風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗鹽性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗鹽性的方法。菌劑包括：施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液；實驗結(jié)果表明：施加污泥復(fù)合微生物菌劑能夠顯著提高高羊茅株高、生物量以及葉綠素含量，降低其丙二醛和脯氨酸的含量，增強(qiáng)高羊茅保護(hù)酶活性?？傮w來看，微生物菌劑在低肥力和鹽漬化土壤中表現(xiàn)出較好的效果，這充分顯示了微生物菌劑在鹽堿地改良上的應(yīng)用潛力。
【專利說明】風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗鹽性的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗鹽性的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]草坪的數(shù)量和質(zhì)量是城市綠化水平的重要標(biāo)志。目前，國內(nèi)草坪建植的方式多種多樣，鋪設(shè)草皮雖然建坪成本高，但見效快，易操作，適用于所有草坪草，被廣大綠化工作者普遍接受。北京市園林綠化局曾在2007年的首屆京津地區(qū)草皮卷產(chǎn)業(yè)論壇上表示，到2020年，北京城市綠地率將達(dá)到44%至48%。天津泰達(dá)生態(tài)園林有限公司也在此介紹，濱海新區(qū)要建成宜居生態(tài)城區(qū)，規(guī)劃2010年綠化率達(dá)額到40%，綠地覆蓋率達(dá)到35%。因此，草皮卷市場空間非常大。冷季型草最適宜的播種時間是夏末初秋和早春，暖季型草坪草在春末夏初。在播種后40~50d后，草皮上的草坪草的覆蓋率達(dá)95%以上時即可移坪。所以一般在五、六月份第一批草皮卷才可上市。如果能夠縮短草皮生產(chǎn)的年周期，提早草皮上市時間，可大幅提高草皮卷的市場競爭力，提高人們的經(jīng)濟(jì)收入。而低溫是限制草皮生產(chǎn)周期的主要因素。冬季低溫還影響草坪草的綠期應(yīng)用范圍，降低其觀賞價值。因此，要提早草皮卷上市時間以及建植高質(zhì)量的草坪就必須深入細(xì)致地研究其抗寒性以便更好地在園林綠化中發(fā)揮其作用。
[0004]針對以上問題，目前研究集中于選取抗逆性強(qiáng)的草坪植物、應(yīng)用保水劑、施加化學(xué)改良劑、施肥等措施。而微生物菌劑作為一種高效、環(huán)保的生物肥料，其抗逆促生作用已得到認(rèn)可，其抗逆作用方面也有一定研究。
[0005]復(fù)合微生物菌劑由兩種或兩種以上且互不拮抗的微生物菌種按合適比例共同培養(yǎng)，充分發(fā)揮群體的聯(lián)合作用優(yōu)勢，取得較佳應(yīng)用效果的一種微生物制劑，此類菌劑一般具有有種類全、配伍合理、見效快、投資少、操作簡單、不造成二次污染等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)保等各個領(lǐng)域。
[0006] 施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及草坪養(yǎng)護(hù)管理中很重要的措施之一。在目前大部分選用的是無機(jī)肥。無機(jī)肥雖然能夠及時補(bǔ)充土壤養(yǎng)分，但是大量使用卻能對地表水、地下水以及空氣造成污染，對環(huán)境構(gòu)成威脅。施加微生物肥料是在較低的生態(tài)影響條件下維持較高產(chǎn)量的更加和諧的一種施肥方式.比如最經(jīng)典的菌根真菌、根瘤菌、根際促生細(xì)菌等。它的優(yōu)點主要表現(xiàn)在:1.創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境。2.提高土壤以及空氣造成污染的供肥能力3.對環(huán)境資源的有效利用。4.降低作物對化肥的依賴。5.抑制病蟲害的發(fā)生。其原因一是有益細(xì)菌的大量繁殖大植物根隙區(qū)域形成優(yōu)勢種群，抑制了病原微生物生長繁殖，降低了植物酶、多酚氧化酶等，參與植物的防御反應(yīng)，提高植物的抗病蟲害能力。6.減少農(nóng)藥污染等具有重要作用。同時，以城鄉(xiāng)有機(jī)廢棄物為基質(zhì)，采用現(xiàn)代化的工業(yè)技術(shù)，制造成具有多種功能(如固氮、解磷、活鉀等)再生型復(fù)合生物肥料，將對資源的循環(huán)利用，實現(xiàn)生態(tài)經(jīng)濟(jì)、社會效益一體化同樣具有重要意義。[0007]自20世紀(jì)70年代以來，歐美日本等國家或地區(qū)都相繼研制成功了一些復(fù)合菌劑，很多已經(jīng)開始進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，并形成了系列化的產(chǎn)品，主要用于處理生活污水，工農(nóng)業(yè)廢水以及其他一些化合物污染的治理。我國國內(nèi)微生物發(fā)展?fàn)顩r經(jīng)歷了從50年代到90年代，從理論到實踐，從單一菌種的利用到多個的混合應(yīng)用，產(chǎn)品也從根瘤菌劑發(fā)展到復(fù)合微生物菌劑，相繼取得了一些成果。
[0008]目前多數(shù)研究已表明，微生物制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，能促進(jìn)植物生長，且無毒、無公害、無污染，能持久均衡地供給農(nóng)作物氮磷鉀元素的，被廣泛開發(fā)用作生物肥料。目前研發(fā)的生物菌肥的熱點產(chǎn)品主要包括:有機(jī)物料腐熟菌劑(也稱發(fā)酵菌劑)、土壤修復(fù)菌劑、根瘤菌劑和溶磷菌劑、煙草等經(jīng)濟(jì)作物專用的功能菌劑、生物有機(jī)肥、抗旱菌劑等。美國哥斯達(dá)黎加大學(xué)應(yīng)用EM技術(shù)來種植香蕉，有效減小了香蕉葉斑病的發(fā)生和線蟲類的侵襲，大大提高了其營養(yǎng)價值和生產(chǎn)效率。
[0009]另外，復(fù)合微生物菌劑在畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也有很明顯的作用。復(fù)合微生物菌劑能防病抗病，提高成活率，提高生產(chǎn)性能，降低飼養(yǎng)成本，增加經(jīng)濟(jì)效，改善產(chǎn)品品質(zhì)，生產(chǎn)綠色食品。倪永珍等對雞進(jìn)行400d的EM飼喂結(jié)果表明，與對照組比較雞的死亡率平均下降了 35.5%。據(jù)石專林報道，在飼糧中添加5%的EM發(fā)酵飼料，可使肉仔雞增重提高
10.3%，料肉比下降7.8%。劉華周等試驗也表明，蛋雞日糧中EM發(fā)酵飼料占20%時，蛋殼厚度增加6.99%，蛋白哈氏單位提高10.31%，蛋黃顏色提高1.5羅氏級。
[0010]鹽堿地(土)，也 叫鹽潰土，是鹽化土，堿化土和鹽堿土的總稱。隨著生態(tài)環(huán)境的不斷惡化和人們不合理的開發(fā)利用，導(dǎo)致土壤鹽堿化不斷的加深擴(kuò)大。除了沿海地區(qū)的氯化鈉鹽土外，許多內(nèi)陸的干旱、半干早地區(qū)因不適當(dāng)灌溉也形成了大面積的次生鹽潰化土壤，近年來土壤鹽潰化有日益加重的趨勢。當(dāng)前，全世界鹽潰土面積約10億公頃；我國鹽潰土面積約3460萬公頃，耕地鹽堿化760萬公頃，近1/5耕地發(fā)生鹽堿化，其中原生鹽化型、次生鹽化型和各種堿化型分布分別占總面積的52%、40%和8%。而鹽堿逆境脅迫是限制草坪草生長的一個主要環(huán)境因素之一。土壤鹽潰化對作物的危害主要表現(xiàn)為引起植物生理干旱，抑制作物生長破壞光合作用功能，傷害植物組織，造成植物細(xì)胞膜傷害，使?fàn)I養(yǎng)失衡等。出于城市綠化及環(huán)境保護(hù)的需要，在鹽堿土上建植草坪已不可避免。因此國內(nèi)外許多草坪學(xué)者開始致力于草坪草抗鹽堿品種篩選及抗鹽堿機(jī)理的研究，取得了一定的研究結(jié)果。
[0011]目前，給草坪草施加微生物菌劑已有報道。王曉潔，真菌可以改良高羊茅、黑麥草等草坪植物的抗逆作用，提高了其抗寒性、抗旱性、抗水分脅迫以及抵抗生物危害的影響。有研究發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌可使多年生黑麥草根系受到侵染，并可明顯增加多年生黑麥草葉片中葉綠素含量，VA菌根可促進(jìn)黑麥草對P、F e、Cu、M g、K、B、S 1、S和N等礦質(zhì)養(yǎng)分的吸收，但卻使黑麥草組織中M η的濃度降低。還研究表明，在干旱的條件下，叢枝菌根的侵染、菌絲的發(fā)育均良好，接種從枝菌根后，增強(qiáng)了白三葉草的抗旱能力。有也對五種押寶桿菌進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)施加過微生物菌劑的黑麥草與沒有施加菌劑的對照相t匕，其株高、干重、葉綠素含量、根系體積和總表面積、根系活力等都顯著升高。
[0012]城市污泥是城市污水處理廠在各級污水處理凈化后所產(chǎn)生的含水量75%_99%的固體或者流體狀物質(zhì)。它包括污水中的泥砂、纖維、動植物殘體等固體顆粒及其凝結(jié)的絮狀物，各種膠體、有機(jī)物及吸附的金屬元素、微生物、病菌、蟲卵、雜草種子等綜合固體物質(zhì)。城市污泥中出現(xiàn)的微生物主要由細(xì)菌、放線菌、真菌以及原生動物和后生動物等，其中細(xì)菌是最主要成分，細(xì)菌主要有菌膠團(tuán)細(xì)菌和絲狀菌，數(shù)量可占污泥中微生物總量的90%-95%左右。
[0013]20世紀(jì)80年代之前，活性污泥菌群的研究主要以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法為主。該方法從活性污泥中發(fā)現(xiàn)的主要優(yōu)勢菌群有:動膠桿菌屬、叢毛單胞菌屬、不動桿菌屬、螺菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、短桿菌屬、黃桿菌屬和假單胞菌屬等。但是后來大量研究發(fā)現(xiàn)，在活性污泥中經(jīng)典純培養(yǎng)方法能夠培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量只占活性污泥微生物總數(shù)的1%~15%。 [0014]20世紀(jì)80年代后期，隨著以16 S r RNA為主要基石的細(xì)菌分子分類學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)、電泳技術(shù)、克隆庫技術(shù)、熒光原位雜交和流式細(xì)胞術(shù)逐漸成為研究活性污泥菌群的主要手段，活性污泥中菌群的復(fù)雜性和多樣性也以驚人的速度被人們認(rèn)識，大量傳統(tǒng)檢測方法未能發(fā)現(xiàn)卻在活性污泥中起關(guān)鍵作用的微生物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如具有除磷作用的類紅環(huán)菌、小月菌、類Tetr asphaera的棒狀菌、俊片菌等；具有脫氮作用的反硝化生絲微菌屬、固氮弧菌屬相關(guān)菌、類硝化螺菌等；與污泥泡沫有關(guān)的諾卡氏菌形放線菌、絲狀菌和等。
[0015]近期的相關(guān)文獻(xiàn)及實際生產(chǎn)表明:微生物菌劑在促進(jìn)植物生長的同時就還能夠明顯提高植物的抗病、抗旱能力，降低土壤PH和含鹽量，提高植物的抗凍能力。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤或垃圾堆肥中提取。有關(guān)污泥內(nèi)部微生物菌種之間共生及相互影響關(guān)系，以及污泥微生物菌劑應(yīng)用對植物生長和生理特性的影響方面的研究較少；而在草坪植物抗逆中的應(yīng)用則更是尚無文獻(xiàn)報道。
[0016]城市污泥含有豐富的微生物種類，雖然有些是條件致病菌，但是也含有很多對植物有益菌種。例如假單胞菌的生防促生作用應(yīng)經(jīng)得到公認(rèn)，這方面的研究報道也很多。固氮弧菌屬有著高效的固氮作用，他能夠侵入水稻、小麥和高粱根內(nèi)，并提高了幼苗含氮量。并且污泥為微生物提供了一個天然的馴化場所，其微生物具有潛在利用價值。因此篩選污泥中微生物種，群篩選出合適的有益微生物菌株，配制成復(fù)合微生物菌劑，研究其對植物的促生作用已經(jīng)植物在鹽堿或寒冷等逆境條件下的影響是完全可行的。
[0017]隨著草坪綠化日益收到人們重視的同時，見效快、益操作的草皮卷也日益被廣大綠化工作者普遍接受。但這種方式會帶走肥沃的表層土壤。為保證草皮品質(zhì)，傳統(tǒng)的草皮生產(chǎn)每完成一次生產(chǎn)過程，至少要鏟去2 cm以上熟土，在同一地塊連續(xù)生產(chǎn)3-4茬草皮之后，肥沃的農(nóng)田便遭到破壞，最肥沃的有機(jī)質(zhì)土壤層被剝離干凈，造成土地貧瘠。有土草皮卷不僅嚴(yán)重的破壞耕地的質(zhì)量，還會引起一系列的生態(tài)環(huán)保問題。而我國存在面積巨大的鹽堿土地，在鹽堿地上生產(chǎn)草皮卷可有效減輕耕地壓力，因此鹽堿土地存在巨大的潛在錄用價值。
[0018]長期以來，鹽堿土改良主要采用灌溉排水利用覆蓋物施加化學(xué)改良劑等措施。近年來，微生物菌劑在鹽堿地改良中作用的研究得到不斷加強(qiáng)。宋家清等研究發(fā)現(xiàn)，施用菌肥后表土層銨態(tài)氮含量增加明顯，速效鉀含量一定程度增加，硫酸鹽含量降低明顯，土壤酸堿度降至中性。李翠蘭等研究表明，施用菌劑有利于玉米苗期根系對營養(yǎng)元素的吸收尤其是磷素的吸收，在養(yǎng)分脅迫條件下菌劑起固氮解磷解鉀作用，而當(dāng)NPK養(yǎng)分充足時，菌劑的固氮解磷解鉀作用降低，逄煥成等認(rèn)為微生物菌劑對O 20cm 土壤脫鹽率有顯著影響，與不加菌劑處理相比脫鹽率提高9.04%，宋燕飛等研究認(rèn)為鹽脅迫下，施用復(fù)合微生物菌劑處理玉米幼苗能顯著促進(jìn)根的生長，增加根冠比和根體積，提高根系活力和根系活躍總吸收面積。洪堅平等在豌豆上試驗也表明，施用菌劑能刺激作物生長，還通過土壤中營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化，提聞婉?植株含憐量。
[0019]本技術(shù)基于前期接種提取于污泥中的施氏假單胞菌，里氏木霉及灰黃鏈霉菌的復(fù)合微生物菌劑對草坪植物生理生態(tài)影響研究的基礎(chǔ)上，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成不同濃度的復(fù)合微生物菌劑接種到草坪建植體系中，進(jìn)一步研究在鹽堿脅迫條件下，復(fù)合微生物菌劑對栽培基質(zhì)的保水性能及對高羊茅生理特性的影響，目的是為篩選優(yōu)良抗旱污泥復(fù)合微生物菌劑，提高草坪植物抗鹽性，為草坪植物在鹽堿土壤上的建植提供科技支撐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明的目的在于提供一種風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗鹽性的方法。本發(fā)明的研制結(jié)果表明:高羊茅的生長狀況隨著培養(yǎng)基質(zhì)鹽含量的升高而降低。加入CM菌劑能顯著提高植物的生長，緩解鹽脅迫對高羊茅造成傷害。其中菌液100倍稀釋液的效果要好于菌液200倍稀釋液。說明復(fù) 合微生物菌劑對緩解草坪植物鹽脅迫有促進(jìn)作用。為實現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案:
一種風(fēng)干污泥菌劑，其特征在于它是由下述成分組成:
施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液；
其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1 ;
3菌種的菌落數(shù)在(2.15±0.03) XlO9Ail~(2.07±0.07) X 109/ml之間，假單胞菌的0D600 nm 值為 0.592 ；
本發(fā)明優(yōu)選的原料為:施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液。
[0021]本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(1)研制材料
選取挑選籽粒飽滿、均勻一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)種子為試驗材料，供試基質(zhì)鹽堿土取自河北省黃驊市海邊；
(2)復(fù)合微生物菌劑制備
復(fù)合微生物菌劑制備:選取施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，選用600 nm波長進(jìn)行比濁測定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線，選取對數(shù)生長期的菌種，按照下面要求配制復(fù)合微生物菌劑；
施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液；
其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1 ;
3菌種的菌落數(shù)在(2.15±0.03) XlO9Ail~(2.07±0.07) X 109/ml之間，假單胞菌的0D600 nm 值為 0.592 ；
(3)實驗設(shè)計
I)將取自河北省黃驊市海邊的供試基質(zhì)鹽堿土，按照不同比例與正常土混合，配成含鹽量分別為0.2%，0.4%，0.8%的基質(zhì)土，分別用:
施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌混合菌劑的100倍稀釋液或；
施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌混合菌劑的200倍稀釋液；
2)將高羊茅植物種子分別播于盛有IKg基質(zhì)土的花盆中，每盆1.5g，每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致，待植物生長到分蘗期的時候，以澆灌的形式加入上述不同處理的污泥微生物菌劑個15ml，持續(xù)處理35天后測定植物的各個指標(biāo)，養(yǎng)期間實驗室的平均溫度為22-35°C ;平均濕度為54.5%，光照為自然光，進(jìn)行指標(biāo)測定。
[0022]本發(fā)明更進(jìn)一步公開了風(fēng)干污泥菌劑在改良鹽堿地方面的應(yīng)用。特別是在提高植物生長緩解鹽脅迫對高羊茅造成傷害方面的應(yīng)用；其中風(fēng)干污泥菌劑為100倍的菌液稀釋液。同時風(fēng)干污泥菌劑在提高高羊茅株高、生物量、葉綠素含量、保護(hù)酶活性以及丙二醛、脯氨酸含量也有顯著的效果。
[0023]本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下:
I研制材料與方法
1.1研制材料 (I)草種與土壤
選取挑選籽粒 飽滿、均勻一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)種子為試驗材料。試的基質(zhì)鹽堿土取自河北省黃驊市海邊。
[0024](2)菌株的培養(yǎng)
稱取新鮮污泥，采用稀釋分離法制備10_3、10_4、10_5、10_6的污泥懸浮液。根據(jù)所分離的微生物，取不同濃度的污泥懸浮液(真菌取10_3、10_4，放線菌取10_4、10_5，細(xì)菌取10_5、10_6)，搖勻后吸取0.2 mL加入到預(yù)先制好的平板中。真菌用馬丁氏瓊脂平板；放線菌用高氏一號瓊脂平板；細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨平板。用滅菌的涂布器涂抹均勻，每處理重復(fù)3次，28°C培養(yǎng)。根據(jù)平板內(nèi)菌落的形態(tài)、大小、色澤和生長速度等特點，從每個樣品盡可能多的挑取單菌落劃線純化。依據(jù)菌落培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征對菌株進(jìn)行歸類并統(tǒng)計數(shù)量。確定優(yōu)勢菌株，進(jìn)行編號保存，待進(jìn)一步鑒定。
[0025](3)菌種的鑒定
鏡檢:細(xì)菌的鑒定采用革蘭氏染色法，放線菌采用印片法，絲狀真菌直接鏡下觀察。
[0026]PCR鑒定:直接挑取單菌體溶于100 UL高純水中，沸水中煮10 min裂解菌體，使DNA釋放出來，直接作為PCR反應(yīng)的模版。細(xì)菌和放線菌采用通用引物27f (5’ 一AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3，)和 1492R(5’一GGTTACCTTGTTACGACTT — 3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增 16SrRNA基因。真菌采用真菌核糖體18S rDNA的通用引物ITSl (5，一TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4 (5，— TCCTCCGCTTATTGATATGC 一3，)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序如下:940C 2 min,94°C I min,57°C I min,72°C I min，25 個循環(huán)；72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉基因公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的16S rDNA和18S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。
[0027](4)菌劑的配制
選取對植物生長有利的細(xì)菌、真菌、放線菌各I種，分別為假單胞菌、木霉和鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長進(jìn)行比濁測定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線。選取對數(shù)生長期的菌種，配制成菌劑。
[0028]1.2復(fù)合微生物菌劑制備
復(fù)合微生物菌劑制備，選取對植物生長有利的細(xì)菌、真菌、放線菌各I種，分別為施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min適溫培養(yǎng)，選用600 nm波長進(jìn)行比濁測定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),繪制微生物的生長曲線。選取對數(shù)生長期的菌種，按照下面要求配制復(fù)合微生物菌劑。
[0029]1.3實驗設(shè)計
將取自河北省黃驊市海邊的供試基質(zhì)鹽堿土，按照不同比例與天津師范大學(xué)校園內(nèi)正常土混合，配成含鹽量分別為0.2%, 0.4%, 0.8%的基質(zhì)土，分別用T1、T2、T3表示。在此鹽脅迫條件下設(shè)定處理方式:處理I為對照，不接種菌劑(CK);處理2加入施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌混合菌劑的100倍稀釋液(CM1);處理3加入施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌混合菌劑的200倍稀釋液(CM2)。各處理菌液均按體積比為1:1:1的比例混合后用無菌水稀釋。將高羊茅植物種子分別播于盛有IKg基質(zhì)土的花盆中，每盆1.5g。每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致。待植物生長到分蘗期的時候，以澆灌的形式加入上述不同處理的污泥微生物菌劑個15ml。各處理3次重復(fù)。持續(xù)處理35天后測定植物的各個指標(biāo)。養(yǎng)期間實驗室的平均溫度為22~35°C ;平均濕度為54.5 %。光照為自然光。[0030]1.4測定指標(biāo)
1.4.1干旱脅迫條件下高羊茅動態(tài)株高變化
高羊茅培植到分蘗期時，施加菌劑，10 d第一次測量株高，后沒IOd測量一次，共3次。
[0031]1.4.2地上生物量和地下生物量
待草坪植物生長35d后將草坪植物齊根刈割，地上部分和地下部分分別用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，放入烘箱中，在105°C下殺青I h，80°C烘干至恒重，以其干重視為地上部分和地下部分的生物量。
[0032]1.4.3離體葉片持水力的測定
將準(zhǔn)確稱過鮮重的植物葉片，放入25°C~30°C的干燥器中，在黑暗條件下干燥2飛h，再稱量失水后葉片的重量，按下式計算失水率:失水率(％)=(鮮重一失水后重)/鮮重 X 100%
1.4.4葉綠素含量的測定
葉綠素含量的測定:取0.1 g葉片，剪成1-2 mm碎片，浸泡于丙酮:乙醇(V:V=1:1)溶液中24小時,浸泡液為待測液。用分光光度計于波長633 nm和645 nm下測量吸光值,并根據(jù)公式計算葉綠素含量；計算公式結(jié)果計算:
【權(quán)利要求】
1.一種風(fēng)干污泥菌劑，其特征在于它是由下述成分組成: 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液； 其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:1 ; 3菌種的菌落數(shù)在(2.15±0.03) XlO9Ail~(2.07±0.07) X 109/ml之間，假單胞菌的0D600 nm 值為 0.592。
2.權(quán)利要求1所述的風(fēng)干污泥菌劑，其中所述的原料為:施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液。
3.一種采用風(fēng)干污泥菌劑提高高羊茅抗旱性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: (O研制材料 選取挑選籽粒飽滿、均勻一致的高羊茅(Festuca arundinacea L.)種子為試驗材料，供試基質(zhì)鹽堿土取自河北省黃驊市海邊； (2)復(fù)合微生物菌劑制備 復(fù)合微生物菌劑制備:選取施氏假單胞菌、里氏木霉和灰黃鏈霉菌，將分離出的菌種純化培養(yǎng)2代，取活化菌種，接入裝有200 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，選用600 nm波長進(jìn)行比濁測定，以菌懸液的0D600 nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制微生物的生長曲線，選取對數(shù)生長期的菌種，按照下面要求配制復(fù)合微生物菌劑； 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌100倍稀釋液或 施氏假單胞菌+里氏木霉+黃鏈霉菌200倍稀釋液； 其中施氏假單胞菌:里氏木霉:黃鏈霉菌的體積份數(shù)比為1:1:13菌種的菌落數(shù)在(2.15±0.03) X 109/m廣(2.07±0.07) X 109/ml (之間，假單胞菌的0D600 nm 值為 0.592 ； (3)實驗設(shè)計 I)將取自河北省黃驊市海邊的供試基質(zhì)鹽堿土，按照不同比例與正常土混合，配成含鹽量分別為0.2%，0.4%，0.8%的基質(zhì)土，分別用: 施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌混合菌劑的100倍稀釋液或； 施氏假單胞菌+里氏木霉+灰黃鏈霉菌混合菌劑的200倍稀釋液； 2)將高羊茅植物種子分別播于盛有IKg基質(zhì)土的花盆中，每盆1.5g，每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致，待植物生長到分蘗期的時候，以澆灌的形式加入上述不同處理的污泥微生物菌劑個15ml，持續(xù)處理35天后測定植物的各個指標(biāo)，養(yǎng)期間實驗室的平均溫度為22-35°C ;平均濕度為54.5%，光照為自然光，進(jìn)行指標(biāo)測定。
4.風(fēng)干污泥菌劑在改良鹽堿地方面的應(yīng)用。
5.風(fēng)干污泥菌劑在提高植物生長緩解鹽脅迫對高羊茅造成傷害方面的應(yīng)用；其中風(fēng)干污泥菌劑為100倍的菌液稀釋液。
6.風(fēng)干污泥菌劑在提高高羊茅株高、生物量、葉綠素含量、保護(hù)酶活性以及丙二醛、脯氨酸含量方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/14GK103937729SQ201410190937
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】多立安, 趙樹蘭, 王志旭 申請人:天津師范大學(xué)