8為以植物傳統(tǒng)分類學(xué)方法鑒定為溪黃草樣品各自的ITS2基因序列片段；SEQIDNO.9-10為以植物傳統(tǒng)分類學(xué)方法鑒定為線紋香茶菜樣品各自的ITS2基因序列片段；SEQIDNO.11-36為以植物傳統(tǒng)分類學(xué)方法鑒定為線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）樣品各自的ITS2基因序列片段。[0024]又一方面，本發(fā)明提供了溪黃草和線紋香茶菜植物物種的鑒別方法，所述方法包括下述步驟：[0025]1)提取待鑒別植物的基因組DNA;[0026]2)以步驟1)得到的基因組DNA為模板，擴(kuò)增ITS2基因或其序列片段；[0027]3)將步驟2)得到的ITS2基因或其序列片段與本發(fā)明提供的基因庫(kù)進(jìn)行比較，從而鑒別所述待鑒別植物的物種。[0028]在本發(fā)明提供的鑒別方法中，步驟1)中可以采用任何植物基因組DNA提取方法或商業(yè)提取試劑盒進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，取待鑒別植物的樣品例如葉片，使用75%乙醇水溶液擦洗表面后晾干，稱取5mg-2g，經(jīng)液氮研磨后，用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。[0029]步驟2)中可以采用任何可擴(kuò)增ITS2基因或其序列片段的條件進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，在擴(kuò)增待鑒別植物樣品的ITS2基因序列片段時(shí)，其引物及擴(kuò)增條件如下所示：[0030]引物--[0031]SEQIDNO.37(正向）：ATGCGATACTTGGTGTGAAT[0032]SEQIDNO.38(反向）：GACGCTTCTCCAGACTACAAT[0033]反應(yīng)體系-[0034]ExTaqMix25y1,上、下游引物各L0μI,DNA模版3·0μ1,加滅菌蒸饋水至50μ1[0035]反應(yīng)程序--[0036]95°C，5min;94°C-30s，56°C_lmin，72°C-45s，40次循環(huán)；72°C-IOmin檢測(cè)、測(cè)序和結(jié)果處理--[0037]采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。電泳后，PCR產(chǎn)物應(yīng)在相應(yīng)的DNA條形碼序列長(zhǎng)度位置出現(xiàn)一條目的條帶，陰性對(duì)照應(yīng)無條帶。將有PCR擴(kuò)增條帶的樣品送測(cè)序公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，使用DNA測(cè)序儀對(duì)目的條帶進(jìn)行雙向測(cè)序，PCR擴(kuò)增引物作為測(cè)序引物。測(cè)序結(jié)果采用序列拼接軟件CodonCodeAlignerV2.06(CodonCodeCo,USA)校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。[0038]在步驟3)中，在將步驟2)得到的ITS2基因或其序列片段與本發(fā)明提供的基因庫(kù)進(jìn)行比較時(shí)，相似度最高或匹配度最高或遺傳距離最小的對(duì)應(yīng)物種即為待鑒別植物的物種?？梢酝ㄟ^將待鑒別植物的序列與基因庫(kù)內(nèi)已有的序列之間的進(jìn)行比對(duì)，獲得多個(gè)序列間的相似性，得出其物種類別。BLAST分析、距離法、建樹法都是基于序列比對(duì)鑒別物種的方法。[0039]根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，將待鑒別樣品的ITS2基因序列片段與此基因庫(kù)的所有ITS2基因片段進(jìn)行比對(duì)，獲得待鑒別植物的序列與基因庫(kù)內(nèi)已有的多個(gè)序列之間的多個(gè)最小變異值，再跟已計(jì)算出的溪黃草和線紋香茶菜的種內(nèi)最大變異值比較，進(jìn)行結(jié)果判定。如：根據(jù)實(shí)施例1所述，溪黃草ITS2基因和線紋香茶菜ITS2基因的種內(nèi)最大變異值分別為"4.8"和"1.4"，采用序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)軟件，如MatGat2.01、MEGA5、VectorNTISuite組件AlignX等，對(duì)待鑒別植物的序列與基因庫(kù)內(nèi)的線紋香茶菜的多個(gè)序列之間逐個(gè)兩兩比對(duì)，得到多個(gè)序列間最小變異值，這些值等于或低于1.4,則對(duì)應(yīng)物種為線紋香茶菜；同樣采用計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算待鑒別植物的序列與基因庫(kù)內(nèi)的溪黃草的多個(gè)序列之間的遺傳距離，得到多個(gè)序列間最小變異值，這些值等于或低于4.8,則對(duì)應(yīng)物種為溪黃草。[0040]具體而言，首先，將從待鑒別樣品獲得的ITS2基因序列片段峰圖文件導(dǎo)入CodonCodeAlignerV3.7進(jìn)行拼接，然后人工檢查拼接效果，包括（1)調(diào)整序列正反向(edit一reversecomplement)，（2)去除引物或其他邊界序列（sample-trimvector…），(3)查看剩余堿基質(zhì)量值（qual需要大于等于20)，最后導(dǎo)出一致序列為標(biāo)準(zhǔn)條形碼數(shù)據(jù)。然后，將此標(biāo)準(zhǔn)條形碼數(shù)據(jù)與ITS2基因序列片段的基因庫(kù)的數(shù)據(jù)一起導(dǎo)入序列比對(duì)軟件(MatGat2.01)，選擇默認(rèn)計(jì)分矩陣（ScoringMatrix:blosum50)進(jìn)行多重比對(duì)（align)，保存計(jì)算結(jié)果（Similaritytable)，數(shù)值保留小數(shù)點(diǎn)后一位，根據(jù)后續(xù)軟件TaxonGap所需格式調(diào)整（兩個(gè)txt文件，一個(gè)是物種名稱目錄，一個(gè)為物種DNA序列比對(duì)結(jié)果，即相似性矩陣）。接下來，利用軟件TaxonGap2.4.1查看鑒別結(jié)果。在軟件主界面導(dǎo)入物種名稱目錄（Files-DataFiles一Load)，在Biomarker選項(xiàng)下導(dǎo)入物種DNA序列比對(duì)結(jié)果(Biomarker一Add一Load一Save)，其他次要參數(shù)可參考軟件說明書進(jìn)行設(shè)置。運(yùn)行軟件后(Run-Execute)獲得結(jié)果，在txt文件的適宜圖中，查看待檢樣品序列與溪黃草、線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）各個(gè)樣品序列分別對(duì)應(yīng)的"種間最小變異值"（假設(shè)待鑒別樣品是一個(gè)新物種），若待檢樣品序列與溪黃草各樣品的序列片段之間的最小變異值（即"種間最小變異值"）等于或小于4.8,即可判定該待檢物種為溪黃草；若待檢樣品與線紋香茶菜各樣品的序列片段之間的最小變異值（即"種間最小變異值"）為1.4,即可判定該待檢物種為線紋香茶菜。[0041]也可以采用諸如下述其它方法，這幾種方法也是通過序列比對(duì)、比較匹配度或比較相似性等，確認(rèn)物種之間的歸屬：[0042]BLAST分析-[0043]來源于未知樣品的DNA條形碼序列（querysequence)與DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)（referencelibrary)進(jìn)行比對(duì)，如果在DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中找到完全一樣的序列(referencesequence),那么未知樣品就是該referencesequence對(duì)應(yīng)的物種；反之未知樣品在數(shù)據(jù)庫(kù)中不存在?？衫孟旅娴姆椒ㄟM(jìn)一步鑒定，在這種情況下，需要重點(diǎn)關(guān)注與未知樣品DNA條形碼序列最相關(guān)10個(gè)序列的物種，或者比對(duì)中出現(xiàn)頻率最商的物種，可以將未知樣品確定為某一科屬。同時(shí)該方法也可直接與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以保證利用全球最新的核苷酸數(shù)據(jù)指導(dǎo)鑒定。[0044]距離法--[0045]計(jì)算未知樣品DNA條形碼序列（querysequence)與數(shù)據(jù)庫(kù)中每一個(gè)序列(referencesequence)的遺傳距離，未知樣品應(yīng)為具有最小平均遺傳距離（meandistance)的物種或者具有最小遺傳距離（nearestdistance)的物種。遺傳距離的閾值（threshold)是在"構(gòu)建藥用植物DNA條形碼鑒定平臺(tái)"過程中確定的，理論上對(duì)同一個(gè)物種，取樣涵蓋了其全部的地理分布（不同居群）和同一居群中的足夠個(gè)體，該閾值可以準(zhǔn)確反映該物種的遺傳變異大小，也有利于更好地確定未知樣品的物種，但考慮到研究成本，一般認(rèn)為同一物種取樣最好包括5個(gè)居群，每個(gè)居群2個(gè)個(gè)體。[0046]建樹法-[0047]先應(yīng)用CLUSTAL進(jìn)行MSA，選用合適的遺傳距離模型（一般用K2P距離模型）計(jì)算種內(nèi)和種間的遺傳距離，應(yīng)用MEGA或PAUP等軟件構(gòu)建NJ、UPGMA、MP等系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗(yàn)未知樣品的DNA條形碼序列（querysequence)與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列（referencesequence)聚類在一起的物種，根據(jù)聚類情況進(jìn)一步確定物種。[0048]成對(duì)序列比對(duì)法--[0049]通過以上方法仍不能將未知樣品鑒別到種時(shí)，可以將未知樣品與密切相關(guān)的10個(gè)物種的referencesequence進(jìn)行成對(duì)比對(duì)，通過分析堿基變異位點(diǎn)來鑒別物種，或判斷為新種，或判斷為referencelibrary中尚未收錄的物種。[0050]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明作出了以下貢獻(xiàn)和有益效果：[0051]首先，本發(fā)明對(duì)溪黃草、線紋香茶菜和纖花香茶菜的基因條形碼進(jìn)行篩選，從ITS2、matK、psbA-trnH3個(gè)基因序列中篩選出最適合鑒別溪黃草和線紋香茶菜的DNA條形碼，即ITS2基因或其序列片段。相比于其他基因，ITS2序列具有通用、易擴(kuò)增、易比對(duì)的特點(diǎn)。并且，本研究發(fā)現(xiàn)，在唇形科植物線紋香茶菜與唇形科植物溪黃草中，ITS2具有良好的擴(kuò)增性和鑒別效果。[0052]第二，本發(fā)明經(jīng)過采集溪黃草、線紋香茶菜和線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）原產(chǎn)地的多份樣品，得到了包括ITS2基因片段的基因庫(kù)，從而建立了溪黃草和線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）的標(biāo)準(zhǔn)ITS2序列基因庫(kù)。[0053]第三，基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還建立了新樣品的鑒別方法，包括將新的待鑒別樣品與此基因庫(kù)的基因片段進(jìn)行比對(duì)，判斷新樣品的物種。特別是通過計(jì)算種內(nèi)種間變異值；對(duì)于基因庫(kù)內(nèi)的溪黃草和線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）序列，已經(jīng)計(jì)算出溪黃草和線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）各自的種內(nèi)最大變異值和兩個(gè)物種間的種間最小變異值，當(dāng)新的待鑒別樣品與此基因庫(kù)的基因片段進(jìn)行比對(duì)后，得到多個(gè)序列間最小變異值(即"種間最小變異值"），這些值等于或小于已計(jì)算出的某物種的種內(nèi)最大變異值，可視為與其同一物種。此鑒別方法可以鑒別溪黃草和線紋香茶菜的全草、器官及飲片。相比于溪黃草和線紋香茶菜的現(xiàn)有鑒別方法，本發(fā)明的方法具有對(duì)于樣品的完整程度要求低，鑒別指標(biāo)可以量化的優(yōu)點(diǎn)?！緦＠綀D】【附圖說明】[0054]以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：[0055]圖1顯示了本發(fā)明提供的DNA條形碼鑒定方法效果圖，其以植物物種為類別，采用TaxonGap法。其中種間最小變異值顯示為深色條；種內(nèi)最大變異值顯示為淺色條，Rs代表物種溪黃草，Rlvg代表物種纖花香茶菜，Rl代表物種線紋香茶菜?！揪唧w實(shí)施方式】[0056]以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。[0057]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。[0058]實(shí)施例IDNA條形碼的篩選和包括IST2基因序列片段的基因庫(kù)的建立[0059]本實(shí)施例就溪黃草、線紋香茶菜和線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）的DNA條形碼基因的篩選，從ITS2、matK、psbA-trnH3個(gè)序列中篩選出最適合溪黃草和線紋香茶菜鑒別的DNA條形碼，即IST2基因序列片段。此外，本實(shí)施例建立了包括溪黃草和線紋香茶菜（包括變種纖花香茶菜）的IST2基因序列片段的基因庫(kù)。[0060]1儀器、材料與試藥[0061]1.1材料[0062]在7個(gè)采樣點(diǎn)（廣東，福建），收集了溪黃草、線紋香茶菜和線紋香茶菜（變種纖花香茶菜）共36份樣品，詳細(xì)情況見下表1。下述條形碼篩選實(shí)驗(yàn)以植物葉片為材料。[0063]表1樣品信息表[0064]【權(quán)利要求】1.一種包括唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜的ITS2基因序列片段的基因庫(kù)，所述基因庫(kù)包括下述序列編號(hào)所示的ITS2基因序列片段：SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36。2.-種鑒別唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜植物物種的方法，所述方法包括將待鑒別植物的ITS2基因或其序列片段與根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因庫(kù)進(jìn)行比較的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟：1)提取待鑒別植物的基因組DNA;2)以步驟1)得到的基因組DNA為模板，擴(kuò)增ITS2基因或其序列片段；3)將步驟2)得到的ITS2基因或其序列片段與根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而鑒別所述待鑒別植物的物種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采用下述序列作為引物從所述待鑒別植物的基因組DNA中擴(kuò)增ITS2基因序列片段：SEQIDNO.37和SEQIDNO.38。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中通過將步驟2)得到的ITS2基因或其序列片段與根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因庫(kù)內(nèi)已有的序列之間進(jìn)行比對(duì)，獲得所述待鑒別植物的序列與基因庫(kù)內(nèi)已有的序列之間的相似性，從而鑒別所述待鑒別植物的物種。6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中在將步驟2)得到的ITS2基因或其序列片段與根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因庫(kù)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，相似度最高或匹配度最高或遺傳距離最小的對(duì)應(yīng)物種即為待鑒別植物的物種。7.ITS2基因或其序列片段在鑒別線紋香茶菜和溪黃草中的用途。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述ITS2基因序列片段為通過采用下述序列作為引物從待鑒別植物的基因組DNA中擴(kuò)增得到：SEQIDNO.37和SEQIDNO.38。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因庫(kù)在鑒別線紋香茶菜和溪黃草中的用途?！疚臋n編號(hào)】C12Q1/68GK104404129SQ201410189343【公開日】2015年3月11日申請(qǐng)日期:2014年5月6日優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日【發(fā)明者】張慧曄,馬新業(yè),李楚源,王德勤,詹若挺申請(qǐng)人:廣州白云山和記黃埔中藥有限公司