一種蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法及其使用的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及植物病毒的檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種蘋(píng)果病毒的檢測(cè)方法。蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法以巰基標(biāo)記的DNA和熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA作為探針，二者雜交形成雙鏈DNA，雙鏈DNA探針組裝在納米金顆粒上構(gòu)建納米金核酸探針，通過(guò)雙鏈取代的方式檢測(cè)植物病毒并對(duì)堿基突變序列進(jìn)行區(qū)分。該發(fā)明融合了納米技術(shù)與生物技術(shù)，帶來(lái)領(lǐng)域上的突破。納米顆粒具有較大的比表面積，可連接多個(gè)雙鏈DNA分子，使探針具有極高的靈敏度。納米顆粒上帶有多個(gè)特異探針，與病毒核酸保守區(qū)域互補(bǔ)雜交，因而對(duì)病毒具有較高的特異性，且整個(gè)檢測(cè)步驟簡(jiǎn)潔，過(guò)程中使用的溶液等對(duì)人體無(wú)害，操作方便，使用安全，檢測(cè)效率高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法及其使用的檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物病毒的檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種蘋(píng)果病毒的檢測(cè)方法及其使用的檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]植物病毒病害難以用化學(xué)藥劑進(jìn)行有效的預(yù)防或控制，其擴(kuò)展蔓延速度之快，危害之重，已超過(guò)真菌、細(xì)菌病害。從根本上講，防治植物病毒病害發(fā)生最有效的方法是傳播的預(yù)防，而檢測(cè)是預(yù)防的關(guān)鍵。因此，發(fā)展一種高效靈敏、快速準(zhǔn)確的植物病毒檢測(cè)方法成為研究的首要問(wèn)題。
[0003]目前植物病毒的檢測(cè)方法很多，歸納起來(lái)主要有兩類(lèi):酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和分子生物學(xué)方法,但這兩種方法都存在著一些不足之處。ELISA法檢測(cè)植物病毒時(shí)，靈敏度較低，操作手續(xù)較為繁瑣，而且因蛋白質(zhì)的熱變性容易造成漏檢。分子生物學(xué)方法中普遍采用PCR法。PCR法是特異性擴(kuò)增植物病毒中的保守核酸序列從而達(dá)到檢測(cè)的目的，運(yùn)用PCR技術(shù)可使樣品DNA中存在的僅有一個(gè)拷貝的特定核苷酸片段得到大量擴(kuò)增，用于植物病毒的鑒定與分類(lèi)，該法靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便，當(dāng)樣品病毒含量低，ELISA法難以檢出時(shí)，此法往往能得到滿意的效果。但是該方法容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性結(jié)果，而且電泳中所使用的嗅化乙錠(ethidiumbromide,EB)對(duì)操作人員有毒害作用。因此，發(fā)展一種安全、價(jià)格低廉、方便實(shí)用的新型植物病毒檢測(cè)方法是許多科學(xué)家的夢(mèng)想和目標(biāo)。
[0004]本發(fā)明以標(biāo)記的DNA雜交形成雙鏈，通過(guò)雙鏈取代的方式檢測(cè)植物病毒，從而建立一種價(jià)格低廉、對(duì)植物病毒具有高靈敏度和高特異性的檢測(cè)試劑盒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是要解決現(xiàn)有技術(shù)靈敏度低、操作繁瑣、易漏檢、易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和假陽(yáng)性結(jié)果的缺陷，利用納米金的超猝滅性、DNA雜交和雙鏈取代的特性，提供一種高靈敏度、高特異性、方便實(shí)用、安全的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法及其使用的檢測(cè)試劑盒。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0007]蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，特殊之處在于以巰基標(biāo)記的DNA作為捕獲探針，以熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA作為信號(hào)探針，二者雜交形成雙鏈DNA，雙鏈DNA探針組裝在納米金顆粒上構(gòu)建納米金核酸探針，通過(guò)雙鏈取代的方式檢測(cè)植物病毒并對(duì)堿基突變序列進(jìn)行區(qū)分。
[0008]該方法具體包括以下步驟:
[0009](I).以疏基標(biāo)記的DNA作捕獲探針、突光基團(tuán)標(biāo)記的DNA作為/[目號(hào)探針,_■者在雜交緩沖液中雜交形成雙鏈DNA溶液；
[0010](2).步驟(I)制得的雙鏈DNA溶液與納米金溶液混合，雙鏈DNA通過(guò)Au-S共價(jià)鍵連接至納米金表面，制得納米金核酸探針溶液；
[0011](3).步驟⑵中制得的納米金核酸探針溶液與檢測(cè)緩沖液混合，納米金的終濃度為 l_2nmol/L ；
[0012](4).將步驟(3)中所得混合液中添加人工合成蘋(píng)果病毒寡核苷酸或待測(cè)蘋(píng)果樣本的RNA提取液，觀察熒光現(xiàn)象，完成對(duì)蘋(píng)果病毒的識(shí)別。
[0013]所述雜交緩沖液為濃度為0.005-0.015mol/L的磷酸鹽緩沖液，其pH為7.2-7.5，并包括0.135-0.138mol/L的NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl ;所述檢測(cè)緩沖液為濃度為0.005-0.015mol/L 的磷酸鹽溶液，其 pH 為 7.2-7.5，并包括 0.05-0.15mol/L 的 NaCl 和0.5-1.Smmol /I,的 MgCl20
[0014]所述巰基標(biāo)記的DNA捕獲探針和熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA信號(hào)探針按1: 1.1一1:1.3的濃度比雜交。
[0015]所述巰基標(biāo)記的DNA捕獲探針，其巰基標(biāo)記在3’端，包括21個(gè)核苷酸與靶序列互補(bǔ)的識(shí)別序列和9個(gè)腺嘌呤㈧；所述熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA探針，其熒光基團(tuán)標(biāo)記在5’端，包括10個(gè)核苷酸，與巰基標(biāo)記的DNA探針的一部分完全互補(bǔ)，且互補(bǔ)堿基的部分從巰基標(biāo)記的DNA探針的鄰近9個(gè)連續(xù)A的第一個(gè)核苷酸開(kāi)始；所述熒光基團(tuán)為FAM羧基熒光素或花青染料Cy3。
[0016]所述雙鏈DNA溶液與納米金溶液按照298:1— 302:1的濃度比合成納米金核酸探針溶液，每個(gè)納米金顆粒表面組裝40-50個(gè)雙鏈DNA分子，其包括30個(gè)巰基標(biāo)記的DNA捕獲探針和10個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA信號(hào)探針。
[0017]所述納米金核酸探針溶液與檢測(cè)緩沖液按照1:2的體積比混合。
[0018]所述納米金的粒度為13-15nm，濃度為3nmol/L。
[0019]該檢測(cè)方法所使用的檢測(cè)試劑盒，其特殊之處在于包括上述方法制備的納米金核酸探針溶液，盒內(nèi)還設(shè)有檢測(cè)緩沖液、人工合成蘋(píng)果病毒寡核苷酸粉末。
[0020]所述納米金蘋(píng)果病毒核酸探針溶液包括納米金蘋(píng)果莖溝病毒核酸探針溶液和納米金蘋(píng)果花葉病毒核酸探針溶液。
[0021]該發(fā)明融合了納米技術(shù)與生物技術(shù)，帶來(lái)領(lǐng)域上的突破。納米顆粒具有較大的比表面積，可連接多個(gè)雙鏈DNA分子，使探針具有極高的靈敏度。納米顆粒上帶有多個(gè)特異探針，與病毒核酸保守區(qū)域互補(bǔ)雜交，因而對(duì)病毒具有較高的特異性，且整個(gè)檢測(cè)步驟簡(jiǎn)潔，過(guò)程中使用的溶液等對(duì)人體無(wú)害，操作方便，使用安全，檢測(cè)效率高。具體效果主要體現(xiàn)在以下5個(gè)方面。
[0022]1、該發(fā)明集中了生物學(xué)和化學(xué)的優(yōu)勢(shì)力量，將納米技術(shù)與生物技術(shù)相融合，首次將該技術(shù)應(yīng)用在蘋(píng)果病毒檢測(cè)上，為植物病害防治開(kāi)辟新的方向、帶來(lái)新的突破。
[0023]2、納米顆粒的分散性使其具有較大的比表面積，一個(gè)納米金上可以連接多個(gè)雙鏈DNA分子。因此，該探針具有極高的靈敏度，可以檢測(cè)納摩爾級(jí)的標(biāo)靶。
[0024]3、每個(gè)納米顆粒上都帶有多個(gè)特異探針，通過(guò)探針與病毒核酸高度保守區(qū)域互補(bǔ)雜交，使探針具有很高的特異性，甚至對(duì)單堿基的差異都能夠精確辨別，有效避免以往檢測(cè)過(guò)程中的假陽(yáng)性問(wèn)題。
[0025]4、本發(fā)明蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法直接將探針與病毒核酸提取液雜交進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間不超過(guò)20分鐘，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快。
[0026]5、由于DNA探針的設(shè)計(jì)靈活、合成簡(jiǎn)便，同時(shí)納米金易于修飾，在此平臺(tái)上可以進(jìn)一步進(jìn)行系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，且該納米探針可以擴(kuò)展到其他植物病毒的檢測(cè)，并且通過(guò)設(shè)計(jì)多色納米熒光探針實(shí)現(xiàn)多種病毒的同時(shí)檢測(cè)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1:檢測(cè)人工合成蘋(píng)果莖溝病毒寡核苷酸時(shí)的熒光光譜圖，其中a為不加待檢DNA的對(duì)照組，b為人工合成完全互補(bǔ)的待檢蘋(píng)果莖溝病毒寡核苷酸序列Tl，其檢測(cè)時(shí)濃度為 200nmol/L ；
[0028]圖2:檢測(cè)人工合成蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸時(shí)的熒光光譜圖，a為不加待檢DNA的對(duì)照組，b為人工合成與靶向蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸發(fā)生單堿基錯(cuò)配的序列T3，c為人工合成完全互補(bǔ)的待檢蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸序列T2，T2檢測(cè)時(shí)濃度為200nmol/L ；
[0029]圖3:檢測(cè)人工合成蘋(píng)果莖溝病毒寡核苷酸時(shí)的線性關(guān)系圖；
[0030]圖4:檢測(cè)人工合成蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸時(shí)的線性關(guān)系圖；
[0031]圖5:實(shí)際花葉病毒RNA檢測(cè)圖，a為不帶病毒陰性植株，b為帶病毒陽(yáng)性植株，其檢測(cè)濃度為0.00176 yg/μ L0

【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。
[0033]該發(fā)明所使用的實(shí)驗(yàn)儀器:
[0034]熒光分光光度計(jì)(LS-55，美國(guó)Perkins Elmer儀器有限公司)，儀器測(cè)定條件為:脈沖式氙燈激發(fā)，Cy3激發(fā)波長(zhǎng)為540nm，F(xiàn)AM激發(fā)波長(zhǎng)為480nm，Cy3熒光光譜的掃描范圍為550-700nm，F(xiàn)AM熒光光譜的掃描范圍為490_700nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm，用寬度為1mm的石英比色皿進(jìn)行測(cè)量。樣品體積為300 μ L ;室溫。
[0035]本發(fā)明所采用的13_15nm的納米金,根據(jù)參考文獻(xiàn)(K.C.Grabar, R.G.Freeman, Μ.B.Hommer, M.J.Natan, Anal.Chem.1995，67，735-743.)人工合成，其粒徑為 13_15nm,濃度為 3nmol/L。
[0036]雜交緩沖液為濃度為0.005-0.015mol/L的磷酸鹽緩沖液，其pH為7.2-7.5，并包括 0.135-0.138mol/L 的 NaCl 和 2.5-2.8mmol/L 的 KCl。
[0037]檢測(cè)緩沖液為濃度為0.005-0.015mol/L的磷酸鹽溶液，其pH為7.2-7.5，并包括0.05-0.15mol/L 的 NaCl 和 0.5-1.5mmol/L 的 MgCl2。
[0038]本發(fā)明實(shí)施例中試驗(yàn)用DNA序列如下，由Takara公司合成并經(jīng)HPLC純化。所有溶液均用超純水配制(電阻為18.2ΜΩ.cm)。
[0039]①捕獲探針DNAl
[0040]5' -CCG TCA GAA GTT CCT TTG CCG(A)9-Sm'
[0041]②信號(hào)探針DNA2
[0042]5' -FAM-CGG CAA AGG A~3'
[0043]③人工合成靶向蘋(píng)果莖溝病毒寡核苷酸Tl
[0044]5' -CGG CAA AGG AAC TTC TGA CGG-3'
[0045]④捕獲探針DNA3
[0046]5' -GAAGCCCTTTCGGTCCATCGG (A) 9_SH
[0047]⑤信號(hào)探針DNA4
[0048]5’-Cy3-CCGATGGACC-3'
[0049]⑥人工合成靶向蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸T2
[0050]5’-CCGATGGACCGAAAGGGCTTC-3’
[0051]⑦人工合成與靶向蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸發(fā)生單堿基錯(cuò)配的序列T3
[0052]5’-CCGATGGACCCAAAGGGCTTC-3’
[0053]上述人工合成序列Tl和T2分別為蘋(píng)果莖溝病毒和花葉病毒保守區(qū)序列中的一段，T3是T2的單堿基突變寡核苷酸。
[0054]實(shí)施例1
[0055]一、合成納米金蘋(píng)果莖溝病毒核酸探針:
[0056]將巰基標(biāo)記的捕獲探針DNAl和熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針DNA2按1: 1.1的濃度比在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交，再將雜交好的雙鏈DNA溶液按照與納米金溶液298:1的濃度比混合，雙鏈DNA通過(guò)Au-S鍵連接到粒度為14nm、濃度為3nmol/L的納米金表面，合成納米金蘋(píng)果莖溝病毒核酸探針溶液。
[0057]二、對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)
[0058]取100 μ L納米金莖溝病毒核酸探針溶液并加入200 μ L已制備的檢測(cè)緩沖液混合，納米金的終濃度為lnmol/L，添加人工合成的待檢莖溝蘋(píng)果病毒寡核苷酸Tl序列粉末，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。由于其含有莖溝蘋(píng)果病毒，病毒序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)且與巰基標(biāo)記的DNAl捕獲探針完全互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針被取代下來(lái)，遠(yuǎn)離納米金產(chǎn)生熒光。
[0059]檢測(cè)結(jié)果如圖1和3所示。由圖1可知，Tl與DNAl完全互補(bǔ)且長(zhǎng)度長(zhǎng)于信號(hào)探針DNA2，T1的加入能夠?qū)⑿盘?hào)探針DNA2取代下來(lái)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。由圖3可知該發(fā)明能夠定量檢測(cè)人工合成的祀向一段蘋(píng)果莖溝病毒寡核苷酸。
[0060]實(shí)施例2
[0061]一、合成納米金蘋(píng)果花葉病毒核酸探針:
[0062]將巰基標(biāo)記的捕獲探針DNA3和熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針DNA4按1: 1.2的濃度比在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交，再將雜交好的雙鏈DNA溶液按照與納米金溶液300:1的濃度比混合，雙鏈DNA通過(guò)Au-S鍵連接到粒度為13nm、濃度為3nmol/L的納米金表面，合成納米金蘋(píng)果花葉病毒核酸探針溶液。
[0063]二、對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)
[0064]取100 μ L納米金花葉病毒核酸探針溶液并加入200 μ L已制備的檢測(cè)緩沖液混合，納米金終濃度為lnmol/L，添加人工合成的待檢花葉蘋(píng)果病毒寡核苷酸T2序列粉末，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。由于其含有花葉蘋(píng)果病毒，病毒序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)且與巰基標(biāo)記的DNA3捕獲探針完全互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針被取代下來(lái)，遠(yuǎn)離納米金產(chǎn)生熒光。
[0065]檢測(cè)結(jié)果如圖2和4所示。由圖2可知，T2與DNA3完全互補(bǔ)且長(zhǎng)度長(zhǎng)于信號(hào)探針DNA4，T2的加入能夠?qū)⑿盘?hào)探針DNA4取代下來(lái)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。由圖4也可進(jìn)一步說(shuō)明該發(fā)明能夠定量檢測(cè)不同序列的人工合成的靶向寡核苷酸。
[0066]實(shí)施例3
[0067]本實(shí)施例的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法實(shí)施步驟與實(shí)施例2基本一致，其區(qū)別在于納米金粒徑為15nm，巰基標(biāo)記的捕獲探針DNA3和熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針DNA4按1: 1.3的濃度比在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交，在對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)人工合成的待檢與靶向蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸發(fā)生單堿基錯(cuò)配的T3序列。待檢序列與花葉蘋(píng)果病毒核苷酸發(fā)生單堿基錯(cuò)配、序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)，但其與巰基標(biāo)記的DNA3捕獲探針只能部分互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針只能一小部分被取代下來(lái)，絕大部分信號(hào)探針靠近納米金，熒光較小，熒光強(qiáng)度與不加待檢DNA對(duì)照組的熒光強(qiáng)度接近。
[0068]結(jié)果如圖2所示。由圖可知，單堿基突變DNA序列T3只能產(chǎn)生較低的熒光增強(qiáng)，說(shuō)明該發(fā)明探針具有很好的特異性。
[0069]實(shí)施例4
[0070]本實(shí)施例的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法實(shí)施步驟與實(shí)施例2基本一致，其區(qū)別在于雜交好的雙鏈DNA溶液按照與納米金溶液302:1的濃度比混合，在對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)由PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, USA)試劑盒提取的花葉病毒陰性植株樣本RNA。由于其實(shí)際不含花葉蘋(píng)果病毒，其與巰基標(biāo)記的DNA3捕獲探針無(wú)法互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針不能完全被取代下來(lái)，信號(hào)探針靠近納米金，熒光被猝滅。
[0071]結(jié)果如圖5a所示。由圖可知，對(duì)于實(shí)際的不帶毒陰性植株，熒光強(qiáng)度與不加待檢DNA的對(duì)照組相當(dāng)。
[0072]實(shí)施例5
[0073]本實(shí)施例的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法實(shí)施步驟與實(shí)施例4基本一致，其區(qū)別在于對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)由PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen, USA)試劑盒提取的花葉病毒陽(yáng)性植株樣本RNA。由于其含有花葉蘋(píng)果病毒，且其與巰基標(biāo)記的DNA3捕獲探針能夠完全互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針完全被取代下來(lái)，遠(yuǎn)離納米金產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。
[0074]結(jié)果如圖5b所示。由圖可知，對(duì)于實(shí)際的帶毒陽(yáng)性植株，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。
[0075]實(shí)施例6
[0076]本實(shí)施例的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法實(shí)施步驟與實(shí)施例1基本一致，其區(qū)別在于納米金粒徑為14nm,疏基標(biāo)記的捕犾探針DNA3和突光基團(tuán)標(biāo)記的彳目號(hào)探針DNA4按1.1.2的濃度比在雜交緩沖液中進(jìn)行雜交，在對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，納米金莖溝病毒核酸探針溶液與檢測(cè)緩沖液混合后，納米金的終濃度為2nmol/L，檢測(cè)人工合成的待檢莖溝蘋(píng)果病毒寡核苷酸Tl序列。
[0077]由于其含有莖溝蘋(píng)果病毒，病毒序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)且與巰基標(biāo)記的DNAl捕獲探針完全互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針被取代下來(lái)，遠(yuǎn)離納米金產(chǎn)生熒光。
[0078]實(shí)施例7
[0079]本實(shí)施例的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法實(shí)施步驟與實(shí)施例2基本一致，其區(qū)別在于納米金粒徑為15nm，雙鏈DNA溶液按照與納米金溶液302:1的濃度比混合，在對(duì)待測(cè)蘋(píng)果病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，納米金的終濃度為1.5nmol/L，檢測(cè)人工合成的待檢與靶向蘋(píng)果花葉病毒寡核苷酸發(fā)生單喊基錯(cuò)配的T3序列。
[0080]待檢序列與花葉蘋(píng)果病毒核苷酸發(fā)生單堿基錯(cuò)配、序列長(zhǎng)度較長(zhǎng)，但其與巰基標(biāo)記的DNA3捕獲探針只能部分互補(bǔ)，熒光基團(tuán)標(biāo)記的信號(hào)探針只能一小部分被取代下來(lái)，絕大部分信號(hào)探針靠近納米金，熒光較小，熒光強(qiáng)度與不加待檢DNA對(duì)照組的熒光強(qiáng)度接近。
[0081]以上實(shí)施例不是窮舉，其保護(hù)范圍不限于所給出的實(shí)施例，如納米探針可以擴(kuò)展到其他植物病毒的檢測(cè)，并且通過(guò)設(shè)計(jì)多色納米熒光探針實(shí)現(xiàn)多種病毒的同時(shí)檢測(cè)等，凡是根據(jù)本發(fā)明的思路所能實(shí)現(xiàn)的所有的技術(shù)方案，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于以巰基標(biāo)記的DNA作為捕獲探針，以熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA作為信號(hào)探針，二者雜交形成雙鏈DNA，雙鏈DNA探針組裝在納米金顆粒上構(gòu)建納米金核酸探針，通過(guò)雙鏈取代的方式檢測(cè)植物病毒并對(duì)堿基突變序列進(jìn)行區(qū)分。
2.如權(quán)利要求1所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于該方法具體包括以下步驟: (1).以巰基標(biāo)記的DNA作捕獲探針、熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA作為信號(hào)探針，二者在雜交緩沖液中雜交形成雙鏈DNA溶液； (2).步驟(I)制得的雙鏈DNA溶液與納米金溶液混合，雙鏈DNA通過(guò)Au-S共價(jià)鍵連接至納米金表面，制得納米金核酸探針溶液； (3).步驟(2)中制得的納米金核酸探針溶液與檢測(cè)緩沖液混合，納米金的終濃度為l_2nmol/L ； (4).將步驟(3)中所得混合液中添加人工合成蘋(píng)果病毒寡核苷酸或待測(cè)蘋(píng)果樣本的RNA提取液，觀察熒光現(xiàn)象。
3.如權(quán)利要求2所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于所述雜交緩沖液為濃度為0.005-0.015mol/L 的磷酸鹽緩沖液，其 pH 為 7.2-7.5，并包括 0.135-0.138mol/L 的 NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl ;所述檢測(cè)緩沖液為濃度為0.005-0.015mol/L的磷酸鹽溶液，其pH 為 7.2-7.5，并包括 0.05-0.15mol/L 的 NaCl 和 0.5-1.5mmol/L 的 MgCl20
4.如權(quán)利要求2或3所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于所述巰基標(biāo)記的DNA捕獲探針和熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA信號(hào)探針按1: 1.1一 1:1.3的濃度比雜交。
5.如權(quán)利要求2或3所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于所述巰基標(biāo)記的DNA捕獲探針，其巰基標(biāo)記在3’端，包括21個(gè)核苷酸與靶序列互補(bǔ)的識(shí)別序列和9個(gè)腺嘌呤(A)；所述熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA探針，其熒光基團(tuán)標(biāo)記在5’端，包括10個(gè)核苷酸，與巰基標(biāo)記的DNA探針的一部分完全互補(bǔ)，且互補(bǔ)堿基的部分從巰基標(biāo)記的DNA探針的鄰近9個(gè)連續(xù)A的第一個(gè)核苷酸開(kāi)始；所述熒光基團(tuán)為FAM羧基熒光素或花青染料Cy3。
6.如權(quán)利要求2或3所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于所述雙鏈DNA溶液與納米金溶液按照298:1— 302:1的濃度比合成納米金核酸探針溶液，每個(gè)納米金顆粒表面組裝40-50個(gè)雙鏈DNA分子，其包括30個(gè)巰基標(biāo)記的DNA捕獲探針和10個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記的DNA信號(hào)探針。
7.如權(quán)利要求2或3所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于所述納米金核酸探針溶液與檢測(cè)緩沖液按照1:2的體積比混合。
8.如權(quán)利要求2或3所述的蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法，其特征在于所述納米金的粒度為13_15nm,濃度為 3nmol/L。
9.一種蘋(píng)果病毒檢測(cè)方法所使用的檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括上述方法制備的納米金核酸探針溶液，盒內(nèi)還設(shè)有檢測(cè)緩沖液、人工合成蘋(píng)果病毒寡核苷酸粉末。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述納米金蘋(píng)果病毒核酸探針溶液包括納米金蘋(píng)果莖溝病毒核酸探針溶液和納米金蘋(píng)果花葉病毒核酸探針溶液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293975SQ201410192953
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】徐慧, 王磊, 蘭偉, 李豐環(huán) 申請(qǐng)人:煙臺(tái)市拓普邦生物科技有限公司