miRNA在心肌纖維化疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，所述miRNA序列為SEQ?ID1、SEQ?ID2、SEQ?ID3、SEQ?ID4、SEQ?ID5或SEQID6。尤其是將不同人源miRNA-19b序列與非人源miRNA-19b混合應(yīng)用，即將人源miRNA-19b序列SEQ?ID1或SEQ?ID2，與非人源miRNA-19b序列SEQ?ID3、SEQ?ID4、SEQ?ID5以及SEQ?ID6中的一種或多種進(jìn)行混合，對(duì)于在治療心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，取得了顯著的效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】miRNA在心肌纖維化疾病治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域，涉及miRNA、miRNA的前體RNA、miRNA反義寡核苷酸序列及其表達(dá)載體，及其在診斷和治療心肌纖維化疾病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]心血管疾病是危害人類(lèi)健康的嚴(yán)重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我國(guó)居民的死亡譜中，心血管疾病已經(jīng)成為僅次于惡性腫瘤的第二號(hào)殺手，并且每年另有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的人因患該病導(dǎo)致殘疾。該病種類(lèi)繁多、病因復(fù)雜。其中，由中、重度的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄所引起心肌纖維持續(xù)性和/或反復(fù)加重的缺血缺氧將導(dǎo)致心肌纖維化疾病。在該疾病的早期，左心室舒張功能受損。任其發(fā)展將由于心室重塑致心肌正常結(jié)構(gòu)喪失，最終使心室收縮功能也受損，從而導(dǎo)致心功能不全。心肌纖維化疾病發(fā)展過(guò)程中，心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過(guò)量積聚、心臟組織中膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變。這種病理變化在多種心血管疾病中存在，現(xiàn)認(rèn)為心肌纖維化與心律失常、心功能障礙甚至心臟性猝死密切相關(guān)[Jessup M and Brozena S:Heart fai lure.N Engl J Med2003 ；348:2007-2018 ；Swynghedauw B:Molecular mechanisms of myocardial remodeling.Phys1l Revl999 ；79:215-262.]。
[0003]細(xì)胞外基 質(zhì)蛋白(ECM)在心肌組織內(nèi)的積累是心肌纖維化的主要特征，而結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)已被確定為ECM的強(qiáng)力誘導(dǎo)因子[Koitabashi N，et al !Increasedconnective tissue growth factor relative to brain natriuretic peptide as adeterminant of myocardial fibrosis.[J]Hypertens1n2007 ；49:1120-1127 ；TsoutsmanT，et al:CCN2plays a key role in extracellular matrix gene express1n in severehypertrophic card1myopathy and heart failure.[J]J Mol Cell Card1l.2013 ；62C:164-178 ;ChenMM，et al:CTGF express1n is induced by TGF-beta in cardiac fibroblastsand cardiac myocytes:a potential role in heart fibrosis.[J] J Mol Cell Card1l2000 ；32:1805-1819.]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，心臟衰竭過(guò)程中，CTGF積極參與了血管緊張素IKAng II)誘導(dǎo)的心肌纖維化進(jìn)程。因此，CTGF的表達(dá)在心肌纖維化所導(dǎo)致的多種心血管疾病中起及其重要作用[Finckenberg P，et al:Ang1tensin II induces connectivetissue growth factor gene express1n via calcineurin-dependent pathways.[J]Am J Pathol2003 ；163:355-366 ；Ahmed MS，et al:Connective tissue growth factor—anovel mediator of ang1tens in ΙΙ—stimulated cardiac fibroblast activat1n inheart failure in rats.[J] J Mol Cell Card1l2004 ；36:393-404 ；Sopel MJ, et al:Treatment with activated protein C(aPC)is protective during the development ofmyocardial fibrosis:an ang1tensin II infus1n model in mice.[J]PloS one2012 ；7:e45663 ；Matsui Y and Sadoshima J:Rapid upregulat1n of CTGF in cardiac myocytes byhypertrophic stimuli:implicat1n for cardiac fibrosis and hypertrophy.[J]J MolCell Card1l2004 ；37:477-481 ；He Z，et al:Differentiai regulat1n of ang1tensinΙΙ—induced express1n of connective tissue growth factor by protein kinase Cisoforms in the myocardium.[J] J B1l Chem2005 ；280:15719-15726.]。
[0004]心血管疾病發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命和健康。因此，世界各國(guó)對(duì)心腦血管疾病的研究、預(yù)防及治療均十分重視。在心臟纖維化疾病的治療過(guò)程中，如何能有效的降低CTGF在心肌組織結(jié)構(gòu)中表達(dá)量，進(jìn)而減少ECM在在心肌組織內(nèi)的積累、降低心臟組織中膠原濃度，將成為治療心臟纖維化所導(dǎo)致的多種心血管疾病的關(guān)鍵。
[0005]微小RNAOniRNA或microRNA)是一種長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸單鏈的內(nèi)源性非編碼性小RNA，是由前體在酶的加工下生成，前體的序列一般為70~120個(gè)核苷酸。通過(guò)與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)芐基因表達(dá)，參與多種生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)化過(guò)程保守。最初發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性miRNA是lin24和let27，它們參與基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，通過(guò)與靶mRNA的3’端非編碼區(qū)或編碼區(qū)(3’ -UTR)相結(jié)合而發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)已經(jīng)鑒定出超過(guò)400種miRNA,但仍有很多種尚未被發(fā)現(xiàn)[Berezikov E, Thuemmler F, van LaakeLff, et al.Diversity of microRNAs in human and chimpanzee brain [J].Nat Genet, 2006,38(12):1375-1377.]。對(duì)miRNA空間表達(dá)的系統(tǒng)性分析表明，很多miRNAs以組織特異性方式表達(dá)[ffienholds E, KloostermanffP, Miska E, et al.MicroRNA express1n in zebrafishembryonic development [J].Science, 2005, 309 (5732):310-311.]。每一種 miRNA 可以定位于很多種mRNA，使其轉(zhuǎn)錄抑制或降解，因此很多種轉(zhuǎn)錄子可能受到miRNA的精細(xì)調(diào)節(jié)，使轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)有效運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而細(xì)胞得以快速而有效地控制閾值依賴(lài)性的細(xì)胞事件。目前普遍認(rèn)為miRNA的功能是參與生命的一些基本過(guò)程如生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成、造血、細(xì)胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤生成等。
[0006]最初科學(xué) 家們發(fā)現(xiàn)miRNA與細(xì)胞的癌變有著極為密切的關(guān)系，對(duì)腫瘤抑制基因起作用的miRNA下降或者缺失會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。已發(fā)現(xiàn)的的miRNA與肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病等多種癌癥密切相關(guān)。2006年末，科學(xué)家開(kāi)始注意到miRNA在心臟疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的重要作用[Van Rooij E, Sutherland LB, L iu N, et al.A signaturepattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heartfailure [J].PNAS，2006，103:18255-18260.]，并在心律失常、心力衰竭等疾病的研究中取得了一系列重要進(jìn)展，使miRNA成為國(guó)際心血管研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
[0007]心血管疾病相關(guān)miRNA的發(fā)現(xiàn)可能對(duì)該疾病的相關(guān)基因治療產(chǎn)生重大的影響。通過(guò)對(duì)心血管疾病患者和正常人群的miRNA差異表達(dá)分析，可以鑒定得到相關(guān)的敏感miRNA，進(jìn)而通過(guò)引入特異性的miRNA互補(bǔ)的反義核苷酸抑制或者通過(guò)病毒載體或質(zhì)粒載體過(guò)表達(dá)的方法，調(diào)控相關(guān)miRNA或其前體的表達(dá)量，從而達(dá)到治療心血管疾病的目的。因此，發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)的miRNA對(duì)于心血管疾病的診斷和治療具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA_19b的一種新用途。
[0009]本發(fā)明提供miRNA-19b作為制備治療心肌纖維化疾病的藥物治療應(yīng)用。
[0010]具體的說(shuō)，本發(fā)明所提供的人源miRNA_19b (has-miR_19b)和鼠源miRNA-19b (mmu-miR-19b 和 rno_miR-19b)均包含如下序列:[0011]5，-UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA-3，(SEQ ID7)。
[0012]本發(fā)明所提供的人源miRNA-19b的前體RNA有2種，包含如下序列:
[0013]hsa-mir-19b-l(M10000074):
[0014]5，-CACUGUUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUGUGAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUAGUG-3’ (SEQ IDl)
[0015]hsa-mir-19b-2(M10000075):
[0016]5，-ACAUUGCUACUUACAAUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUUUCAGCGUAUAUAUGUAUAUGUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGAUAAUGU-3，(SEQ ID 2)
[0017]本發(fā)明所提供的小鼠鼠源miRNA_19b的前體RNA有2種，包含如下序列:
[0018]mmu-mi r~19b~1(M10000718):
[0019]5， -CACUGGUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUAUAAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUGGUG-3’ (SEQ ID3)
[0020]mmu-mir~19b~2(M10000546)
[0021 ] 5，-ACUUACGAUUAGUUUUGCAGAUUUGCAGUUCAGCGUAUAUGUGAAUAUAUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGGGA-3’ (SEQ ID4)
[0022]本發(fā)明所提供的大鼠鼠源miRNA-19b的前體RNA有2種，包含如下序列:
[0023]rno-mir-19b-l(M10000847)
[0024]5， -CACUGGUCUAUGGUUAGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGCUGUAUAAUAUUCUGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGACUGUGGUGGUG-3’ (SEQ ID5)
[0025]rno-mir-19b-2(M10000848)
[0026]5，-ACAUUGCUACUUACGGUUAGUUUUGCAGAUUUGCAGUUCAGCGUAUAUGUGGAUAUAUGGCUGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGAUUGUGAUGAUGU-3，(SEQ I D6)
[0027]本發(fā)明所提供的人源miRNA_19b (has-miRNA_19b),鼠源 miRNA_19b (mmu-miR-19b和rno-miR-19b)的反義寡核苷酸均包含如下序列:
[0028]5’ -UCAGUUUUGCAUGGAUUUGCACA-3’ (SEQ ID8)
[0029]本發(fā)明所提供的人源miRNA-19b的前體hsa-mir-19b_l在人染色體上定位于13q31.3，前體 hsa-mir-19b_2 定位于人染色體 Xq26.2。
[0030]本發(fā)明以新生SD大鼠的心肌細(xì)胞為材料進(jìn)行miRNA分子的克隆分析。采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞和組織中提取總RNA，經(jīng)過(guò)特意性的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)結(jié)果表明，miRNA_19b在血管緊張素誘導(dǎo)的心肌纖維化病理狀態(tài)下其表達(dá)量明顯降低；運(yùn)用特異性合成的miRNA-19b前體RNA增加細(xì)胞內(nèi)miRNA_19b的表達(dá)，能有效的降低結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在心肌組織結(jié)構(gòu)中表達(dá)量。
[0031]患有心肌纖維化疾病的病人，由于CTGF在心肌組織結(jié)構(gòu)中表達(dá)量增高，心臟組織中膠原濃度含量極高。在該疾病的早期，左心室舒張功能受損。任其發(fā)展將最終使心室收縮功能也受損，從而導(dǎo)致心功能不全。在血管緊張素誘導(dǎo)的心肌纖維化病理狀態(tài)下，miRNA-19b在心肌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯降低，用這一特征性的表現(xiàn)可以將其作為診斷心肌纖維化的指征；由于miRNA-19b對(duì)于心肌組織結(jié)構(gòu)中CTGF的表達(dá)量有著明顯的調(diào)節(jié)作用，因此能夠運(yùn)用病毒載體或質(zhì)粒載體過(guò)表達(dá)的方法，將病人心肌細(xì)胞中的miRNA-19b表達(dá)量增加，將能有效的抑制CTGF在心肌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而降低心臟組織中膠原濃度，這將有效的延緩心肌纖維化的病理進(jìn)程，控制心肌纖維化病情的發(fā)展，從而達(dá)到治療目的。miRNA-19b這一功能的發(fā)現(xiàn)對(duì)于心肌纖維化等心血管疾病的診斷和治療都有著極其重要的意義。
[0032]本發(fā)明將人源miRNA-19b序列SEQ IDl和SEQ ID2,或非人源miRNA_19b序列SEQID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6，單獨(dú)或混合添加于含有血管緊張素(AngII)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，本發(fā)明的序列能顯著抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在心肌細(xì)胞中的表達(dá)量，尤其是將優(yōu)選將不同人源miRNA-19b序列與非人源miRNA_19b混合應(yīng)用，更是取得了驚人的效果。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，提供了一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，其特征在于，所述 miRNA 是 miRNA-19b。
[0034]如上所述的一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，優(yōu)選所述miRNA的來(lái)源于人、小鼠或大鼠。
[0035]如上所述的一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，優(yōu)選所述miRNA序列為 SEQIDU SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6。
[0036]如上所述的一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，優(yōu)選將不同人源miRNA-19b序列與非人源miRNA-19b混合應(yīng)用，即將人源miRNA-19b序列SEQ IDl或SEQID2，與非人源miRNA-19b序列SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一種或多種進(jìn)行混
八
口 ο
[0037]如上所述的一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，優(yōu)選在所述的混合miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQID2的含有比例為10%~90%。
[0038]如上所述的一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，更優(yōu)選在所述的混合miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQ ID2的含有比例為30%~70%。
[0039]本發(fā)明還提供了一種制備治療或診斷心肌纖維化疾病的藥物組合物，其特征在于，含有藥學(xué)上可接受的載體和有效量的miRNA序列SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQID4、SEQID5以及SEQ ID6中的一種或多種。
[0040]一種制備治療或診斷心肌纖維化疾病的藥物組合物，優(yōu)選將人源miRNA-19b序列SEQ IDl 或 SEQ ID2，與非人源 miRNA_19b 序列 SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 以及 SEQ ID6 中的一種或多種進(jìn)行混合。
[0041]本發(fā)明還提供了治療或診斷心肌纖維化疾病的探針，其特征在于所述探針的序列為 SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6 的互補(bǔ)序列。
[0042]本發(fā)明還提供一種治療或診斷心肌纖維化疾病的試劑盒，其特征在于，其特征在于含有序列為 SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6 的探針。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1.血管緊張素(AngII)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化的過(guò)程中，miR_19b的表達(dá)明顯降低；血管緊張素抑制劑替米沙坦(Telmisartan)可以阻斷AngII作用，維持miR_19b表達(dá)水平。*:p<0.05，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[0044]圖2.AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化的過(guò)程中，CTGF的mRNA表達(dá)明顯增高。AngII抑制劑Telmisartan可以阻斷AngII作用，維持CTGF的mRNA表達(dá)水平。A qRT-PCR檢測(cè)CTGF的mRNA表達(dá)量；B瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CTGF的mRNA表達(dá)量。*:p<0.05，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
[0045]圖3.AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化的過(guò)程中，CTGF的蛋白表達(dá)水平明顯增高。AngII抑制劑Telmisartan可以阻斷AngII作用，維持CTGF的蛋白表達(dá)水平。A.Western-blot檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF的蛋白表達(dá)；B.灰度分析定量Western-blot檢測(cè)CTGF結(jié)果。*:p<0.05，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
[0046]圖4.A.miR-19b與CTGF mRNA的3’非編碼區(qū)(3，-UTR)結(jié)合位點(diǎn)分析。B.轉(zhuǎn)染miR-19b前體(pre_miR-19b)可以明顯增加心肌細(xì)胞內(nèi)miR_19b的表達(dá)水平。*:p〈0.05,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
[0047]圖5.轉(zhuǎn)染miR-19b前體(pre_miR-19b)可以明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF mRNA的表達(dá)水平。A.qRT-PCR檢測(cè)CTGF的mRNA表達(dá)量；B.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)CTGF的mRNA表達(dá)量。*:D<0.05，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
[0048]圖6.AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化過(guò)程中，pre_miR-19b可以有效的降低心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF的mRNA表達(dá)水平。*:p<0.05，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
[0049]圖7.AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化過(guò)程中,pre_miR-19b可以有效的降低CTGF的蛋白表達(dá)水平。A.Western-blot檢測(cè)不同狀態(tài)下心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF的蛋白表達(dá)量；B.灰度分析定量Western-b1t檢測(cè)CTGF表達(dá)結(jié)果。*:p<0.05,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 【具體實(shí)施方式】
[0050]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
[0051]本發(fā)明所公開(kāi)的RNA序列均能夠以人工合成的方法或其它生物學(xué)方法獲得。
[0052]實(shí)施例1
[0053]新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及心肌細(xì)胞總RNA和總蛋白抽提
[0054]1.原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞
[0055]1.1取新生1-3天的大鼠心臟置于預(yù)冷的Hanks平衡鹽溶液(HBSS, Invitrogen)中。
[0056]1.2分離心室下端大約1/3位置的心肌組織，將其用手術(shù)剪切成小塊。
[0057]1.3 將小塊心肌組織放入 5mL 含有 75U/mL col lagenase II (Worthington)的消化溶液中37°C孵育20分鐘后收集消化液并加入新鮮的消化溶液繼續(xù)消化。該消化過(guò)程重復(fù)6次。
[0058]1.4細(xì)胞283g離心5分鐘之后用含有10%胎牛血清，I %抗生素的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液(1:1，Invitrogen)重懸。
[0059]1.5在細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)上培養(yǎng)細(xì)胞I小時(shí)，運(yùn)用差速貼壁的方法分離非心肌細(xì)胞。沒(méi)有貼壁的細(xì)胞用DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)在預(yù)包被Gelatin (Invitrogen)的培養(yǎng)瓶中。
[0060]1.6心肌細(xì)胞將在此含有0.1%牛血清白蛋白的DMEM-F12培養(yǎng)液中48小時(shí)內(nèi)貼壁。
[0061]2.細(xì)胞總 RNA 提取(TRIzol 法)[0062]2.1.收獲細(xì)胞1-5X107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。
[0063]2.2.加入0.2ml氯仿，振蕩15秒，靜置2min。
[0064]2.3.于預(yù)冷的4°C離心機(jī)中12000g離心15分鐘。取上清。
[0065]2.4.加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置1min。
[0066]2.5.于預(yù)冷的4°C離心機(jī)中12000g離心10分鐘。棄上清。
[0067]2.6.加入lml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。于預(yù)冷的4°C離心機(jī)中7500g離心10分鐘，棄上清。
[0068]2.7.晾干，加入適量的 DEPC H2O 溶解(65°C促溶 10_15min)。測(cè)定 0D260 和 0D280
值，初步斷定RNA質(zhì)量。
[0069]2.8.總RNA提取采用無(wú)RNA酶的DNA酶I處理，QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0070]3.細(xì)胞總蛋白提取(RIPA裂解法)
[0071]3.1.從貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板中小心吸去培養(yǎng)液。
[0072]3.2.預(yù)冷的PBS清洗貼壁的細(xì)胞2次，小心吸去PBS。
[0073]3.3.配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑RIPA裂解液(Iml裂解液中加入5 μ I蛋白酶抑制劑混合液，5 μ IPMSF和5 μ I磷酸酶抑制劑混合液)。
[0074]3.4.細(xì)胞培養(yǎng)板中加入預(yù)冷的含抑制劑的RIPA裂解液，置于冰上5分鐘。
[0075]3.5.用一預(yù)冷的細(xì)胞刮將培養(yǎng)瓶壁上貼壁細(xì)胞刮下來(lái)，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到離心管中，冰浴下?lián)u動(dòng)15分鐘進(jìn)行裂解。
[0076]3.6.裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14000g，4°C離心15分鐘。棄去沉淀，上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。
[0077]實(shí)施例2
[0078]miR-19b前體(pre-mir_19b)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞及血管緊張素Ang II刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化
[0079]1.pre-mir-19b轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后總RNA和總蛋白的提取
[0080]1.1細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)4X 104。
[0081]1.2 將 Iul 的轉(zhuǎn)染試劑 siPORT NeoFX (AM4510, Amb1n)和 25ul 的 OPT1-MEM I 培養(yǎng)液(Invitrogen)混合放置于室溫孵育10分鐘。
[0082]1.3 將 pre-mir-19b (AM17100, Amb1n)用 0ΡΤΙ-ΜΕΜ I 培養(yǎng)液(Invitrogen)稀釋?zhuān)瑑烧呋靹蚝蠓胖糜谑覝胤跤?0分鐘。運(yùn)用無(wú)功能的miRNA序列pre-miR?-NegativeControl (AM17110, Amb1n)處理細(xì)胞作為對(duì)照組(Control)。
[0083]1.4混勻稀釋好的pre-mir-19b和轉(zhuǎn)染試劑，放置于室溫孵育10分鐘使其形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。
[0084]1.5將含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)液加入細(xì)胞培養(yǎng)板，與細(xì)胞共同孵育48小時(shí)。
[0085]1.6收集細(xì)胞總RNA，具體方法參照實(shí)施例1。
[0086]1.7收集細(xì)胞總蛋白，具體方法參照實(shí)施例1。
[0087]2.血管緊張素Ang II刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化
[0088]2.1細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)4X 104。[0089]2.2細(xì)胞用ΙΟμπι替米沙坦(Telmisartan, Abeam)預(yù)處理30分鐘后加入含有10nM血管緊張素AngII (Sigma)的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)48小時(shí)。將未預(yù)處理組和常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)組細(xì)胞作為對(duì)照組。
[0090]2.3收集細(xì)胞總RNA，具體方法參照實(shí)施例1中第2部分。
[0091]2.4收集細(xì)胞總蛋白，具體方法參照實(shí)施例1中第3部分。
[0092]實(shí)施例3
[0093]分析心肌細(xì)胞內(nèi)miRNA_19b和CTGF的表達(dá)量
[0094]1.qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)miRNA_19b和CTGF mRNA的表達(dá)量。
[0095]1.1以收集的心肌細(xì)胞總RNA作為模板，用miR_19b特異性的mirVana qRT-PCR引物(Amb1n)擴(kuò)增miR-19b基因。使用實(shí)時(shí)TaqMan miRNA分析檢測(cè)試劑盒(ABI)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-19b的表達(dá)量，運(yùn)用U6snRNA基因作為檢測(cè)的內(nèi)參。詳細(xì)操作原理和方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0096]1.2以收集的心肌細(xì)胞總RNA作為模板，用CTGF基因特異性的PCR引物擴(kuò)增CTGF的mRNA，使用實(shí)時(shí)定 內(nèi)參。PCR的產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化和定量分析。詳細(xì)操作原理和方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0097]2.ffestern-blott ing分析心肌細(xì)胞中CTGF蛋白表達(dá)水平
[0098]2.1以收集心肌細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-b1t檢測(cè)CTGF蛋白表達(dá)量。等量的大約30μ g總蛋白用10%聚丙烯酰胺凝膠(B1-Rad)進(jìn)行200伏特，2小時(shí)的電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上(Millipore).[0099]2.25%的牛血清白蛋白室溫條件下封閉I小時(shí)。
[0100]2.3 加入特異性的 CTGF(1: 500 稀釋?zhuān)琒anta Cruz)and GAPDH(I: 5000 稀釋?zhuān)琒igma) 一抗抗體,在4°C條件下孵育過(guò)夜。
[0101]2.4用含有1%的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分鐘。
[0102]2.5加入特異性針對(duì)一抗的二抗，室溫條件下孵育I小時(shí)。
[0103]2.6用含有I %的Tween-20的PBS溶液洗3次，每次10分鐘。
[0104]2.7加入ECL熒光顯影液試劑(Thermo)，用x光膠片感光顯影。
[0105]2.8運(yùn)用ImageJ軟件進(jìn)行影像條帶的灰度定量分析。
[0106]實(shí)施例4
[0107]MiRNA結(jié)合位點(diǎn)分析
[0108]運(yùn)用生物信息學(xué)TargetScan 程序(http: //www.targetscan.0rg)分析預(yù)測(cè)miR-19b 與 CTGF mRNA 的 3’ -UTR 結(jié)合位點(diǎn)。
[0109]實(shí)施例5
[0110]統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0111]所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(?土 SD)表示，兩樣本之間比較用t檢驗(yàn)，以p〈0.05具
有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
[0112]實(shí)驗(yàn)例
[0113]按照實(shí)施例2中的實(shí)驗(yàn)方法,將本發(fā)明的替代pre-mir-19b(AM17100,Amb1n),加入所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，如表1所示的實(shí)驗(yàn)例及對(duì)照例，分別測(cè)定心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF蛋白表達(dá)量，其結(jié)果如表1所示，其中，將本發(fā)明的各rniR-19b序列配制成10ng/ml的溶液，在實(shí)驗(yàn)例7至實(shí)驗(yàn)例46中，個(gè)混合miR-19b序列溶液的總量為1y I。
[0114]本發(fā)明所取得的具體效果:
[0115]1.血管緊張素AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化的過(guò)程中，miR_19b的表達(dá)明顯降低；血管緊張素抑制劑替米沙坦(Telmisartan)可以部分阻斷AngII作用，維持miR_19b表達(dá)水平(圖1)。該結(jié)果提示:心肌纖維化過(guò)程中，miR-19b表達(dá)量將發(fā)生明顯的降低；阻斷外界致病因素作用將能有效的維持miR-19b的表達(dá)水平。檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)miR-19b的表達(dá)量的方法可以作為診斷心肌纖維化疾病的指針。
[0116]2.血管緊張素AngII誘導(dǎo)心肌細(xì)胞纖維化的過(guò)程中，CTGF的表達(dá)明顯增高；用Telmisartan阻斷AngII作用可以維持CTGF的表達(dá)水平。CTGF無(wú)論是在mRNA水平或者蛋白質(zhì)水平均表現(xiàn)出相對(duì)一致的變化趨勢(shì)(圖2和圖3)。該結(jié)果表明:CTGF的表達(dá)增高與心肌纖維化疾病的發(fā)生存在一定程度的相關(guān)性。
[0117]3.生物信息學(xué)研究結(jié)果顯示:CTGF mRNA的3’非編碼區(qū)(3’ -UTR)存在有特異性miR-19b抑制性結(jié)合位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染miR-19b前體(pre_miR-19b)可以明顯增加心肌細(xì)胞內(nèi)miR-19b的表達(dá)水平。(圖4)。該結(jié)果表明:有可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)miR-19b的表達(dá)水平來(lái)改變CTGF的表達(dá)。
[0118]4.通過(guò)轉(zhuǎn)染pre-miR_1 9b增加心肌細(xì)胞內(nèi)miR_19b的表達(dá)水平可以明顯降低心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF的表達(dá)水平。(圖5)。
[0119]5.無(wú)論是在mRNA水平或者蛋白質(zhì)水平，轉(zhuǎn)染miRNA-19b的前體pre-miR-19b都可以降低心肌細(xì)胞內(nèi)CTGF的表達(dá)水平，有效的抑制由血管緊張素AngII誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞纖維化，在一定程度上消除纖維化對(duì)心肌細(xì)胞功能的影響，達(dá)到治療的作用(圖6和圖7)。
[0120]6.在各種不同條件下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，CTGF蛋白的表達(dá)量如表1所示，結(jié)果顯示本發(fā)明的 SEQ IDU SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 和 SEQ ID6 均能抑制 CTGF 蛋白質(zhì)的表達(dá),將人源miRNA-19b序列SEQ IDl或SEQ ID2,與非人源miRNA_19b序列SEQ ID3、SEQID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一種(或多種)進(jìn)行混合，其抑制效果更為明顯。
[0121]表1.各實(shí)驗(yàn)例和對(duì)照例中CTGF蛋白的表達(dá)量(任意單位)
[0122]
【權(quán)利要求】
1.一種miRNA在治療或診斷心肌纖維化疾病中的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA是miRNA-19b。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于， 所述miRNA的來(lái)源于人、小鼠或大鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，
所述 miRNA 序列為 SEQ IDUSEQ ID2、SEQ ID3、SEQID4、SEQ ID5 或 SEQ ID 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于， 將不同人源miRNA-19b序列與非人源miRNA_19b混合應(yīng)用，SP 將人源miRNA-19b 序列 SEQ IDl 或 SEQ ID2，與非人源miRNA_19b 序列 SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5以及SEQ ID6中的一種或多種進(jìn)行混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中， 在所述的混合miRNA-19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQ ID2的含有比例為10%~90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中， 在所述的混合miRNA- 19b序列序列中，所述人源miRNA_19b序列SEQ IDl或SEQID2的含有比例為30%~70%。
7.一種制備治療或診斷心肌纖維化疾病的藥物組合物，其特征在于，含有藥學(xué)上可接受的載體和有效量的 miRNA 序列 SEQ IDl、SEQ ID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 以及 SEQ ID6中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，將人源miRNA-19b序列SEQIDl或SEQ ID2，與非人源 miRNA-19b 序列 SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 以及 SEQ ID6 中的一種或多種進(jìn)行混合。
9.一種治療或診斷心肌纖維化疾病的探針，其特征在于所述探針的序列為SEQ IDUSEQID2、SEQ ID3、SEQ ID4、SEQ ID5 或 SEQ ID6 的互補(bǔ)序列。
10.一種治療或診斷心肌纖維化疾病的試劑盒，其特征在于含有如權(quán)利要求9所述的探針。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104031987SQ201410196658
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】聶瑛潔, 高松, 池洪杰, 陳輝, 安宇 申請(qǐng)人:貴州省人民醫(yī)院