谷子SiLEA14基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明首次克隆得到與植物逆境脅迫相關(guān)的SiLEA14基因(Seq?ID?No.1)，將所述基因轉(zhuǎn)化到植物中可提高植物抗逆性。本發(fā)明提供了一種利用SiLEA14基因增加植物抗逆性的新方法，可用于植物抗逆新品種的培育，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。
【專利說(shuō)明】谷子SiLEA14基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及谷子SiLEAH基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干旱、高鹽等環(huán)境脅迫會(huì)對(duì)農(nóng)作物造成嚴(yán)重傷害，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量大幅下降。為適應(yīng)不利的環(huán)境條件，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列的防御機(jī)制。其中，依賴Ca2+的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，胚胎晚期豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant, LEA)基因的激活能夠保護(hù)植物免受傷害(Xiong L，Schumaker KSj Zhu J(2002)Cell signaling duringcold, drought and salt stress.Plant Celll4，S165-S183)。
[0003]LEA 基因最初是在棉花種子中發(fā)現(xiàn)的(Dure L and Galau GA (1981) Developmentalbiochemistry of cotton seed embryogenesis and germination XII1.Regulationof biosynthesis of principal storage proteins.Plant Physiol.68，187-194)，在種子發(fā)育的晚期表達(dá)量很高(Baker J，Steele C and Dure IIIL (1988) Sequenceand characterization of6LEA proteins and their genes from cotton.Plant Mo1.Bi0.11, 277-291) o隨后的研究發(fā)現(xiàn)，LEA基因在植物營(yíng)養(yǎng)組織中也有表達(dá)，且受到ABA及不同脅迫的誘導(dǎo)(Liu Y，Wang Lj Xing X，Sun Lj Pan Jj Kong X，Zhang Mj Li D (2013) ZmLEA3, amultifunctional group3LEA protein from maize (Zea mays L )，is involved in biotic andabiotic stresses.Plant Cell Physiol.0，1-16)。
[0004]根據(jù)氨基 酸序列相似性和保守域，將LEA蛋白分為不同的家族。根據(jù)Battaglia的分類方法，LEA蛋白被分為7個(gè)不同的家族(Battaglia M，Olvera-CarrilloY，Garciarrubio A, Campos F，Covarrubias AA (2008) The enigmatic LEA proteins and otherhydrophilins.Plant Physiol.148，6-24)。第 1、2、3、4、6 和 7 家族的 LEA 蛋白，含有特定的結(jié)構(gòu)域，被稱為親水性的LEA蛋白，也叫典型LEA蛋白。第5家族的LEA蛋白包括了所有疏水性氨基酸含量比較高的LEA蛋白，因此被稱為非典型的LEA蛋白。根據(jù)序列的相似性，第5家族的LEA蛋白又被分為5A、5B和5C三個(gè)亞家族。5A和5B亞家族的LEA蛋白是固有的無(wú)結(jié)構(gòu)蛋白(Boucher V, Buitink Jj Lin X，Boudet Jj Hoekstra FAj Hundertmark Mj RenardD，Leprince O(2010)MtPM25is an atypical hydrophobic late embryogenesis-abundantprotein that dissociates cold and desiccation-aggregated proteins.Plant CellEnviron.33，418-430)，而5C亞家族的LEA蛋白具有天然的折疊結(jié)構(gòu)，且β -折疊的含量比 α -螺旋高(He S，Tan Lj Hu Zj Chen Gj Wang Gj Hu T (2012) Molecular characterizationand functional analysis by heterologous expression in E.coli under diverse abioticstresses for 0sLEA5，the atypical hydrophobic LEA protein from Oryza sativa L Mol.Genet.Genomics287，39-54)。
[0005]迄今為止，只有少數(shù)5C亞家族的LEA蛋白被鑒定，例如棉花LEA14-A、復(fù)活草 PcC27-45、大豆 D95-4、番茄 ER5、辣椒 CaLEA6、擬南芥 LEA14 和 At2g44060，水稻0sLEA5以及甘薯IbLEA14。煙草中過(guò)表達(dá)CaLEA6能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草抗旱及抗鹽性(Kim HS, Lee JH, Kim JJ,Kim CH, Jun SS, Hong YN(2005)Molecular and functionalcharacterization of CaLEA6, the gene for a hydrophobic LEA protein from Capsicumannuum.Gene344, 115-23)。甘薯愈傷組織中過(guò)表達(dá)IbLEA14能夠增強(qiáng)愈傷組織木質(zhì)化進(jìn)而提高其抗旱和抗鹽性(Park SC, KimYH, Jeong JC, Kim CY, Lee HS, Bang JW, KwakSS(2011)Sweetpotato late embryogenesis abundantl4(IbLEA14)gene influenceslignification and increases osmotic—and salt stress-tolerance of transgenic call1.Planta233, 621-634)。除此之外，還未見其它5C亞家族LEA基因提高轉(zhuǎn)基因植物抗逆性的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種從谷子(Setaria italica)未成熟種子的cDNA文庫(kù)中克隆得到的谷子SiLEAH基因。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供谷子SiLEAH基因在提高植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明從谷子未成熟種子cDNA文庫(kù)中篩選得到一個(gè)cDNA克隆，命名為谷子SiLEAH基因(SiLEA14基因)。該基因的序列全長(zhǎng)為821bp，包括IOObp的5’ UTR和208bp的3’ UTR，為雙鏈核酸類型，線性，其核苷酸序列為:
[0009]i) Seq ID N0.1所示的核苷酸序列；或
[0010]ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0011]iii)在嚴(yán)格條件下與Seq ID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0012]所述嚴(yán)格條件為在含0.1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0013]通過(guò)對(duì)三大數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL、NCBI和DDBJ)的檢索，發(fā)現(xiàn)SiLEAH基因編碼蛋白與水稻0sLEA5、玉米LeaH-A和擬南芥AtLEA14的序列相似性分別為77.06%,50.88%和47.06% ο SiLEA14 蛋白包含 “LEA_2” 結(jié)構(gòu)域(PF03186, 3.4e_20)，根據(jù) Battaglia 的分類方法，SiLEAH屬于5C家族成員。亞細(xì)胞定位表明SiLEAH分布于整個(gè)細(xì)胞中。熒光定量PCR分析SiLEAH基因的表達(dá)模式，表明其在谷子根、莖、葉、幼穗及未成熟種子等組織中均表達(dá)，且隨著種子的成熟，表達(dá)量提高。此外，SiLEAH基因的表達(dá)受到ABA、PEG和NaCl的誘導(dǎo)。
[0014]本發(fā)明還提供含有SiLEAH基因的載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及工程菌。
[0015]本發(fā)明還提供SiLEAH基因在提高植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用。
[0016]所述植物抗逆境脅迫是指抗旱性和抗鹽性。所述植物包括但不限于擬南芥、谷子等。[0017]本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有SiLEAH基因的載體轉(zhuǎn)入植物組織中，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
[0018]本發(fā)明進(jìn)一步提供用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)谷子SiLEAH基因的特異性引物對(duì)，所述引物對(duì)的核苷酸序列為:
[0019]上游引物:5’-CTGATGGATAAGGCCAAGGA-3’
[0020]下游引物:5’-TGTAGGTGACCTCGCAGATG-3’。[0021]本發(fā)明構(gòu)建了含有SiLEAH基因的擬南芥和谷子表達(dá)載體。
[0022]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，擬南芥表達(dá)載體上的表達(dá)盒是由Super啟動(dòng)子和來(lái)自胭脂堿合成酶(nos)基因的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域構(gòu)成，選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因(hpt)。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為PS1300載體，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pS1300-SiLEA14，其中SiLEA14基因正向插入，且在Super啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下。
[0023]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，谷子表達(dá)載體上的表達(dá)盒是由玉米Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自胭脂堿合成酶(nos)基因的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域構(gòu)成，選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因(hpt)。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為pCOU載體，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pC0U-SiLEA14-flag，其中SiLEA14基因正向插入，并且在Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下。
[0024]本發(fā)明將含有所述SiLEAH基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，如擬南芥和谷子，獲得了抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0025]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將含有所述SiLEAH基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗旱和抗鹽性提高。
[0026]另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，將含有所述SiLEAH基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化谷子，獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗旱和抗鹽性提高。
[0027]本發(fā)明首 次克隆得到與植物逆境脅迫相關(guān)的SiLEAH基因，將所述基因轉(zhuǎn)化到植物中可提高植物抗逆性。本發(fā)明提供了一種利用SiLEA14基因增加植物抗逆性的新方法，可用于植物抗逆新品種的培育，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為本發(fā)明實(shí)施例2中含有SiLEAH基因的擬南芥表達(dá)載體的T-DNA區(qū)域圖。
[0029]圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中含有SiLEAH基因的谷子表達(dá)載體T-DNA的區(qū)域圖。
[0030]圖3為本發(fā)明實(shí)施例6中轉(zhuǎn)基因擬南芥中SiLEAH基因的檢測(cè)結(jié)果；其中，A為PCR檢測(cè)結(jié)果，B為RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0031]圖4為本發(fā)明實(shí)施例7中轉(zhuǎn)基因谷子中SiLEAH基因的檢測(cè)結(jié)果；其中，A為PCR檢測(cè)結(jié)果，B為RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0032]圖5為本發(fā)明實(shí)施例8中SiLEAH轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗逆性分析結(jié)果；其中，A為轉(zhuǎn)SiLEAH基因擬南芥植株的種子分別點(diǎn)播在MS培養(yǎng)基及含有125mM NaCl和250mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8天后擬南芥的生長(zhǎng)情況，B為不同處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因擬南芥植株見光生長(zhǎng)8天后的生物量。
[0033]圖6為本發(fā)明實(shí)施例9中SiLEAH轉(zhuǎn)基因谷子萌發(fā)階段的抗逆性分析結(jié)果；其中，A為萌發(fā)生長(zhǎng)4天的抗逆性分析，B為萌發(fā)生長(zhǎng)9天的抗逆性分析。
[0034]圖7為本發(fā)明實(shí)施例10中SiLEAH轉(zhuǎn)基因谷子幼苗的抗鹽性分析結(jié)果；其中，A為轉(zhuǎn)基因谷子幼苗分別在水、150mM和250mM NaCl脅迫下的生長(zhǎng)狀態(tài)，B為電導(dǎo)率、脯氨酸及可溶性糖含量測(cè)定結(jié)果。
[0035]圖8為本發(fā)明實(shí)施例11中SiLEAH轉(zhuǎn)基因谷子的抗旱性分析結(jié)果；其中，A為轉(zhuǎn)基因谷子幼苗在水、干旱處理7天及復(fù)水3天后的生長(zhǎng)狀態(tài)，B為復(fù)水后的存活率統(tǒng)計(jì)，C為脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果，D為可溶性糖含量測(cè)定結(jié)果?！揪唧w實(shí)施方式】
[0036]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。
[0037]實(shí)施例1植物抗逆脅迫相關(guān)基因SiLEAH的克隆
[0038]選取谷子授粉后第5、7及12天的未成熟種子，材料混合后，提取總RNA，磁珠法富集mRNA (試劑盒購(gòu)自Promega公司),采用Stratagene公司的cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，雙鏈cDNA補(bǔ)平后，連接EcoRI接頭，將其構(gòu)建至λ ZAPII載體上，用ZAP-cDNAGigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene公司)進(jìn)行體外包裝。包裝完畢后，加入SM溶液和氯仿，離心后，上清即為構(gòu)建好的文庫(kù)。取I μ I文庫(kù)上清液進(jìn)行滴度測(cè)定，結(jié)果表明構(gòu)建的文庫(kù)容量為2X107pfu/ml。原始文庫(kù)構(gòu)建完成后，進(jìn)行一次擴(kuò)增，備用。
[0039]挑選序列測(cè)序，然后利用RACE技術(shù)(Invitrogen公司)獲得谷子SiLEAH基因的全長(zhǎng)核苷酸序列(Seq ID N0.1)。具體如下:
[0040]提取四周齡的谷子葉片總RNA，電泳檢測(cè)其完整性。利用小牛腸堿性磷酸酶(CIP)去掉非mRNA及mRNA片斷5’端的磷酸基團(tuán)。然后，利用煙草酸性焦磷酸化酶(TAP)去掉完整mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，用T4RNA連接酶將GeneRacer RNA Oligo連接到去帽的mRNA5’端。最后，利用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶和GeneRacer Oligo dT引物反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈。分別使用特異引物Gene Racer和5’基因特異引物或3’基因特異引物進(jìn)行TouchdownPCR反應(yīng)。5’ -RACE擴(kuò)增出一段350bp左右的片段，而3’ -RACE擴(kuò)增出一段230bp左右的片段。回收5’ -RACE和3’ -RACE獲得的片段 ，與pMD19T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鑒定正確的克隆進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序后的片段與已知片段序列拼接組裝，獲得821bp的cDNA全長(zhǎng)序列。
[0041]實(shí)施例2用于擬南芥中表達(dá)SiLEAH基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
[0042]表達(dá)盒是由根癌農(nóng)桿菌的Super啟動(dòng)子(即由mas啟動(dòng)子融合3個(gè)ocs增強(qiáng)子和 I 個(gè) mas 增強(qiáng)子得到的，參見 Leisner SM, Gelvin SB (1988) Structure of the octopinesynthse upstream activator sequence.PNAS85, 2553-2557)和來(lái)自胭脂喊合成酶(nos)基因的 3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(Depicker A, Stachel S., Dhaese P, Zam bryski P, Goodman HM (1982).Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.J Mol.Appl Genet.1, 561-573)組成，選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因(hpt)。其T-DNA區(qū)域如圖1所示。
[0043]以含有SiLEAH基因的質(zhì)粒為模板，利用PCR方法得到兩端帶有Hind III和SpeI酶切位點(diǎn)的SiLEA基因片段，連接到PMD19T載體上，測(cè)序正確后用Hind III和Spe I進(jìn)行雙酶切，回收約600bp的片段。pS1300載體含有過(guò)表達(dá)啟動(dòng)子super promoter (LeisnerSM, Gelvin SB (1988) Structure of the octopine synthase upstream activator sequence.PNAS85，2553-2557)，用Hind III和Spe I進(jìn)行雙酶切，回收載體大片段。將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到由Super啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SiLEA14基因正向插入的重組質(zhì)粒pS1300-SiLEA14。將pS1300_SiLEA14采用凍融法直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,獲得含有重組質(zhì)粒 pS1300-SiLEA14 的農(nóng)桿菌 GV3101 (pS1300_SiLEA14)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)參見(Holsters M, de Waele D, Depicker A, Messens E, van Montagu M, SchellJ (1978)Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens.Mol.Gen.Genet.163(2)，181-7)。
[0044]實(shí)施例3用于谷子中表達(dá)SiLEAH基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
[0045]表達(dá)盒是由玉米Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)自胭脂堿合成酶(nos)基因的3’轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域(Depicker A, Stachel S., Dhaese P, Zam bryski P, Goodman HM (1982).Nopalinesynthase: transcript mapping and DNA sequence.J Mol.Appl Genet.1, 561-573)構(gòu)成，選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾亓姿徂D(zhuǎn)移酶基因(hpt)。其T-DNA區(qū)域如圖2所示。
[0046]以含有帶f lag-tag標(biāo)簽的SiLEAH基因的質(zhì)粒為模板，利用PCR方法得到兩端帶有BamH I和Kpn I酶切位點(diǎn)的SiLEA基因片段，連接到pMD19T載體上，測(cè)序正確后用BamH I和Kpn I進(jìn)行雙酶切，回收約600bp的片段。用BamH I和Kpn I對(duì)表達(dá)載體pCOU (含玉米Ubiquitin啟動(dòng)子)進(jìn)行雙酶切，回收載體大片段。將載體和目的片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，得到由Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SiLEA14基因正向插入的重組質(zhì)粒pC0U-SiLEA14-flag。將pC0U_SiLEA14-f lag采用凍融法直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，獲得含有重組質(zhì)粒 pC0U-SiLEA14-flag 的農(nóng)桿菌 GV3101 (pC0U_SiLEA14-f lag)。
[0047]實(shí)施例4pS1300_SiLEA14表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥
[0048]在野生型擬南芥抽苔4_5cm時(shí)剪去頂端花序，使腋生花序生長(zhǎng)，約4_5天后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此時(shí)植物次級(jí)花序即將開花，或僅有極少的花已開，是轉(zhuǎn)化最佳時(shí)期。轉(zhuǎn)化前要使土壤盡量濕透，將大的花蕾去掉，只保留未開放的小花蕾。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥植株的方法采用花芽浸泡法(Clough SJ and Bent AF(1998)Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.PlantJ.16，735-743)。將擬南芥整株與花盆一起倒扣在盛有200ml稀釋好的實(shí)施例2中制備的農(nóng)桿菌GV3101菌液(0D_ = 0.6)的容器中浸泡2_3min，期間輕微晃動(dòng)。浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤中，置22°C，蓋上黑色塑料布，24h后揭開塑料布，直立放置花盆，進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)。等果莢成熟后，收獲種子。收獲的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株的種子用70%酒精處理2min，0.5%次氯酸鈉消毒處理8-10min，再用無(wú)菌水洗滌4-6遍。將種子均勻置于含30μ g/ml Hyg的MS培養(yǎng)基上，于4°C暗培養(yǎng)2-3天進(jìn)行春化，然后于22°C光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗)7-10天，抗性苗表現(xiàn)為苗深綠色，有真葉，根伸長(zhǎng)至培養(yǎng)基中。將抗性苗移栽到花盆(花卉營(yíng)養(yǎng)土:蛭石=1:1，重量比)培養(yǎng)，獲得T1代轉(zhuǎn)基因種子。
[0049]實(shí)施例5pC0U-SiLEA14_flag表達(dá)載體轉(zhuǎn)化谷子
[0050]選取枝梗分化期(約出苗45天)的谷子幼穗，用75%乙醇噴灑幼穗的外部苞葉，在超凈臺(tái)中用刀片去除苞葉，切分幼穗為0.5cm左右的小片段，置于誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基(MS+2mg/L2, 4-D+lg/L 脯氨酸 +800mg/L 酸水解酪蛋白 +5mg/L AgN0s+30g/L 鹿糖 +3.5g/L植物凝膠，pH5.8)上，黑暗條件下25~27°C培養(yǎng)，約一周后長(zhǎng)出愈傷組織，每?jī)芍芾^代一次。大約生長(zhǎng)一個(gè)月后，選取質(zhì)地致密，顏色淡黃的愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。
[0051]選取狀態(tài)好的愈傷組織，置于加入實(shí)施例3中制備的農(nóng)桿菌的MS培養(yǎng)基(MS+100 μ mol/L 乙酰丁香酮 +15g/L 葡萄糖 +lg/L 脯氨酸 +2mg/L2, 4_D,pH5.8)中，慢慢搖動(dòng)30min，侵染愈傷組織，倒掉MS培養(yǎng)基，將侵染的愈傷組織放到濾紙上在超凈臺(tái)上吹干。將侵染過(guò)的愈傷組織置于MS共培養(yǎng)基(MS+lOOymol/L乙酰丁香酮+15g/L葡萄糖+lg/L脯氨酸+800mg/L酸水解酪蛋白+2mg/L2，4-D+3.5g/L植物凝膠，pH5.8)中，與實(shí)施例3中制備的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3天。然后，用滅菌水洗凈愈傷表面殘留的農(nóng)桿菌，直至含有愈傷組織的溶液不再渾濁為止。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基(MS+2.0mg/L2, 4-D+lg/L脯氨酸+800mg/L酸水解酪蛋白+500mg/L頭孢青霉素+30g/L蔗糖+3.5g植物凝膠，pH5.8)中恢復(fù)培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基+2mg/L2，4_D+5mg/L AgN03+lg/L脯氨酸+800mg/L酸水解酪蛋白+500mg/L頭孢青霉素+5mg/L潮霉素+30g/L蔗糖+3.5g/L植物凝膠，ρΗ5.8)上，篩選培養(yǎng)50天左右，獲得抗性愈傷組織。將抗性愈傷組織置于分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基 +2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+250mg/L 頭孢青霉素 +5mg/L 潮霉素 +30g/L 蔗糖 +3.5g 植物凝膠，PH5.8)上培養(yǎng)一個(gè)月后，一部分愈傷組織的表面會(huì)分化產(chǎn)生綠芽，將綠芽切分到生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+5mg/L潮霉素+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+3.5g植物凝膠，pH5.8)中生根，待苗長(zhǎng)大后，移栽到小盆里，置于溫室培養(yǎng)。
[0052]實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因擬南芥中SiLEAH基因表達(dá)的檢測(cè)
[0053]SDS法小量提取擬南芥葉片基因組DNA，利用SiLEAH基因特異引物(SiLEA14_l:5’ -AATGGATATCATGGCGAGCGAGCACG-3’ 和 SiLEA14_2:5’ -CCGCTCGAGTGCTCGCCTCTGATGGGGTGC-3’)，進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果如圖3A所示，顯示潮霉素篩選的14株轉(zhuǎn)基因擬南芥均為陽(yáng)性。
[0054]TRIzoI法提取擬南芥葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用SiLEA14 基因的特異引物(qSiLEA14-3:5’ -CTGATGGATAAGGCCAAGGA-3’ 和 qSiLEA14_4:5’ -TGTAGGTGACCTCGCAGATG-3’)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3B所示，顯示SiLEA14基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄。
[0055]實(shí)施例7轉(zhuǎn)基因谷子中SiLEAH基因表達(dá)的檢測(cè)
[0056]SDS法小量提取谷子葉片基因組DNA，利用篩選標(biāo)記基因hpt特異引物(hpt_3:5’ -TCGGCTCCAACAATGTCCTG-3’ 和 hpt_4:5’ -CGGTCGGCATCTACTCTATTCC-3’)，進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。結(jié)果如圖4A所示，在獲得的139株再生植株中，有36株鑒定為PCR陽(yáng)性。
[0057]用TRIzoI法提取谷子葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，以SiLEA14 基因的特異引物(qSiLEA14-3:5’ -CTGATGGATAAGGCCAAGGA-3’ 和 qSiLEA14_4:5’-TGTAGGTGACCTCGCAGATG-3’)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖4B所示，顯示過(guò)表達(dá)株系L68、L76和L78中SiLEAH基因的表達(dá)量是野生型對(duì)照(WT)的4_10倍。
[0058]實(shí)施例8SiLEA14轉(zhuǎn)基因擬南芥抗逆性分析
[0059]將野生型(WT)和轉(zhuǎn)SiLEAH基因擬南芥純系植株(L6和L9)的種子分別點(diǎn)播在MS培養(yǎng)基及含有125mM NaCl和250mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8天后觀察擬南芥的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖5A所示。在未添加任何脅迫誘導(dǎo)物時(shí)，WT和轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)情況相似，長(zhǎng)勢(shì)一致，說(shuō)明在正常情況下，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系的生長(zhǎng)無(wú)差異。在含有125mMNaCl時(shí)，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)受到抑制，生長(zhǎng)緩慢，但是轉(zhuǎn)基因株系受抑制程度較弱，根長(zhǎng)較野生型長(zhǎng)。在含有250mM甘露醇時(shí)，野生型和轉(zhuǎn)基因株系種子的萌發(fā)及生長(zhǎng)也表現(xiàn)出差異，轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)和生長(zhǎng)狀況明顯好于野生型。
[0060]與此同時(shí)，分別測(cè)量了轉(zhuǎn)基因株系(L6和L9)和野生型(WT)在兩個(gè)處理?xiàng)l件下見光生長(zhǎng)8天后的生物量，結(jié)果如圖5B所示。結(jié)果表明，在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因株系與野生型的生物量沒有顯著差異，而在NaCl和甘露醇處理?xiàng)l件下，野生型的干重和濕重均明顯低于轉(zhuǎn)基因株系。以上的研究結(jié)果表明，在一定的脅迫強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)SiLEAH基因的擬南芥對(duì)鹽和甘露醇脅迫的敏感性低于野生型，說(shuō)明SiLEAH基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗?jié)B透脅迫能力。[0061]實(shí)施例9SiLEA14轉(zhuǎn)基因谷子萌發(fā)階段的抗逆性分析
[0062]選取野生型及L68、L76和L78三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T1代種子分別在含有10% PEG、20% PEG、150mM NaCl、250mM NaCl和10 μ M ΑΒΑ的水溶液中萌發(fā)4天和9天，對(duì)它們的胚芽和胚根長(zhǎng)度做了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖6所示。在10%的PEG處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)受到輕微抑制，而20%的PEG處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的種子都受到嚴(yán)重的抑制。但是相比較而言，轉(zhuǎn)基因株系比野生型有較好的生長(zhǎng)勢(shì)。NaCl嚴(yán)重抑制了種子的萌發(fā)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系在150mM和250mM兩種濃度的NaCl處理4天后，萌動(dòng)速率較快，具有較高的發(fā)芽勢(shì)，而生長(zhǎng)9天后，轉(zhuǎn)基因株系較野生型生長(zhǎng)旺盛，并且有部分種子的真葉露出芽鞘。在ΙΟμΜΑΒΑ的水溶液中，野生型種子的萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制，沒有胚芽，只有輕微的露白，甚至不萌發(fā)，轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)也受到抑制，但是萌發(fā)率較高，具有較高的發(fā)芽勢(shì)。生長(zhǎng)9天后，轉(zhuǎn)基因株系比野生型的根有顯著的生長(zhǎng)勢(shì)，并且第一片和第二片幼葉也都已經(jīng)展開，而野生型生長(zhǎng)較弱。以上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)SiLEAH基因可以提高谷子種子對(duì)滲透脅迫的忍受能力。 [0063]實(shí)施例1OSiLEAH轉(zhuǎn)基因谷子幼苗的抗鹽性分析
[0064]選取兩周齡的野生型及L68、L76和L78三個(gè)轉(zhuǎn)基因谷子幼苗進(jìn)行了鹽脅迫處理，結(jié)果如圖7所示。正常生長(zhǎng)情況下，轉(zhuǎn)基因株系比野生型谷子無(wú)明顯差異。當(dāng)用150mM的NaCl處理幼苗一周后，野生型谷子生長(zhǎng)緩慢，剛長(zhǎng)出的幼嫩葉片開始略微卷曲，而轉(zhuǎn)基因株系的葉片表現(xiàn)正常，生長(zhǎng)較野生型粗壯。用250mM的NaCl處理一周后，野生型谷子整株開始萎蔫，并有嚴(yán)重的老葉枯黃現(xiàn)象，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，而轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)基本正常，只有部分老葉葉尖開始枯黃萎蔫。
[0065]電導(dǎo)率測(cè)定顯示，未處理時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系的電解質(zhì)滲透率比野生型較低。當(dāng)150mMNaCl處理一周后，兩者的電解質(zhì)滲漏率都有略微升高；當(dāng)250mM NaCl處理一周后，兩者的電解質(zhì)滲漏率明顯升高。而轉(zhuǎn)SiLEAH基因谷子的電解質(zhì)滲漏率明顯低于野生型谷子。植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量測(cè)定顯示，未處理時(shí)，野生型谷子和轉(zhuǎn)基因谷子的脯氨酸含量都很低，無(wú)明顯差異。當(dāng)150mM和250mMNaCl處理一周后，脯氨酸含量均有增加，且轉(zhuǎn)基因株系中脯氨酸含量的提高更為顯著?？扇苄蕴堑暮繙y(cè)定結(jié)果顯示，未處理時(shí)轉(zhuǎn)基因株系和野生型的可溶性糖含量無(wú)明顯差異。當(dāng)150mM和250mMNaCl處理一周后，轉(zhuǎn)基因株系的可溶性糖含量明顯高于野生型。以上結(jié)果表明，SiLEAH基因過(guò)表達(dá)谷子有較強(qiáng)的耐鹽能力。
[0066]實(shí)施例1lSiLEAH轉(zhuǎn)基因谷子幼苗的抗旱性分析
[0067]選取兩周齡的野生型及L68、L76和L78三個(gè)轉(zhuǎn)基因谷子幼苗進(jìn)行了干旱鹽脅迫處理，結(jié)果如圖8所示。正常生長(zhǎng)情況下，轉(zhuǎn)基因株系和野生型谷子長(zhǎng)勢(shì)無(wú)明顯差異。當(dāng)干旱處理7天后，超過(guò)90%的野生型谷子葉片卷曲萎蔫，而只有20 %的轉(zhuǎn)基因谷子表現(xiàn)出類似現(xiàn)象。復(fù)水3天后，約74-100%的轉(zhuǎn)基因株系存活，明顯高于野生型的14%。
[0068]葉片生長(zhǎng)緩慢，剛長(zhǎng)出的幼嫩葉片開始略微卷曲，而轉(zhuǎn)基因株系的葉片表現(xiàn)正常，生長(zhǎng)較野生型粗壯。用250mM的NaCl處理一周后，野生型谷子整株開始萎蔫，并有嚴(yán)重的老葉枯黃現(xiàn)象，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，而轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)基本正常，只有部分老葉葉尖開始枯黃萎蔫。
[0069]游離脯氨酸的含量測(cè)定顯示，未處理時(shí)，野生型谷子和轉(zhuǎn)基因谷子的脯氨酸含量都很低，無(wú)明顯差異。當(dāng)干旱處理3天后，脯氨酸含量均有增加，且轉(zhuǎn)基因株系L68和L78中脯氨酸含量的提高更為顯著?？扇苄蕴堑暮繙y(cè)定結(jié)果顯示，未處理時(shí)轉(zhuǎn)基因株系和野生型的可溶性糖含量無(wú)明顯差異。當(dāng)干旱處理3天后，轉(zhuǎn)基因株系L68和L76的可溶性糖含量明顯高于野生型。以上結(jié)果表明，SiLEAH基因過(guò)表達(dá)谷子有較強(qiáng)的耐旱能力。
[0070]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā) 明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.谷子SiLEA14基因，其特征在于，其核苷酸序列為: i)SeqID N0.1所示的核苷酸序列；或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii)在嚴(yán)格條件下與SeqID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含0.1% SDS的0.1 X SSPE或含0.1% SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的載體。
3.含有權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述載體的工程菌。
4.權(quán)利要求1所述基因在提高植物抗逆境脅迫中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物抗逆境脅迫是指抗旱性和抗鹽性。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括但不限于擬南芥、谷子。
7.—種轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求2所述的載體轉(zhuǎn)入植物組織中，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
8.用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)谷子SiLEAH基因的特異性引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的核苷酸序列為: 上游引物:5’ -CTGATGGATAAGGCCAAGGA-3’ 下游引物:5’-TGTAGGTGACCTCGCAGATG-3’。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017810SQ201410200877
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】于靜娟, 王梅珍, 朱登云, 李萍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)