三角帆蚌α-淀粉酶基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種三角帆蚌α-淀粉酶基因的分子標(biāo)記，獲取方法和三角帆蚌體重性狀選育中的應(yīng)用，所述分子標(biāo)記為α-淀粉酶基因編碼區(qū)的T+471C、G+1026T、T+1320G、A+1386G。本發(fā)明通過(guò)上述與三角帆蚌體重性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，可以培育出體重性狀上更有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的三角帆蚌，加快育種進(jìn)程。
【專利說(shuō)明】三角帆蚌α-淀粉酶基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物遺傳育種領(lǐng)域，具體涉及與三角帆蛘體重性狀相關(guān)的SNP分子標(biāo) 記和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 三角帆蛘是我國(guó)主要的淡水育珠蛘，其育出的珍珠產(chǎn)量保持在1000噸左右，占全 世界淡水珍珠總產(chǎn)量的90%以上。已有的研究表明，育珠蛘的重量、體積、殼寬等生長(zhǎng)性狀 與珍珠的生長(zhǎng)密切相關(guān)。然而在目前的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，三角帆蛘品種的改良一直得不到足夠 的重視，養(yǎng)殖者選用的多為野生種或近野生種，忽視了品種的改良和選育，使得親本種質(zhì)不 斷退化，幼蛘個(gè)體差異大，生長(zhǎng)速度減緩。
[0003] 近年來(lái)，盡管種質(zhì)改良進(jìn)行了一些研究，但在手段上仍然局限于選擇育種、三倍體 育種、近緣雜交等傳統(tǒng)的遺傳選育方法。分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted Selection, MAS)育種是將分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)遺傳育種方法相結(jié)合，借助分子標(biāo)記對(duì)育種材料在 DNA水平上進(jìn)行選擇，從而高效改良目標(biāo)生物生長(zhǎng)、品質(zhì)、抗性等經(jīng)濟(jì)性狀的育種方法。MAS 在選育過(guò)程中受環(huán)境、性別、年齡等因素的影響相對(duì)小，可以提高育種效率，加速育種進(jìn)程， 成為傳統(tǒng)育種方法的有效輔助手段廣泛運(yùn)用于動(dòng)植物種質(zhì)的遺傳改良。
[0004] α -淀粉酶是淀粉酶中將淀粉從分子內(nèi)部切開(kāi)α -1，4糖苷鍵而使其水解的一個(gè) 大類，是生物利用淀粉的關(guān)鍵酶。已有的研究表明α-淀粉酶在果蠅、對(duì)蝦、雞等物種中都 存在一定的多態(tài)性，并且有的基因型與生長(zhǎng)性狀密切關(guān)聯(lián)。目前未見(jiàn)將α-淀粉酶基因作 為三角帆蛘體重生長(zhǎng)性狀分子標(biāo)記的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種三角帆蛘α -淀粉酶基因與體重 生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供所述分子標(biāo)記的獲取方法。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供所述分子標(biāo)記在三角帆蛘育種中的應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種三角帆蛘α -淀粉酶基因的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為α -淀粉酶基因編碼 區(qū)的 T+471C、G+1026T、C+1068T、T+1320G、A+1386G4 個(gè) SNP 位點(diǎn)。
[0010] 上述α -淀粉酶基因的分子標(biāo)記在三角帆蛘體重性狀選育中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步，第471位點(diǎn)ΤΤ型、1026位點(diǎn)ΤΤ型、1320位點(diǎn)GG型和1386位點(diǎn)GG型與 三角帆蛘體重增重顯著正相關(guān)。
[0012] 上述的三角帆蛘α -淀粉酶基因分子標(biāo)記的獲取方法，包括以下步驟：
[0013] a.構(gòu)建不同地理來(lái)源三角帆蛘家系，獲得全同胞家系子代幼蛘；
[0014] b.從各家系幼蛘肝胰臟組織樣品中提取總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄；
[0015] c.根據(jù)已有的α-淀粉酶基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出編碼區(qū)全序列，產(chǎn)物經(jīng)純化后 測(cè)序，所有序列經(jīng)Clustal X軟件比對(duì)MEGA6. 0軟件輸出SNP位點(diǎn)；
[0016] d.用TASSEL4. 0軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)多態(tài)性和體重增重性狀的關(guān)聯(lián)分析。
[0017] 進(jìn)一步，所述步驟c中引物為正向引物為5' - ATGGCTGCCATGTTTTTACTCCT - 3'，反 向引物為 5' _ TCACTCATGTGGTAACTTTTTGGGG _ 3'。
[0018] 進(jìn)一步，，所述步驟c中擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增，25μ 1的反應(yīng)體系中，正、反引物各ΙΟρΜ， dNTP4 μ M，0· 75U 的 Taq DNA 聚合酶，cDNA 模板 20ng。
[0019] 進(jìn)一步，步驟c中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)變性2min，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 95°C變性30s, 56°C退火30s，72°C延伸2min，最后循環(huán)外72°C延伸lOmin。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：采用上述獲取方法，獲取了三角帆蛘 α -淀粉酶基因分子標(biāo)記，得到第471位點(diǎn)TT型、1026位點(diǎn)TT型、1068位點(diǎn)TT型、1320位 點(diǎn)GG型和1386位點(diǎn)GG型與三角帆蛘體重增重顯著正相關(guān)，對(duì)于選育體重性狀上有生長(zhǎng)優(yōu) 勢(shì)的三角帆蛘幼蛘具有重要意義，可加快育種進(jìn)程。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是三角帆蛘α -淀粉酶基因部分SNP位點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限 定。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 1、不同地理來(lái)源三角帆蛘家系的構(gòu)建和人工繁殖
[0025] (1)親本為4-5齡鄱陽(yáng)湖、洞庭湖、太湖等不同地理來(lái)源的三角帆蛘成年蛘，雌雄 性比為4:1放置在5-10m 2的親蛘培育池內(nèi)自然受精。
[0026] (2)受精卵在雌蛘的外鰓腔發(fā)育成鉤介幼蟲后，用黃顙魚靜水采苗法進(jìn)行人工采 苗，每個(gè)蛘黃顙魚用量30-50尾。
[0027] (3)鉤介幼蟲寄生于魚體后，不同親蛘來(lái)源的寄生魚放養(yǎng)在獨(dú)立的培育池內(nèi)，經(jīng)過(guò) 220-240個(gè)積溫周期，鉤介幼蟲在魚體上完成變態(tài)發(fā)育脫落。
[0028] (4)稚蛘在培育池內(nèi)經(jīng)30天左右培養(yǎng)，殼長(zhǎng)0. 5厘米時(shí)轉(zhuǎn)移至0. 25m2的網(wǎng)箱內(nèi)進(jìn) 行在大塘培育。網(wǎng)箱底部鋪有5cm厚的營(yíng)養(yǎng)底泥，每個(gè)網(wǎng)箱放稚蛘80-100只。
[0029] (5)三角帆蛘幼蛘培育到30天和90天后隨機(jī)每個(gè)家系取幼蛘50只進(jìn)行生長(zhǎng)性狀 的測(cè)量，包括殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、體重四個(gè)性狀。
[0030] 2、總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增
[0031] 用大連寶生物公司RNAiso Plus試劑提取各家系幼蛘肝胰臟組織總RNA，用大連 寶生物公司PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。參照RACE方法獲得的三角帆蛘 α _淀粉酶基因 cDNA全序列（GenBank accession No. KC342529)，其cDNA編碼區(qū)核昔酸序 列如下所示：
[0032] <110>紹興文理學(xué)院 金華市威旺養(yǎng)殖新技術(shù)有限公司 < 120> Ξ角帆鮮CX-淀粉酶基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用 <160〉 1 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211〉 1575
[0033] <212> DNA <213〉三角帆醉（Hyriopsis cumingii) <400> 1 atggctgcca tgtttttact cctaggtctg gttatgaccg tctttggcgc agttagggca 60 ggaacctata gcaacccaac atgcgcggat ggtcggcata ccatcaccca tctgtttaaa 120 tggaagtggt cagacattgc acaggagtgt gaaagattcc tcggccccta tggatactgt 180 ggtgtccagg tatcaccgcc gaatgaaaac cgtgtggtga ccagccccaa cagaccgtgg 240 tgggagagat accagcctgt cagctataag ctggagaccc gcagtggaaa tgaacaacaa 300 ttcagagaca tggtggaacg ttgtaacaaa gcccatgtta ggatcttccc: tgatctggta 360 atcaatcaca tgactggctc aggtggaagt ggtagcggta caggtggctc gaactgggac 420 ggtaactccc taagctatcc cggtgtacct tactcaaatt tggattttaa tgacggttcc 480 aaatgccaca ccggggattt gaatattcac aattacaaca atgcagagga agtccgaaat 540 tgtcgtctgg tgtcattggt tgatcttaac ctgggcaaag attacgtccg agggaagatt 600 gccgattata tgaaccacct aatagacatc ggtgtagccg gttttagaat cgatgccgct 660 aaacacatgt ggccaggaga cctaaccgct cttcttggac gtgtacataa tttaaatact 720 aactatttcc ctagtggaac caaacctttg atcttccagg aagttattga catgggtggc 780 gagccaatca aaatgtcgga atatttccaa tccggaaggg ttaccaattt catttatgga 840 ataaagctag ctcaggtgtt caggaaacag aaccaggcta aatttctaaa aacctgggga 900 gagggttggg gtatgccgaa taccaatgac gtcatcgtgt tcatcgataa ccatgacaac 960 caaagaggcc atggaggtgg cggtggcgtc ttgacacact tcgagcccaa accgtacaaa 1020 atggcgactg aatttatgct ggcgcatcca tacggatgga cacgcgtcat gagtagttac 1080
[0034] aactgggaca ggaattttca ggacggtgaa gataagaaca actggatagg tccaccacac 1140 aatggggata tgagtatcaa ggatgttaca atcaacagtg acatgtcatg cggagacgga 1200 tgggcatgcg agcatcgttg gcgtcagatc tacaacatgg tagcattccg taacgtagtt 1260 catggcacag gactgacaca ttggtgggac aatggcaact accagatcgc ttttgcccgt 1320 ggaaacaaag gtttcattgt catgaacgcc gaaggaagcg atctgaattc caatctacag 1380 acgggactac cccagggaac atactgtgat gtaatttccg ggaactatga gaacggacaa 1440 tgtacaggtg catcaattca cgttggaggc gatggacagg cgcattttca catttccggt 1500 ggatcggaag accctgtcat agctattcat ataggagcaa aggtcggaag ccccaaaaag 1560 ttaccacatg agtga 1575
[0035] 設(shè)計(jì)特異性引物，正向引物為5' - ATGGCTGCCATGTTTTTACTCCT - 3'，反向引物為5 ' -TCACTCATGTGGTAACTTTTTGGGG - 3'。
[0036] PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件：PCR反應(yīng)體系25 μ 1中包括正、反引物各10pM， dNTP4 μ M，10 X PCR 緩沖液 2 μ 1，0. 75U 的 Taq DNA 聚合酶，cDNA 模板 20ng。PCR 反應(yīng)程序 為95°C預(yù)變性2min，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸2min，最后 循環(huán)外72°C延伸lOmin。
[0037] PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用大連寶生物公司DNA片段純化試劑盒進(jìn)行 純化并由上海英濰捷基公司測(cè)序。
[0038] 3、α -淀粉酶基因 SNP位點(diǎn)的鑒定
[0039] 測(cè)序獲得序列經(jīng)Clustal X軟件比對(duì)后用MEGA6. 0軟件輸出SNP位點(diǎn)，圖1中為 部分SNP位點(diǎn)。
[0040] 4、關(guān)聯(lián)分析
[0041] 使用TASSEL軟件進(jìn)行α -淀粉酶基因 SNP位點(diǎn)和生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析。
[0042] 關(guān)聯(lián)分析將實(shí)驗(yàn)群體中獲得的基因序列結(jié)果、群體結(jié)構(gòu)及殼長(zhǎng)、殼寬、殼高、體重 四個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)性狀數(shù)據(jù)導(dǎo)入TASSEL軟件，使用分析單元中的邏輯回歸模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析， 閾值選擇P〈〇. 05為顯著。對(duì)T+471C、G+1026T、T+1320G、A+1386G位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表 1〇
[0043] 表1三角帆蛘α -淀粉酶基因4個(gè)SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種三角帆蛘α-淀粉酶基因的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記為α-淀粉酶 基因編碼區(qū)的 T+471C、G+1026T、T+1320G、A+1386G 等 4 個(gè) SNP 位點(diǎn)。
2. 權(quán)利要求1所述的α-淀粉酶基因的分子標(biāo)記在三角帆蛘體重性狀選育中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的α-淀粉酶基因的分子標(biāo)記在三角帆蛘體重性狀選育中的應(yīng) 用，其特征在于，第471位點(diǎn)ΤΤ型、1026位點(diǎn)ΤΤ型、1320位點(diǎn)GG型和1386位點(diǎn)GG型與三 角帆蛘體重增重顯著正相關(guān)。
4. 權(quán)利要求1所述的三角帆蛘α-淀粉酶基因分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于，包括 以下步驟： a. 構(gòu)建不同地理來(lái)源三角帆蛘家系，獲得全同胞家系子代幼蛘； b. 從各家系幼蛘肝胰臟組織樣品中提取總RNA并做cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄； c. 根據(jù)已有的α-淀粉酶基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出編碼區(qū)全序列，產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè) 序，所有序列經(jīng)Clustal X軟件比對(duì)MEGA 6. 0軟件輸出SNP位點(diǎn)； 用TASSEL 4.0軟件進(jìn)行SNP位點(diǎn)多態(tài)性和體重增重性狀的關(guān)聯(lián)分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的α-淀粉酶基因分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于，所 述步驟c中引物為正向引物為5' - ATGGCTGCCATGTTTTTACTCCT - 3'，反向引物為5' -TCACTCATGTGGTAACTTTTTGGGG - 3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的α-淀粉酶基因分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于，所述步 驟c中擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增，25μ1的反應(yīng)體系中，正、反引物各10 pM，dNTP 4 μΜ，0. 75 U的 Taq DNA 聚合酶，cDNA 模板 20 ng。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的α-淀粉酶基因分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于，步驟c中 PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件為：95 ° C預(yù)變性2 min，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95 ° C變性30 s，56 ° C退火30 s，72 ° C延伸2 min，最后循環(huán)外72 ° C延伸10 min。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104120122SQ201410200796
【公開(kāi)日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】任崗, 張根芳, 金葉飛 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院, 金華市威旺養(yǎng)殖新技術(shù)有限公司