芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒由SYBRPremixExTaqTM、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成。本發(fā)明實現(xiàn)了方便快捷的檢測tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平的目的。本發(fā)明在檢測基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗成本低的優(yōu)點。
【專利說明】芒果橫線尾夜蛾tubu I in基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種芒果橫線尾夜蛾微管蛋白(tubulin)基因轉(zhuǎn)錄水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，屬于分子生物學檢測技術中的熒光定量DNA體外擴增【技術領域】。
【背景技術】
[0002]聚合酶鏈式反應(PolymeraseChain Reaction, PCR),即 DNA 體外擴增技術,PCR技術將模板DNA、特異引物、dNTPs底物、耐熱DNA聚合酶等放在同一個緩沖反應體系中，進行反復高溫變性、低溫 退火、中溫鏈延伸的熱循環(huán)，實現(xiàn)靶DNA片段在反應液中呈2n倍擴增(其中η為熱循環(huán)次數(shù))。
[0003]熒光定量PCR是一種核酸定量技術，該技術在PCR反應系統(tǒng)中引入了特定的熒光標記物質(zhì)，通過檢測每個熱循環(huán)后PCR反應體系中的熒光值的變化情況來實時監(jiān)測DNA的擴增情況，并獲得每個樣本的熒光定量變化曲線，從而獲得每個反應管的Ct值(熒光變化達到閾值時的循環(huán)數(shù))，以起始模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標制備標準曲線，據(jù)此標準曲線和各個標本的Ct值對每個反應的起始DNA模板數(shù)進行定量測定。
[0004]SYBR Green是一種結合于雙鏈DNA小溝中的結合染料。與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強，這種性質(zhì)用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。在PCR反應體系中，加入過量SYBRGreen I熒光染料，當該染料摻入DNA雙鏈后，熒光信號增強；當DNA變性時SYBR Green I染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物，SYBR GreenI染料與雙鏈產(chǎn)物結合，經(jīng)檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。這種高靈敏度、較低毒性的核酸染料在結合雙鏈DNA分子后熒光增強800-1000倍。
[0005]SYBR Green在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結合，不必因為模板不同而特別定制，因此設計的程序通用性好，且價格相對較低。此外，由于一個PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結合，因此SYBR Green的靈敏度很高。但是，由于SYBRGreen與所有的雙鏈DNA結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量結果的準確性。
[0006]在熒光定量PCR檢測基因表達水平時，經(jīng)常檢測某個基因的相對表達量，其中內(nèi)參基因常常選擇tubulin。通過大量的實驗研究，我們優(yōu)化出了一套能夠有效檢測芒果橫線尾夜蛾tubulin基因表達量的引物和PCR反應條件，并組裝成tubulin基因表達檢測熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒，以滿足生命科學、植物保護研究者的檢測需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供了一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，解決了現(xiàn)有技術中檢測不靈敏，成本高等問題。[0008]本發(fā)明的技術方案如下:
一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測引物，引物序列為:正向引物 1:5 ' - TTGATGAGGTCCGCACTGGC -3 ;；
反向引物 2:5 ' - GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG -3 ;。
[0009]2、一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒由SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成,試劑盒中各組成成分如下:
SYBR Premix Ex Taq? 購自 TaKaRa 公司:包含 Ex TaqHS, dNTP Mixture, Mg2+，TliRNaseH, SYBRGreen I ；
引物混合物:正向引物I為10 μ mol/L、反向引物2為10 μ mol/L ；
標準tubulin基因模板:濃度為1.0 μ mol/L, tubulin基因模板序列如SEQ ID NO: 3所示；
超純水組成:純度 不超過18.30 ΜΩ.CM。
[0010]本發(fā)明具有以下有益效果:
1.本發(fā)明實現(xiàn)了方便快捷的檢測tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平的目的。
[0011]2.本發(fā)明在檢測基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗成本低的優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:芒果橫線尾夜蛾tubulin基因擴增曲線，橫坐標為PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標為相對突光量值(Relative Fluorescence Units, RFU)。
[0013]圖2:芒果橫線尾夜蛾tubulin基因熔解曲線，橫坐標為溫度，縱坐標為單位溫度下相對熒光值的變化量。
【具體實施方式】
[0014]本試劑盒由SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成，試劑盒組成:
表1
S YBR Premix Ex Taq?5 inL
標準Mwiin基因模板500 pL
引糖混合物5_|iL
超純水5 HiL
試劑盒中各組成成分如下:
SYBR Premix Ex Taq? 購自 TaKaRa 公司:包含 Ex TaqHS, dNTP Mixture, Mg2+，TliRNaseH, SYBRGreen I 等。[0015]引物混合物:引物I為10 μ mol/L、引物2為10 μ mol/L,
引物 I 序列為 5 ; - TTGATGAGGTCCGCACTGGC -3 ;、
引物 2 序列為 5 ; - GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG -3 ;；
標準tubulin基因模板:濃度為1.0 μ mol/L, tubulin基因模板序列為:
5 ; - TTGATGAGGTCCGCACTGGCACATACAGACAGTTGTTTCATCCAGAACAACTTATC ACTGGTAAGGAAGATGCGGCCAACAACTACGCCCGTGGTCAGATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3 ;；
超純水組成:純度不超過18.30 ΜΩ.CM。
[0016]混合適量的SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、超純水、標準tubulin基因模板或cDNA模板，在熱循環(huán)儀上進行高溫、低溫、中溫的反復熱循環(huán)；并在中溫時檢測和記錄熒光值。該tubulin熒光定量PCR可以有效擴增芒果橫線尾夜蛾的tubulin基因，從而檢測tubulin基因的表達量。
[0017]以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0018]實施例1
按比例配制tubulin熒光定量PCR反應液，25 μ L反應體系如下表:
【權利要求】
1.一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測引物，其特征在于，弓丨物序列為:正向引物 1:5 ' - TTGATGAGGTCCGCACTGGC -3 ;； 反向引物 2:5 ' - GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG -3 ;。
2.一種芒果橫線尾夜蛾tubulin基因轉(zhuǎn)錄水平熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒由SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、標準tubulin基因模板和超純水組成,試劑盒中各組成成分如下: SYBR Premix Ex Taq? 購自 TaKaRa 公司:包含 Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+，TliRNaseH, SYBR Green I ； 引物混合物:正向引物I為10 ymol/L、反向引物2為10 μ mol/L ； 標準tubulin基因模板:濃度為1.0 μ mol/L, tubulin基因模板序列如SEQ ID NO: 3所示； 超純水組成:純度不超過18.30 ΜΩ.CM。
【文檔編號】C12N15/11GK103952490SQ201410195730
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權日:2014年5月9日
【發(fā)明者】魏輝, 鄭麗禎, 田厚軍, 陳藝欣, 林碩, 常虹 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所