通過發(fā)酵過量生產(chǎn)γ-谷氨酰半胱氨酸和該二肽的衍生物的微生物和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過發(fā)酵過量生產(chǎn)γ-谷氨酰半胱氨酸和該二肽的衍生物的微生物和方法。具體地，本發(fā)明涉及能夠過量生產(chǎn)γ-谷氨酰半胱氨酸及其衍生物雙-γ-谷氨酰胱氨酸和γ-谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，其可以由母株制備，其中，相對于所述母株，所述菌株具有降低的細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性，并且具有細(xì)胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，相比于具有相似降低的細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性的菌株，所述菌株具有的細(xì)胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性更大地提高。
【專利說明】通過發(fā)酵過量生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸和該二肽的衍生物的微生物和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及適于過量生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸UGC)和該二肽的衍生物Y-谷氨酰胱氨酸和雙-Y -谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，以及用于制備這些化合物的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]Y -谷氨酰半胱氨酸是通過連接氨基酸L-半胱氨酸和L-谷氨酸而形成于原核和真核生物細(xì)胞中的二肽。
[0003]雙-Y-谷氨酰胱氨酸是通過兩分子的Y-谷氨酰半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。該反應(yīng)是可逆的，這意味著，通過還原(例如酶法或化學(xué)法)，雙-Y-谷氨酰胱氨酸可以轉(zhuǎn)化回Y-谷氨酰半胱氨酸。
[0004]Y-谷氨酰胱氨酸是通過一分子的Y-谷氨酸半胱氨酸和一分子的L-半胱氨酸的氧化形成的二硫化物。該反應(yīng)是可逆的，這意味著，通過還原(例如化學(xué)法)，Y-谷氨酰胱氨酸可以轉(zhuǎn)化回Y -谷氨酰半胱氨酸和L-半胱氨酸。
[0005]巰基化合物Y-谷氨酰半胱氨酸在很多生物中作為谷胱甘肽的前體。谷胱甘肽生物合成的第一步是通過ATP-依賴性酶Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶連接L-半胱氨酸的α-氨基和L-谷氨酸的Y-羧基之間的Y-肽鍵。此外，由于酶Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶被谷胱甘肽抑制，該反應(yīng)是谷胱甘肽生物合成的限速步驟。谷胱甘肽生物合成的第二步是L-甘氨酸和Y-谷氨酰半胱氨酸反應(yīng)以產(chǎn)生谷胱甘肽，其中L-甘氨酸通過α-肽鍵和Y-谷氨酰半胱氨酸的半胱氨酰官能團(tuán)連接。該ATP-依賴性的反應(yīng)也同樣由酶谷胱甘肽合成酶催化。
[0006]由于其抗氧化的特性，谷胱甘肽在細(xì)胞中起關(guān)鍵作用，并且作為還原劑、輔底物、輔因子參與很多細(xì)胞過程。然而，也已知存在谷胱甘肽缺陷的生物，其中所述谷胱甘肽前體Y-谷氨酰半胱氨酸發(fā)揮谷胱甘肽的生物學(xué)作用。已知的實(shí)例是諸如鹽生鹽桿菌(Halobacterium halobium)(Sundquist and Fahey, 1989, J.B1l.Chem.264:719-725)的典型嗜鹽古細(xì)菌。
[0007]此外，在文獻(xiàn)中描述了各種菌種的不同谷胱甘肽缺陷微生物菌株，如釀酒酵母(Grant et al., 1997, Mol.B1l.Cell.8:1699-1707) > 集胞藻(Synechocystis sp.)(Cameron and Pakrasi, 2011, Plant Signal.Behav.6:89-92)或大腸桿菌(Fuchs andWarner, 1975，J.Bacter1l.124:140-148)。這些菌株在相應(yīng)的編碼谷胱甘肽合成酶的基因中具有突變或缺失(例如，大腸桿菌和集胞藻的gshB或者啤酒酵母的gsh2)。通過谷胱甘肽合成酶活性的改變或缺失，這些菌株不再能或僅能在一定程度上合成谷胱甘肽。因此細(xì)胞Y-谷氨酰半胱氨酸水平提高。由于增強(qiáng)的形成和提高的濃度的現(xiàn)存Y-谷氨酰半胱氨酸承擔(dān)了很多谷胱甘肽特異性功能，這些突變菌株是有生存能力的。然而，相比對應(yīng)的野生型菌株，這些菌株的特征在于對活性氧和重金屬離子的增加的敏感度，使得其生長部分被損害(Cameron and Pakrasi, 201 !Plant Signal.Behav.6:89-92 ；Helbig et al., 2008, J.Bacter1l.190:5439-5454)。
[0008]活性氧、重金屬離子和外源化合物(xenob1tic)的解毒頻繁發(fā)生在許多生物中，也在人類中，尤其通過谷胱甘肽的方式(Grant et al.，Mol.B1l.Cell.8:1699-1707)。此外，較低的谷胱甘肽水平通常是諸如自閉癥、帕金森病、囊性纖維病、HIV、癌癥或精神分裂癥的各種疾病的癥狀和/或基礎(chǔ)(Wu et al.，2004，J.Nutr.134:489-492)。因此，對維持恒定的細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平甚至提高其水平存在相當(dāng)大的關(guān)注。Y-谷氨酰半胱氨酸已被成功測試作為用于提高細(xì)胞谷胱甘肽水平的有前景的物質(zhì)(Anderson and Meister, 1983，P.N.A.S.80:707-711)。
[0009]W02006102722描述了用于制備Y _谷氨酰半胱氨酸的酶促法，這是基于半胱氨酸衍生物和Y-谷氨酰半胱氨酸供體的反應(yīng)，通過固定的Y-谷氨酰半胱氨酸轉(zhuǎn)肽酶。
[0010]微生物Y-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)者主要是諸如釀酒酵母或產(chǎn)朊假絲酵母的酵母菌目中的真菌菌株，但這主要用于谷胱甘肽的生產(chǎn)。這類菌株在如W02010116833A1、US7371557B2、和 US2005074835A1 中公開。除此之外，在 EP2251417A1、US7569360B2、US2004214308AUUS2003124684AUUS7410790B2 和 EP1489173B1 中描述了具有用于 Y-谷氨酰半胱氨酸生產(chǎn)的異常高能力的相同目中的其他真菌菌株。作為通常的特征，這些真菌菌株具有降低的谷胱甘肽合成酶活性，此外還有各種菌株特異性的特征，如淺藍(lán)菌素或亞硝基胍耐受性或泛酸營養(yǎng)缺陷。
[0011]此外，US2005042328A1描述了在具有降低的谷胱甘肽合成酶活性和提高的gshl表達(dá)(gshl編碼Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶)的產(chǎn)朊假絲酵母菌株中Y-谷氨酰半胱氨酸的細(xì)胞內(nèi)富集。
[0012]真菌Y-GC的生產(chǎn)系統(tǒng)的缺點(diǎn)是相對較低的Y-谷氨酰半胱氨酸的產(chǎn)量以及Y-谷氨酰半胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)累積，這使得作為Y-谷氨酰半胱氨酸可能生產(chǎn)(workup)的真菌細(xì)胞的干擾成為必要。
[0013]在US20100203592A1中描述了作為Y -谷氨酰半胱氨酸的原核生產(chǎn)者的各種大腸桿菌菌株，其全部具有提高的gshA表達(dá)。此外，相比對應(yīng)的母株，這些菌株具有正?；蛱岣叩墓入赘孰暮铣擅富钚浴Ｏ啾日婢到y(tǒng)，分泌至培養(yǎng)基的Y-谷氨酰半胱氨酸可以和這些菌株在一起。這些菌株的最大產(chǎn)量是262mg/l，對于建立經(jīng)濟(jì)的方法而言，這是不夠的。
[0014]能夠過量生產(chǎn)有前景的生物活性化合物Y-谷氨酰半胱氨酸及其衍生物雙Y-谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸的微生物菌株，及此外允許這些化合物以g/ι的規(guī)模分泌至培養(yǎng)基的微生物菌株還不存在。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]因此，本發(fā)明的目的是提供能過量生產(chǎn)Y -谷氨酰半胱氨酸及其衍生物雙-Y -谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸的微生物菌株，此外，其使這些化合物能夠在培養(yǎng)基中細(xì)胞外累積。
[0016]通過原核微生物菌株達(dá)到了該目的，該原核微生物可以由母株制備，并且與母株相比具有降低的細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性，并具有細(xì)胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，相對于具有相似降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株，該活性極大提高。
[0017]根據(jù)本發(fā)明菌株中的谷胱甘肽合成酶活性優(yōu)選降低至所述活性最高為相應(yīng)野生型菌株的谷胱甘肽合成酶活性的50%。
[0018]在其谷胱甘肽合成酶活性改變之前，優(yōu)選地是具有野生型的谷胱甘肽合成酶的最高25%活性的原核微生物菌株。菌株的降低的谷胱甘肽合成酶活性特別優(yōu)選地理解為在此菌株中不存在谷胱甘肽合成酶活性。
[0019]根據(jù)本發(fā)明菌株中的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性優(yōu)選地高于具有相似降低的谷胱甘肽合成酶活性的菌株大約至少5倍。
[0020]特別優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株，其中谷胱甘肽合成酶活性和Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性二者如上所述已改變。
[0021]DNA 的同一度由網(wǎng)站 http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/ 上的基于 Blastn 算法的“核苷酸比對(nucleotide blast)”程序確定。使用默認(rèn)參數(shù)作為算法參數(shù)用于兩個(gè)或更多核苷酸序列的比對(陣列，alignment)。默認(rèn)常用參數(shù)是:最大靶序列=100 ;短查詢串(short queries)= “ 自動調(diào)整參數(shù)用于短輸入序列(Automatically adjust parametersfor short input sequences) ”;期望閾值=10 ;字長(word size) = 28 ;用于短輸入序列的自調(diào)整參數(shù)(Automatically adjust parameters for short input sequences) =0。相應(yīng)默認(rèn)打分參數(shù)是:匹配/不匹配分?jǐn)?shù)=I至2 ;空位罰分(GAp Costs)=線性。
[0022]網(wǎng)址 http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/ 上的“蛋白質(zhì)比對(protein blast)” 程序用于蛋白序列的對比。該程序是基于blastp算法。用于兩個(gè)或更多蛋白序列的匹配，默認(rèn)參數(shù)用作算法參數(shù)。默認(rèn)常用參數(shù)是:最大靶序列=100;短串查詢=“用于短輸入序列的自動調(diào)節(jié)參數(shù)”；期望閾值=10 ;字長=3 ;用于短輸入序列的自調(diào)整參數(shù)=O。默認(rèn)打分參數(shù)是:模板=BL0SUM62 ;空位罰分=存在:11擴(kuò)展:1 ;組成調(diào)節(jié)(Composit1naladjustments)=常規(guī)組成打分模板調(diào)節(jié)(Condit1nal composit1nal score templateadjustment)。
[0023]具有Y-谷氨酰半胱氨酸的生物合成途徑的全部原核微生物菌株可以通過發(fā)酵培養(yǎng)，原則上適于作為母株以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株。這類微生物可以屬于細(xì)菌(前述真細(xì)菌)或古生細(xì)菌(前述古細(xì)菌)。
[0024]這些生物優(yōu)選地是細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生類群的代表。特別優(yōu)選地是腸桿菌科的生物，具體地是大腸桿菌(Escherichia coli)和菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)。
[0025]如實(shí)施例9所述，Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性是在Y -谷氨酰半胱氨酸隨時(shí)間形成的基礎(chǔ)上測定的。
[0026]谷胱甘肽合成酶活性是利用丙酮酸激酶偶聯(lián)酶檢測試驗(yàn)、通過ADP的形成速率確定的。其中L-甘氨酸和L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁酸作為底物反應(yīng)(Kim et al.，2003，J.B1chem.Mol.B1l.36:326-331)。
[0027]用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的微生物的適宜母株優(yōu)選地是原核微生物菌株，其具有用于
Y -谷氨酰半胱氨酸的生物合成途徑并且，此外對比相應(yīng)的母株，其具有提高的L-半胱氨酸生物合成能力。用于L-半胱氨酸生物合成的提高的能力利于Y -谷氨酰半胱氨酸的合成，由于為了 Y-谷氨酰半胱氨酸的高產(chǎn)量，不應(yīng)限制提供足量的作為Y-谷氨酰半胱氨酸前體的L-半胱氨酸。對比相應(yīng)的野生型、母株或未改變的菌株，“提高的L-半胱氨酸合成能力”根據(jù)本發(fā)明理解為微生物菌株產(chǎn)生更多L-半胱氨酸或其衍生物L(fēng)-胱氨酸和噻唑烷的能力。這通常表現(xiàn)為培養(yǎng)基中L-半胱氨酸、L-胱氨酸和/或噻唑烷的富集。因此目前為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，提高的L-半胱氨酸生物合成能力是，如果在相關(guān)微生物菌株的發(fā)酵期間或結(jié)束時(shí)，在培養(yǎng)基中可檢測到至少0.5g/l的“總半胱氨酸”(L-半胱氨酸+L-胱氨酸+噻唑烷)。
[0028]公開了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的具有提高的L-半胱氨酸生物合成能力的微生物的可能母株，如在 US20040038352A1、US20090053778、EP1528108A1、EP2345667A2 或EP2138585 中。
[0029]此外，由現(xiàn)有技術(shù)可知的基因或這些基因的變體(等位基因)致使其用于過量生產(chǎn)氨基酸L-半胱氨酸和/或L-絲氨酸或O-乙酰絲氨酸的前體:
[0030]-serA 等位基因，如在 EP0620853B1、EP1496111B1 和 EP0931833A2 中描述的:
[0031 ] 這些serA等位基因編碼3_磷酸甘油酸脫氫酶，其受到由L-絲氨酸降低的反饋抑制的影響。以此方式，3-羥基丙酮酸的形成與細(xì)胞的絲氨酸水平很大程度上被解偶聯(lián)，這允許更好的朝向L-半胱氨酸的物質(zhì)流。
[0032]-cysE 等位基因，如 W09715673 ;Nakamori S.et al., 1998, Env.Microb1l64:1607-1611 或 Takagi H.et al., FEBS Lett.452: 323-327 中描述的:
[0033]這些cysE等位基因編碼受到由L-半胱氨酸降低的反饋抑制的影響的絲氨酸-O-乙?；D(zhuǎn)移酶。以這種方式，O-乙?；z氨酸和L-半胱氨酸的合成與細(xì)胞中的L-半胱氨酸水平很大程度上解偶聯(lián)。
[0034]-外排基因(effluxgene)，如在 EP885962A1 中描述的:
[0035]在EP885962A1中所述的orf306在一段時(shí)間內(nèi)被多次引用。所述基因的DNA序列被稱為orf306或orf299、ydeD和eamA，目前保藏在登錄號NC_004431或NC_007779下。orf306 (orf299、eamA或ydeD)編碼外排系統(tǒng),適于消除抗生素和其他有毒物質(zhì)并引起L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰絲氨酸和/或噻唑烷衍生物的過量生產(chǎn)(Ohtsu 1.etal.，2010，J.B1l.Chem.285 ； 17479 - 17489 ；EP885962 和 EP1233067B1)。
[0036]-cysB，如在 DE19949579C1 中描述的:
[0037]cysB基因編碼半胱氨酸代謝的中央調(diào)節(jié)子，并其決定性作用，除其它之外，在提供用于半胱氨酸生物合成的硫化物中。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株也優(yōu)選地表達(dá)一種或多種上述基因或等位基因。特別優(yōu)選地是利用上述cysE或serA和orf306的等位基因中的一種。在這種情況下，cysE或serA等位基因以及orf306基因可以在根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株中單獨(dú)或組合表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株特別優(yōu)選具有遺傳改變，其作為本發(fā)明存在于實(shí)施例中，具體地，作為本發(fā)明，表征于表4中。
[0039]本發(fā)明的微生物菌株可以利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生。
[0040]Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GshA)細(xì)胞活性可以提高，如，通過提高gshA基因或gshA同源基因的拷貝數(shù)或利用致使gshA基因或gshA同源基因表達(dá)量提高的合適啟動子。
[0041]大腸桿菌的gshA基因編碼Y -谷氨酰半胱氨酸合成蛋白(GshA)酶。gshA基因特征在于序列SEQ ID N0.1。GshA基因產(chǎn)物(GshA)特征在于SEQ ID N0.2。在本發(fā)明的上下文中，gshA同源基因相比SEQ ID N0.1，具有大于30%的序列同一性。gshA同源基因相比SEQ ID N0.1，特別優(yōu)選地具有大于70%的序列同一性。
[0042]GshA同源基因是與序列SEQ ID N0.2具有序列同一性大于30%的蛋白質(zhì)。GshA同源基因特別優(yōu)選地與SEQ ID N0.2具有序列同一性大于70%。
[0043]在微生物中g(shù)shA基因或gshA同源基因拷貝數(shù)的提高可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法進(jìn)行。因此gshA或gshA同源基因，如可以克隆至具有多個(gè)拷貝數(shù)每細(xì)胞的質(zhì)粒載體中(例如，大腸桿菌的 pBR322、pBR 衍生物、pBluescript、pUC18、pUC19、pACYC184 和PACYC184衍生物)，并可以引入微生物?？商娲?，gshA基因或gshA同源基因可以重復(fù)地整合入微生物菌株的染色體。利用溫和噬菌體、整合型質(zhì)?；蛲ㄟ^同源重組的整合的已知系統(tǒng)可以用作整合方法(Hamilton et al., 1989, J.Bacter1l.171:4617-4622 ；Datsenkoand Wanner, 2000, P.N.A.S.97:6640-6645)。
[0044]優(yōu)選地是在啟動子的控制下通過將gshA或gshA同源基因克隆至質(zhì)粒載體，提高拷貝數(shù)。特別優(yōu)選地是通過將gshA或gshA同源基因克隆至諸如pACYC184-LH(根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于1995年8月18日保藏在德國微生物保藏中心，馬斯徹羅德道Ib D-38124不倫瑞克，編號DSM10172)的pACYC衍生物中，提高大腸桿菌中的拷貝數(shù)。
[0045]提高拷貝數(shù)理解為優(yōu)選地提高約10倍。
[0046]如利用覆蓋全部基因的特定引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的特異性擴(kuò)增，將gshA基因或gshA同源基因克隆至質(zhì)粒載體，并且隨后與質(zhì)粒DNA片段進(jìn)行連接。
[0047]基因的天然啟動子和/或操縱子區(qū)可作為質(zhì)粒編碼基因表達(dá)的控制區(qū)。
[0048]gshA或gshA同源基因的表達(dá)率也可通過其他啟動子來提高。相關(guān)的啟動子系統(tǒng)如在大腸桿菌中的gapA基因的組成性GAPDH啟動子或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的可誘導(dǎo) lac、tac、trc 、lambda、ara 或 tet 啟動子(Markides S.C., 1996, Microb1l.Rev.60:512-538)。這類構(gòu)建體以質(zhì)粒或染色體自身已知的方式構(gòu)建。
[0049]進(jìn)一步，通過翻譯起始信號可獲得提高的細(xì)胞GshA活性，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)或各自構(gòu)建體上的優(yōu)化序列中存在的Shine Dalgarno序列，或根據(jù)“密碼子使用”將稀有密碼子置換為常用密碼子。
[0050]細(xì)胞GshA活性的提高也可以在于將突變(替代、插入、或核糖核苷酸的缺失)引入gshA基因或gshA同源基因的讀碼框，這使得GshA或GshA同源基因的特異性活性提高。將gshA基因的非常見起始密碼子TTG置換為例如常見啟動密碼子ATG，不僅致使gshA表達(dá)量的提高，而且致使大腸桿菌中GshA的細(xì)胞活性提高(Kwak et al.，1998，J.B1chem.Mol.B1l.31:254-257)。
[0051]gshA的定點(diǎn)突變，在蛋白水平上包括494位的丙氨酸置換為纈氨酸或亮氨酸(A494V或A494L)或在495位置換為蘇氨酸(S495T)，也致使在大腸桿菌中細(xì)胞GshA活性的提高(Kwak et al., 1998, J.B1chem.Mol.B1l.31:254-257)。這類等位基因優(yōu)選地是根據(jù)本發(fā)明的gshA同源基因。
[0052]由現(xiàn)有技術(shù)可知用于在微生物菌株中降低谷胱甘肽合成酶活性的方法，細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性可以降低，例如，在于將突變(替換、插入或缺失單個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸)引入gshB基因或gshB同源基因的讀碼框，其可致使GshB或GshB同源基因特異性活性降低。用于產(chǎn)生該gshB等位基因的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。如可以利用gshB野生型基因的DNA作為起始材料，通過非特異性或定點(diǎn)突變，制備gshB基因的等位基因。如在Kato等(1988, J.B1l.Chem.263:11646-11651)中描述了這類等位基因的實(shí)例，相比野生型酶而言，該等位基因編碼具有降低的GshB活性的GshB變體。
[0053]在gshB基因或gshB基因的啟動子區(qū)的非特異性突變，例如可以通過化學(xué)試劑，如，除了其它，亞硝基胍、乙基甲磺酸和/或通過物理方法和/或通過在特定條件下的PCR反應(yīng)產(chǎn)生。已知用于在DNA片段的特定位點(diǎn)引入突變的方法。例如，DNA片段中一個(gè)或多個(gè)堿基，其包括gshB基因及其啟動子區(qū)，可以利用合適的寡核苷作為引物，通過PCR進(jìn)行置換。此外，可以通過基因合成，制備整個(gè)gshB基因或新的gshB等位基因。
[0054]gshB等位基因通常最初在體外產(chǎn)生，并且隨后插進(jìn)入細(xì)胞的染色體，由此最初存在的gshB野生型基因被替換并且最終產(chǎn)生gshB變異菌株。gshB等位基因而不是gshB野生型基因通過已知的標(biāo)準(zhǔn)方法能插入宿主細(xì)胞的染色體中。這可通過在Link等的方法(1997，J.Bacter1l.179:6228-37)經(jīng)同源重組機(jī)制用于將染色體突變引入至基因。如通過根據(jù) Datsenko 和 Wanner (2000, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.97:6640-5)描述的方法的Λ-Red重組酶系統(tǒng)，整個(gè)gshB基因或其部分的染色體的缺失是可以的。通過Pl噬菌體或結(jié)合的方法，gshB等位基因也可從具有g(shù)sh突變的菌株中轉(zhuǎn)移至gshB野生型菌株，其中染色體的gshB野生型基因被相應(yīng)的gshB等位基因替換。
[0055]此外，細(xì)胞的谷胱甘肽合成酶活性也可降低，因?yàn)樾枰辽僖粋€(gè)用于表達(dá)調(diào)控的元件(element)(如啟動子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn))通過單個(gè)或多個(gè)核苷的替換、插入或缺失而突變。
[0056]大腸桿菌的gshB基因編碼谷胱甘肽合成酶。gshB基因的特征在于SEQ ID N0.3。GshB基因產(chǎn)物(GshB)特征在于SEQ ID N0.4。
[0057]在本發(fā)明的上下文中，gshB同源基因與SEQ ID N0.3具有的序列同一性大于30%。特別優(yōu)選地是，與SEQ ID N0.3具有的序列同一性大于70%。GshB同源基因是與SEQID N0.4具有序列同一性大于30%的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選地GshB同源基因與SEQ ID N0.4具有的序列同一性大于70%。
[0058]本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于過量生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸(YGC)和該二肽的衍生物
Y-谷氨酰半胱氨酸和雙-Y -谷氨酰胱氨酸的方法，其中根據(jù)本發(fā)明的微生物菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中除去細(xì)胞并且從培養(yǎng)基中純化得到所需產(chǎn)物。
[0059]根據(jù)本發(fā)明方法所需的微生物在生物反應(yīng)器中(發(fā)酵罐)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)發(fā)酵方法，基于工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)(發(fā)酵)。
[0060]發(fā)酵優(yōu)選在常規(guī)生物反應(yīng)器中進(jìn)行，如攪拌槽、泡沫柱式發(fā)酵罐或者氣升式發(fā)酵罐。特別優(yōu)選的是攪拌釜發(fā)酵罐。本發(fā)明中的工業(yè)規(guī)?？梢岳斫鉃橹辽?升的發(fā)酵罐尺寸。優(yōu)選的是具有體積大于5升的發(fā)酵罐，特別優(yōu)選地是具有體積大于50升的發(fā)酵罐。
[0061]用于生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸的細(xì)胞在有氧的生長條件下培養(yǎng)，其中發(fā)酵過程中氧含量調(diào)節(jié)至最高50%的飽和度。培養(yǎng)基中氧飽和度通過氣體供應(yīng)和攪拌速度自動調(diào)節(jié)。
[0062]優(yōu)選的是糖、糖醇、有機(jī)酸或含糖植物水解產(chǎn)物作為碳源。根據(jù)本發(fā)明方法，特別優(yōu)選的是利用葡萄糖、果糖、乳糖、丙三醇或包含兩種或更多種這類化合物的混合物作為碳源。
[0063]碳源優(yōu)選地加入至培養(yǎng)基，使得在發(fā)酵罐中碳源的含量在生產(chǎn)期不超過10g/l。優(yōu)選的最大濃度是2g/l。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選地利用氨、銨或蛋白水解物作為氮源。當(dāng)利用氨作為用于穩(wěn)定PH值的修正方法時(shí)，通常在發(fā)酵期間加入該氮源。
[0065]可以加入磷、氯、鈉、鎂、氮、鉀、鈣、鐵元素的鹽以及痕量即μ M濃度的元素鑰、硼、鈷、鎂、鋅和鎳元素的鹽作為進(jìn)一步的培養(yǎng)基增補(bǔ)物。
[0066]此外，有機(jī)酸(如醋酸、檸檬酸)、氨基酸(例如L-谷氨酸、L-半胱氨酸)和維生素(例如，Β1、Β6)可以加入培養(yǎng)基。
[0067]L-谷氨酸在這種情況下，可以直接用作酸或以其鹽的形式，如谷氨酸鉀或谷氨酸鈉，單獨(dú)或作為混合物使用。優(yōu)選的是利用谷氨酸鉀。
[0068]使用的復(fù)合營養(yǎng)源可以是酵母提取物、玉米浸液、大豆粉或麥芽提取物。
[0069]嗜溫微生物如大腸桿菌的培養(yǎng)溫度優(yōu)選地是15至45°C，特別優(yōu)選地是30至37。。。
[0070]本發(fā)明的發(fā)酵方法的生產(chǎn)期始于Y-谷氨酰半胱氨酸、雙-Y-谷氨酰胱氨酸或Y-谷氨酰胱氨酸可以首先在培養(yǎng)液(培養(yǎng)肉湯，culture broth)中檢測到的時(shí)間點(diǎn)。這個(gè)階段通常始于經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的生產(chǎn)發(fā)酵罐接種后的約8-12小時(shí)。
[0071]根據(jù)在分批或補(bǔ)料分批過程中描述的方法，微生物在培養(yǎng)時(shí)間至少48小時(shí)后，高效地分泌Y-谷氨酰半胱氨酸和化合物Y-谷氨酰胱氨酸及衍生于其的化合物雙-Y-谷氨酰胱氨酸至發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0072]在本發(fā)明的上下文中，Y-谷氨酰胱氨酸的過量生產(chǎn)優(yōu)選地理解為，相對于相應(yīng)的野生型、母株或未改變的菌株，微生物菌株產(chǎn)生更多Y-谷氨酰半胱氨酸或其衍生物Y-谷氨酰胱氨酸和雙-Y-谷氨酰胱氨酸的能力。這通常表現(xiàn)為Y-谷氨酰半胱氨酸、Y-谷氨酰胱氨酸和/或雙-Y-谷氨酰胱氨酸在培養(yǎng)基中的富集。存在Y-谷氨酰半胱氨酸的過量生產(chǎn)，因此，如果在相關(guān)微生物菌株中的發(fā)酵結(jié)束時(shí)，可在培養(yǎng)液中檢測到最少0.2g/l的“總Y -谷氨酰半胱氨酸”(Y -谷氨酰半胱氨酸+ Y-谷氨酰胱氨酸+雙-Y -谷氨酰胱氨酸)產(chǎn)量。培養(yǎng)基中“總Y-谷氨酰半胱氨酸”的產(chǎn)量優(yōu)選地在3至23g/l的范圍內(nèi)，正如在表3和表4中列出的本發(fā)明的微生物可獲得的。關(guān)于建立經(jīng)濟(jì)的方法特別優(yōu)選地是，在培養(yǎng)基中范圍在10至23g/l的“總Y-谷氨酰半胱氨酸”產(chǎn)量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0073]圖1示出了質(zhì)粒pACYC184-LH的限制和功能圖譜。
[0074]圖2示出了 pgshAp-gshA?的限制和功能圖譜。
[0075]圖3示出了 ptufB的限制和功能圖譜。
[0076]圖4示出了 ptufBp_gshAATG的限制和功能圖譜。
[0077]圖5示出了 pgshAATG_serA2040的限制和功能圖譜。
[0078]圖6示出了 ppgshAATG_cysE14的限制和功能圖譜。
[0079]圖7示出了 pgshAATG-cysE14-serA2040的限制和功能圖譜。
[0080]圖8示出了 pgshAATG-serA2040_orf306的限制和功能圖譜。
[0081]圖9示出了 pgshAATG-cysE14_orf306的限制和功能圖譜。
[0082]圖10 不出了 pgshAATG-cysE14-serA2040_orf306 的限制和功能圖譜。
[0083]圖11示出了 A)未處理的(氧化的)樣品和B)使用DTT處理的(還原的)樣品的HPLC色譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0084]下列實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明:
[0085]實(shí)施例1:在大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)中基因gshB缺失(谷胱甘肽合成酶失活)。
[0086]根據(jù)由 Datsenko 和 Wanner((Datsenko and Wanner, 2000,P.N.A.S.97:6640-6645)研發(fā)的“ Λ -Red方法”，將大腸桿菌中編碼酶谷胱甘肽合成酶(GshB)的基因gshB在大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)中刪除。編碼卡那霉素耐性標(biāo)記(kanR)的 DNA 片段利用引物 gshB-del-for (SEQ ID N0.5)和 gshB-del-rev (SEQ ID N0.6)擴(kuò)增。
[0087]引物gshB-del-for編碼由30個(gè)核苷組成的序列(其與gshB基因的5’-端同源)和包括20個(gè)核苷的序列(與在質(zhì)粒pKD13(大腸桿菌遺傳庫存中心(Coli Genetic StockCenter, CGSC)編號7633)上編碼一個(gè)或兩個(gè)FRT位點(diǎn)(FLP的識別靶標(biāo))的DNA序列互補(bǔ))。引物gshB-del-rev編碼由30個(gè)核苷組成的序列(與gshB基因的3’-端同源)和包括20個(gè)核苷的序列(與在質(zhì)粒pKD13上編碼第二 FRT位點(diǎn)的DNA序列互補(bǔ))。
[0088]如US5972663A的實(shí)施例2描述的，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過電穿孔到大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)的方法轉(zhuǎn)化。在包含50mg/l的卡那霉素的LB瓊脂板上挑選轉(zhuǎn)化的gshB-缺陷細(xì)胞。標(biāo)記基因(卡那霉素耐性，kanR)從FLP重組酶上移除，F(xiàn)LP重組酶在質(zhì)粒pCP20(CGSC編號7629)上編碼。由于溫度敏感性“復(fù)制起點(diǎn)”(ori)，質(zhì)粒pCP20可在通過在43°C培養(yǎng)的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化之后再次移除。以這種方式產(chǎn)生的大腸桿菌gshB缺失菌株稱為 W3110 Λ gshB。
[0089]實(shí)施例2:擴(kuò)增具有其自身啟動子的gshA基因
[0090]已知在大腸桿菌中的gshA基因的啟動子序列(Watanabe et al., 1986, NucleicAcids Res.14:4393-4400)。編碼大腸桿菌的gshA基因和gshA啟動子(gshAp)的DNA片段通過PCR擴(kuò)增。編碼gshA基因的啟動子序列的DNA片段利用引物gshAp-gshA-for (SEQID N0.7)和 gshAp-gshA-rev (SEQ ID N0.8)擴(kuò)增。大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC27325)的染色體DNA作為模板用于PCR反應(yīng)。
[0091]大約1.9kb大小的PCR片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化并按照廠商的說明書，利用“QIA 快速凝膠提取試劑盒(QIAquick Gel Extract1n Kit) ” (Qiagen GmbH, Hi I den, D)從瓊脂糖凝膠分離。純化的PCR片段利用限制性酶XbaI消化并在_20°C下存儲。
[0092]實(shí)施例3:gshA基因的擴(kuò)增和突變
[0093]A、gshA基因的擴(kuò)增
[0094]通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌的gshA基因。大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)的染色體DNA作為模板用于PCR反應(yīng)。Taq聚合酶(Qiagen GmbH)用于擴(kuò)增，其在PCR產(chǎn)物各自的3’ -端連接另外的腺嘌呤。在gshA擴(kuò)增期間，非常見起始密碼子TTG通過利用合適的引物，被起始密碼子 ATG 替換。寡核苷 gshA-0E-for (SEQ ID N0.9)和 gshA-OE-rev (SEQ IDN0.10)作為特異性引物。
[0095]產(chǎn)生的1.6kb大小的DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化并利用“QIA快速凝膠提取試劑盒”(Qiagen GmbH)從瓊脂糖凝膠分離。擴(kuò)增和純化的PCR產(chǎn)物和載體pCR2.1-T0P0(Life Technologies,Life Technologies GmbH,Darmstadt,D)的連接根據(jù)廠商的說明書(Life Technologies GmbH),利用 “TΟΡΟ? TA Cloning? Kit with PCR?!
2.1 TOPO?”通過“TA克隆”進(jìn)行。
[0096]連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入“DH5 a ?-TlR大腸桿菌細(xì)胞”(Life Technologies)，在這些細(xì)胞中增殖并且，隨后分離質(zhì)粒，質(zhì)粒的序列通過測序確定。產(chǎn)生的具有期望序列的構(gòu)建體稱為 pCR2.1-gshA。
[0097]B、gshA基因的突變發(fā)生
[0098]對于gshA的再克隆(recloning),在gshA基因中的兩個(gè)干擾限制位點(diǎn)EcoRI和BglII最初通過定向突變的方法移除。誘變反應(yīng)根據(jù)廠商的說明書，利用“GeneTailor?定點(diǎn)誘變系統(tǒng)”(Life Technologies GmbH)進(jìn)行。對第一種突變，質(zhì)粒pCR2.Ι-gshA作為模板。誘變引物 gshA-EcoRImut-for (SEQ ID N0.11)和 gshA-EcoRImut-rev (SEQ ID N0.12)用于移除在gshA基因中的EcoRI酶切位點(diǎn)。在EcoRI酶切位點(diǎn)上進(jìn)行的gshA基因的誘變之后，誘變反應(yīng)的部分再次轉(zhuǎn)化到來自Life Technologies的“DH5 a ?_T1R大腸桿菌細(xì)胞”中并在這些細(xì)胞中增殖。制備質(zhì)粒后，分離質(zhì)粒的DNA序列通過測序確定。產(chǎn)生的在gshA基因中有正確DNA序列而不帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的構(gòu)建體稱為pCR2.l-gShA_mutl。
[0099]進(jìn)行相似的方法用于移除pCR2.l-gshA_mutl的gshA基因中BglII酶切位點(diǎn)，只有誘變引物 gshA-Bglllmut-for (SEQ ID N0.13)和 gshA-Bglllmut-rev (SEQ ID N0.14)用于誘變反應(yīng)。
[0100]第二誘變反應(yīng)的部分再次轉(zhuǎn)化到“DH5 a ?-TlR大腸桿菌細(xì)胞”中(LifeTechnologies GmbH),在這些細(xì)胞中增殖,并且隨后再次制備質(zhì)粒，分離質(zhì)粒的DNA序列通過測序確定。產(chǎn)生的在gshA基因中有正確DNA序列而不帶有EcoRI和BglII酶切位點(diǎn)的構(gòu)建體稱為 pCR2.l_gshA_mut2。
[0101]實(shí)施例4:擴(kuò)增編碼tufB啟動子(PtufB)的DNA片段
[0102]為了有效轉(zhuǎn)錄(過表達(dá))gshA基因，使用tRNA-tufB操縱子的激活區(qū)(Lee etal.，1981，Cell25:251-258)。在大腸桿菌中的該操縱子編碼結(jié)構(gòu)基因thrU、tyrU、glyT和thrT,并且也編碼“蛋白鏈延長因子(Elongat1n Factor)EF-Tu”(TufB)蛋白。所需的啟動子序列利用寡核苷 tufBp-for (SEQ ID N0.15)和 tufBp-rev(SEQ ID N0.16)擴(kuò)增。大腸桿菌菌株W3110 (ATCC27325)的基因組DNA可再次作為模板。DNA片段通過瓊脂糖凝膠電泳純化并利用“QIA快速凝膠提取試劑盒”(Qiagen GmbH)從瓊脂糖凝膠分離。純化的PCR片段利用限制性酶XbaI消化并在_20°C下存儲。
[0103]實(shí)施例5:用于gshA過表達(dá)的質(zhì)粒的構(gòu)建體(gshA質(zhì)粒)
[0104]質(zhì)粒pACYC184-LH作為基礎(chǔ)質(zhì)粒用于根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒的構(gòu)建。圖1示出了質(zhì)粒PACYC184-LH的限制和功能圖譜。除了 XbaI識別序列，質(zhì)粒pACYC184_LH利用下列限制性位點(diǎn)也編碼多聚接頭區(qū):
[0105]Notl-Ncol-Scal-Nsil-Mlul-Pacl-Notl。
[0106]A、具有其自身啟動子的gshA基因的克隆
[0107]最初，描述于實(shí)施例2并且利用其自身啟動子和稀有起始密碼子TTG編碼gshA基因的利用XbaI消化的PCR產(chǎn)物，被克隆至pACYC184-LH的XbaI酶切位點(diǎn)。連接混合物轉(zhuǎn)化到“DH5 a ?-TlR大腸桿菌細(xì)胞”(Life Technologies GmbH)，在這些細(xì)胞中增殖并且，分離質(zhì)粒的DNA序列通過測序確定。產(chǎn)生的構(gòu)建體稱為pgshAp-gshA?(見圖2)。
[0108]B、turf B啟動子的克隆
[0109]PCR產(chǎn)物利用XbaI消化，描述于實(shí)施例4，并且編碼turfB啟動子(turfBp)，也將其克隆至PACYC184-LH的XbaI酶切位點(diǎn)。連接混合物轉(zhuǎn)化到“DH5 a ?-TlR大腸桿菌細(xì)胞”(Life Technologies),在這些細(xì)胞中增殖并且,分離質(zhì)粒的序列通過測序確定。產(chǎn)生的構(gòu)建體稱為pACYC184-tufBp。
[0110]C、tufB啟動子的優(yōu)化
[0111]質(zhì)粒PACYC184-tufBp作為模板在天然tufB啟動子的DNA序列上進(jìn)行總共3次優(yōu)化(誘變)。通過“GeneTailor?定點(diǎn)誘變系統(tǒng)”(Life Technologies GmbH),優(yōu)化核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、tufB啟動子的-10區(qū)和-35區(qū)，以便其最終編碼這些原核啟動子元件(見表1)的相應(yīng)的共有性序列。
[0112]表1:RBS的DNA序列的比較，具有上述相應(yīng)共有序列的tufB啟動子的-10區(qū)和-35區(qū)。變異的核苷以粗體強(qiáng)調(diào)。
[0113]
元件在tufB啟動子中共有序歹Li_

RBS V -ACTTGG - 3’_5’ -AGGAGG - 3’

-1 0 區(qū)-5，-TAGAAT _ 3，5? -TATAAT _ 3，

-35 區(qū)丨5，-TTGCAT - 3， 丨5，-TTGACA - 3，
[0114]使用誘變引物tufBp-RBSopt-for(SEQ ID N0.17)和 tufBp-RBSopt-rev (SEQ IDN0.18)，通過定點(diǎn)誘變質(zhì)粒pACYC184-tufBp上的tufB啟動子優(yōu)化RBS。
[0115]利用“GeneTailor? 定點(diǎn)誘變系統(tǒng)”(Life Technologies)，在 tufB 啟動子的 RBS上進(jìn)行誘變反應(yīng)之后，誘變反應(yīng)的部分再次轉(zhuǎn)化到“DH5aTM-TlR大腸桿菌細(xì)胞”中(LifeTechnologiesGmbH),在這些細(xì)胞中增殖,制備質(zhì)粒后，分離質(zhì)粒的DNA序列通過測序確定。產(chǎn)生的具有正確的DNA序列以及優(yōu)化的RBS序列的構(gòu)建體稱為PACYClS^tufBp-RBStjpttj
[0116]僅當(dāng)引物tufBp-10Qpt-for(SEQ ID N0.19)和 tufBp-10_-rev (SEQ ID N0.20)用于誘變時(shí)，使用相似的方法以優(yōu)化(誘變)基于pACYC184-tufBp-RBSopt的-10區(qū)。
[0117]形成的并通過利用優(yōu)化的RBS和-10區(qū)測序檢測的質(zhì)粒稱為pACYC184-tufBp (RBS-10)
[0118]質(zhì)粒pACYC184-tufBp (RBS-10) opt 再次作為模板利用引物 tufBp-35_-for (SEQ IDN0.21)和 tufBp-35Qpt-rev (SEQ ID N0.22)用于-35 區(qū)的誘變。
[0119]形成的并通過利用優(yōu)化的RBS、_10區(qū)和-35區(qū)的測序檢測的質(zhì)粒稱為ptufBp。產(chǎn)生的質(zhì)粒PtufBp的限制和功能圖譜如圖3所示。
[0120]D、在ptufBp的優(yōu)化tufB啟動子后，克隆具有優(yōu)化的起始密碼子的gshA基因
[0121]具有起始密碼子ATG的誘變gshA基因描述于實(shí)施例3，利用酶EcoRI和BglII，通過限制性酶切，從質(zhì)粒PCR2.l-gshA_mut2中移除，并利用EcoRI和Bglll，再次克隆至載體ptufBpο
[0122]產(chǎn)生的構(gòu)建體ptufBp-gshAATG (見圖4)轉(zhuǎn)化到“DH5 a ?_T1R大腸桿菌細(xì)胞”(LifeTechnologies)，在這些細(xì)胞中增殖，并且分離質(zhì)粒的DNA序列，質(zhì)粒的序列通過測序確定。
[0123]實(shí)施例6:利用serA和/或cysE等位基因以及orf306 ( = orf299、ydeD或eamA)延長gshA表達(dá)質(zhì)粒ptufBp-gshAATG
[0124]為研究提高的L-半胱氨酸合成酶對Y-谷氨酰半胱氨酸產(chǎn)量的影響，利用serA和 / 或 cysE 等位基因以及 orf306 ( = orf299、eamA 或 ydeD)延長質(zhì)粒 ptufBp-gshAATG。
[0125]A、利用serA等位基因延長質(zhì)粒ptufBp-gshAATG
[0126]為延長具有特定serA等位基因的質(zhì)粒ptufBp-gshAATG, serA基因最初利用其天然啟動子通過PCR擴(kuò)增。大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)的染色體DNA作為模板用于PCR反應(yīng)。寡核苷 serA-Nco1-for(SEQ ID.N0.23)和 serA-Sac1-rev (SEQ ID N0.24)用于 PCR反應(yīng)。
[0127]包括其自身啟動子的擴(kuò)增的serA基因隨后利用酶NcoI和SacI消化，隨后在瓊脂糖凝膠上純化，利用NcoI和SacI酶切連接至ptufBp-gshAATG載體。
[0128]連接混合物轉(zhuǎn)化到“DH5a?-TlR大腸桿菌細(xì)胞”(Life Technologies GmbH)中，在這些細(xì)胞中增殖，并且分離質(zhì)粒的DNA序列通過測序確定。在天然啟動子的控制下具有serA的來自該克隆的gshA質(zhì)粒稱為ptufBp-gshAATG_serA。進(jìn)行如EP1496111B1中實(shí)施例2的過程，以產(chǎn)生編碼對L-絲氨酸具有反饋耐受的SerA變體的各種serA等位基因，除了作為模板的質(zhì)粒ptufBp-gshAATG-serA用于改變在pFL209處的密碼子349和/或372。來自具有不同serA等位基因的誘變的gshA質(zhì)粒稱為ptufBp-gshAATG_serA...,此處...對應(yīng)于各自的serA等位基因序號(見圖5ptufBp-gshAATG_serA2040)。
[0129]B、延伸具有cysE等位基因的質(zhì)粒ptufBp-gshAATG
[0130]為延伸具有特定cysE等位基因的質(zhì)粒ptufBp-gshAATG，W09715673的實(shí)施例6公開的質(zhì)粒pACYC184/cysE…中的一種(表7)最初利用NsiI和NcoI酶解消化。在天然cysE啟動子的控制下編碼特定的cysE等位基因的各自約1.0kb大小的片段在瓊脂糖凝膠上純化，隨后連接至利用NcoI和SacI線性化的ptufBp-gshAATe載體。來自該克隆的具有不同的cysE等位基因的gshA質(zhì)粒稱為ptufBp-gshAATG_cysE...,此處...對應(yīng)于各自cysE等位基因的序號(見圖 6ptufBp-gshAATG-cysE14)。
[0131]C、利用cysE等位基因延伸質(zhì)粒ptufBp-gshAATG_ser
[0132]為延伸具有特定cySE等位基因的質(zhì)粒？丨肛81)181^;^-86^丨，109715673的實(shí)施例6公開的質(zhì)粒pACYC184/cysE…中的一種(表7)最初利用SacI和NsiI酶解消化。對應(yīng)的約1.0kb大小的片段在瓊脂糖凝膠上純化，隨后連接至利用SacI和NsiI線性化的ptufBp-gshAATG-serA…載體。來自具有不同cysE和serA等位基因的變異的gshA質(zhì)粒稱為
ptufBp-gshAATG-cysE----serA…，此處...對應(yīng)于各自的serA等位基因序號(見圖7ptufBp
-gshAATG-cysE14-serA2040)。
[0133] D、利用 orf306 延伸質(zhì)粒 ptufBp-gshAATG-serA...、ptufBp-gshAATG_cysE…和ptufBp-gshAATG-cysE----serA...。
[0134]利用orf306 延伸相應(yīng)的質(zhì)粒 ptufBp-gshAATG, ptufBp-gshAATG_serA…、
ptufBp-gshAATG-cysE...和 ptufBp-gshAATG_cysE----serA…，EP885962B1 實(shí)施例 2 中公開的質(zhì)粒pACYC184/cysEIV-GAPDH-0RF306最初利用NsiI和PacI消化。編碼O-乙酰絲氨酸/半胱氨酸輸出蛋白(EamA、YdeD)的約1.2kb大小的片段在瓊脂糖凝膠上純化，隨后連接至利用 NsiI 和 PacI 線性化的 ptufBp-ptufBp-gshAATG-serA...、gshAATG_cysE…或
ptufBp-gshAATG-cysE----serA…載體之一。在GAPDH啟動子控制下來自該具有orf306的克隆的 gshA 質(zhì)粒稱為 ptufBp-gshAATG_serA----orf306、ptufBp-gshAATG-cysE----orf306 和ptufBp-gshAATG_cysE…serA----orf306,此處...對應(yīng)于各自的cysE或serA等位基因序號
(見圖 8ptufBp-gshAATG-serA2040_orf306、圖 9ptufBp-gshAATG-cysE14_orf306、以及圖1OptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040-orf306)。
[0135]實(shí)施例7:大腸桿菌菌株W3110(ATCC27325)和W3110 Λ gshB的轉(zhuǎn)化
[0136]如已在實(shí)施例1中描述的，質(zhì)粒pACYC184-LH作為陰性對照，將gshA表達(dá)質(zhì)粒 pgshAp-gshATTG、ptufBp-gshAATG> ptufBp-gshAATG-serA2040> ptufBp-gshAATG-cysE14>ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040> ptufBp-gshAATG-serA2040-orf306>ptufBp-gshAATG-cysE14-orf306 和 ptufBp-gshAATG-cysE14-serA2040_orf306 通過電穿孔法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌株菌W3110(ATCC27325)以及W3110 Λ gshB中。在包含15mg/l四環(huán)素的LB瓊脂糖平板上進(jìn)行帶質(zhì)粒細(xì)胞的篩選。
[0137]實(shí)施例8: Y -谷氨酰半胱氨酸及其衍生物的分析
[0138]術(shù)語“總Y-谷氨酰半胱氨酸”包括Y-谷氨酰半胱氨酸以及由其形成的氧化產(chǎn)物雙-Y-谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸，三者在發(fā)酵期間形成并積累在上清液中?！翱?br> Y-谷氨酰半胱氨酸”的濃度通過HPLC分析測定。
[0139]A、樣品的預(yù)處理
[0140]為測量發(fā)酵罐的樣品，微生物最初通過離心步驟以及隨后的發(fā)酵液除菌過濾而除去。
[0141]為了精確測定“總Y-谷氨酰半胱氨酸濃度”，樣品中待測定的Y-谷氨酰半胱氨酸衍生物在二硫蘇糖醇(DTT)摩爾過量下進(jìn)行還原，在室溫22°C保持I小時(shí)。由于DDT的還原作用僅在中性至堿性PH條件下充分發(fā)揮，樣品的pH，如果必要，利用濃縮的含水氫氧化鉀溶液(KOH)預(yù)先調(diào)至pH>7.0。
[0142]B、HPLC 分析
[0143]在利用去離子水制備相應(yīng)的稀釋液后，在20 °C利用Synergi 4 μ mHydro-RP250x4.6mm 柱進(jìn)行 HPLC 分析(Phenomenex Ltd., Aschaffenburg, D)。使用 0.5%(v/v)磷酸㈧和乙腈⑶作為洗脫液。
[0144]使用下列HPLC法用于從無細(xì)胞和還原物混合物中分離Y -谷氨酰半胱氨酸。
[0145].流速=0.5ml/min
[0146]?在 200nm 使用二極管陣列檢測器(d1de array detector, DAD)檢測
[0147].在 100% A 下等度(isocratically)進(jìn)行分離
[0148]每次操作后通過利用100% B的潤洗步驟清潔柱。
[0149]使用來自Sigma Aldrich GmbH(Steinheim, D)的還原性Y-谷氨酰半胱氨酸作為參照物，用于確定Y-谷氨酰半胱氨酸的滯留時(shí)間和待測樣品的最終濃度?！翱俌-谷氨酰半胱氨酸”的濃度由在色譜圖的峰面積計(jì)算。
[0150]實(shí)施例9: Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的確定
[0151]為確定Y -谷氨酰胺半胱氨活性合成酶的活性，在補(bǔ)充有15g/l葡萄糖、5mg/l維生素 B1 和 15mg/l 四環(huán)素的 30ml 的 SMl 培養(yǎng)基(12g/l K2HPO4,3g/1 KH2PO4,5g/1 (NH4)2SO4'0.3g/l MgS04x7H20、0.015g/l CaCl2x2H20、0.002g/l FeS04x7H20、lg/1 檸檬酸三鈉 x2H20、0.lg/1 NaCl ；lml/l 由 0.15g/l Na2Mo04x2H20、2.5g/l H3B03、0.7g/l CoC12x6H20、0.25g/1CuS04x5H20U.6g/l MnCl2x4H20、0.3g/l ZnS04x7H20 組成的微量元素溶液)中，接種 2ml 表2列出的菌株的過夜培養(yǎng)基。基于在600nm(0D_)的最初光密度0.025，整個(gè)30ml批料在30°C及135rpm下持續(xù)16小時(shí)。
[0152]隨后細(xì)胞通過離心收集，沖洗并在2ml的緩沖液(10mM Tris-HCl pH 8.2)中重懸。細(xì)胞通過弗氏壓碎器(French Press) (Spectronic Instruments, Inc.Rochester, NY, USA)在124106千帕壓力下破裂。通過在30000g下離心澄清粗提物并且基于Y-谷氨酰半胱氨酸隨時(shí)間的形成測定Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性。Y-谷氨酰半胱氨酸形成測試下的反應(yīng)混合物由以下各項(xiàng)組成:
[0153]10mM Tris-HCl pH8.2 ; 1mM 葡萄糖酸鉀；10mM L-半胱氨酸；20mM MgCl2 ；150mMKCl ；20mM ATP和0.25至4mg/ml粗提蛋白。來自Y -半胱氨酸和葡萄糖酸鉀的ATP-依賴性形成的Y-谷氨酰半胱氨酸由另外的粗提蛋白引發(fā)。反應(yīng)混合物的等分(20μ I至50μ I)在至少2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)移除。隨后在70°C保持5分鐘，Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性在樣品(等分)中失活，并且形成的Y-谷氨酰半胱氨酸的內(nèi)含物通過HPLC測定(見實(shí)施例8)。Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶的單位對應(yīng)酶的數(shù)量，所述酶在25°C下，每分鐘形成I微摩爾Y-谷氨酰半胱氨酸。
[0154]表2:具有質(zhì)粒-編碼的gshA過表達(dá)的研究gshB缺失菌株的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶活性
[0155]

【權(quán)利要求】
1.一種能夠過量生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸、雙-Y-谷氨酰胱氨酸和Y-谷氨酰胱氨酸的原核微生物菌株，由母株制備，其中，相對于所述母株，所述菌株具有降低的細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性，并且具有細(xì)胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，相比于具有相似降低的細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性的菌株，所述菌株具有的所述細(xì)胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性更大地提聞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌株，其中，根據(jù)本發(fā)明所述的菌株中所述谷胱甘肽合成酶活性降低以使所述活性最高是相應(yīng)野生型菌株的谷胱甘肽合成酶活性的50%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，所述細(xì)胞Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性高于具有相似降低的細(xì)胞谷胱甘肽合成酶活性的菌株至少約5倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，所述母株是大腸桿菌(Escherichiacoli)或菠蘿泛菌(Pantoea ananatis)菌株的成員。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，相對于相應(yīng)母株，所述母株是具有Y-谷氨酰半胱氨酸生物合成途徑以及提高的L-半胱氨酸生物合成能力的微生物菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，通過提高gshA基因或gshA同源基因的拷貝數(shù)或通過使用致使gshA表達(dá)增加的啟動子，達(dá)到升高的所述Y-谷氨酰半胱氨合成酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，通過在啟動子控制下克隆至質(zhì)粒載體來提高gshA或gshA同 源基因的拷貝數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，GshA具有以下蛋白序列:在第494位的氨基酸丙氨酸已被置換為纈氨酸或亮氨酸(A494V或A494L)，或者在第495位的氨基酸絲氨酸已被置換為蘇氨酸(S495T)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物菌株，其中，所述gshA基因的天然起始密碼子TTG已被ATG替換。
10.一種用于過量生產(chǎn)Y-谷氨酰半胱氨酸(YGC)以及該二肽的衍生物Y-谷氨酰胱氨酸和雙-Y-谷氨酰胱氨酸的方法，其中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的微生物菌株，從所述培養(yǎng)基中除去細(xì)胞，并從所述培養(yǎng)基中純化所需產(chǎn)物。
【文檔編號】C12R1/01GK104164381SQ201410191775
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月17日
【發(fā)明者】馬塞爾·托恩, 托馬斯·施勒澤爾 申請人:瓦克化學(xué)股份公司