一種山羊mstn基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)及其應(yīng)用方法，所述山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)，即能夠有效的識(shí)別、修飾山羊MSTN基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs；本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由分別能夠特異識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1F和TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R和TALEN-L組成；所述核酸酶TALEN-L為SEQ?ID?NO.2或SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，所述核酸酶TALEN-R為SEQ?ID?NO.4或SEQ?ID?NO.5所示核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開(kāi)了使用上述敲除系統(tǒng)對(duì)山羊細(xì)胞MSTN基因進(jìn)行靶向修飾，獲得突變細(xì)胞系的方法。本發(fā)明對(duì)于在山羊上對(duì)MSTN基因進(jìn)行敲除或改造以獲得優(yōu)質(zhì)瘦肉率的新品種及MSTN基因調(diào)控機(jī)理研究具有重大應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶及其編碼基因與應(yīng)用，具體的說(shuō)是利用一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶定點(diǎn)修飾山羊MSTN基因。
【背景技術(shù)】
[0002]肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)廣泛存在于動(dòng)物骨骼肌內(nèi)，是骨骼肌生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，MSTN基因在動(dòng)物胚胎發(fā)育期和成年期的骨骼肌中都有表達(dá)。小鼠、大鼠、人、牛、豬、羊、雞、火雞、斑馬魚(yú)的MSTN基因的cDNA已經(jīng)被克隆、測(cè)序。研究結(jié)果表明，MSTN基因含有3個(gè)外顯子，并且在不同物種間MSTN基因序列高度保守。敲除MSTN基因會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物肌纖維廣泛性增生和肥大，骨骼肌量顯著增加。小鼠、大鼠、人、豬、雞、牛、綿羊、狒狒和斑馬魚(yú)等物種的MSTN基因編碼序列發(fā)生點(diǎn)突變或移碼突變，均呈現(xiàn)“雙肌癥狀”(double muscling),表現(xiàn)出肌肉量顯著增加的性狀。目前已經(jīng)在人、牛、綿羊、狗等物種中發(fā)現(xiàn)了自然發(fā)生的MSTN基因的突變,如比利時(shí)蘭牛(Belgian blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等在exon3序列上發(fā)生突變，機(jī)體表現(xiàn)出雙肌性狀。
[0003]按照人類(lèi)意愿對(duì)基因組進(jìn)行定向修飾一直是許多科學(xué)家的夢(mèng)想。通過(guò)對(duì)MSTN基因進(jìn)行突變、缺失、敲除等遺傳修飾，獲得基因突變動(dòng)物，一方面可以構(gòu)建出具有“雙肌癥狀”的動(dòng)物模型用于生物學(xué)研究和疾病機(jī)理研究，另一方面可以達(dá)到改進(jìn)肌肉質(zhì)量和重量的目的，生產(chǎn)具有商業(yè)化性質(zhì)的優(yōu)良品種家畜。
[0004]人們一直在尋找簡(jiǎn)單高效的方法對(duì)基因組進(jìn)行靶向修飾。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機(jī)重組交換，中靶比例極低，通常只有10_6-10_8，未被廣泛應(yīng)用。近年來(lái)核酸酶指導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)發(fā)展迅速。這類(lèi)核酸酶通常由一個(gè)DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，由DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域特異的識(shí)別靶位點(diǎn)，把核酸酶定位到需要進(jìn)行編輯的基因組區(qū)域，然后由非特異性核酸內(nèi)切酶切斷DNA雙鏈，引起DNA自我修復(fù)機(jī)制，從而引發(fā)基因序列的突變和促進(jìn)同源重組的發(fā)生。
[0005]人工鋅指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZFN)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)。ZFN是一種由能夠識(shí)別特異的DNA序列的結(jié)構(gòu)域與Fok I內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域融合而成的蛋白，通過(guò)識(shí)別特定的DNA序列使得Fok I核酸內(nèi)切酶在靶位點(diǎn)形成二聚體產(chǎn)生內(nèi)切酶活性，造成靶位點(diǎn)DNA雙鏈的斷裂，從而引發(fā)非同源末端連接以及同源重組修復(fù)機(jī)制。在修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生的移碼突變可被用來(lái)對(duì)目的基因進(jìn)行基因敲除，同源重組伴隨外源基因的插入可被用來(lái)執(zhí)行特異位點(diǎn)的基因敲入。ZFN技術(shù)曾被認(rèn)為對(duì)基因功能或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物意義重大，但是飽含著希望與失望，由于ZFN受上下文依賴效應(yīng)影響與靶點(diǎn)DNA序列之間結(jié)合不穩(wěn)定，不能靶向所有序列，使用前需要大量的篩選和鑒定工作，并且產(chǎn)生脫靶性切割引入無(wú)法預(yù)期的基因突變可能性高。此外，商業(yè)購(gòu)買(mǎi)高效特異的ZFN價(jià)格昂貴，而研究者很難自行設(shè)計(jì)出特異和高效的ZFN。
[0006]近幾年研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子(transcription activator-likeeffector, TALE)具有DNA結(jié)合特異性，并且其識(shí)別密碼具有模塊化和簡(jiǎn)單化特點(diǎn)，TALE-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由串聯(lián)重復(fù)單元組成，大部分單元含34個(gè)氨基酸，單元的第12和13位氨基酸高度可變，成為重復(fù)可變區(qū)(repeat variable diresidues, RVDs)。TALE的RVDs識(shí)別DNA序列的4個(gè)堿基具有高度專(zhuān)一性，第13位氨基酸直接與DNA的堿基特異結(jié)合。研究者能夠根據(jù)DNA序列，在任意位點(diǎn)構(gòu)建特異的TALE-DNA識(shí)別結(jié)合域，可以廣泛用于基因序列突變修飾和基因打靶等。
[0007]設(shè)定DNA靶序列，組裝TALE-DNA結(jié)合域，融合Fok I內(nèi)切酶的非特異性DNA切割域，組裝成 TALE 核酸酶(tanscription activator-like effector nucleases, TALENs)。TALENs靶向結(jié)合DNA，F(xiàn)ok I非特異性切割DNA序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DNA double-srandbreaks, DSBs)。在真核細(xì)胞內(nèi)DSBs激活兩條保守的DNA修復(fù)通路:非同源末端連接修復(fù)(non-homologous end joining, NHEJ)可以將斷裂的染色體重新連接,在連接過(guò)程中斷裂位點(diǎn)有可能引入小片段堿基的丟失或插入，從而影響基因功能或產(chǎn)生基因敲除效應(yīng)。若此時(shí)引入同源重組載體；同源指導(dǎo)修復(fù)(homology-directed repair, HDR)能夠利用相似的DNA模板指導(dǎo)修復(fù)，替代斷裂點(diǎn)周?chē)腄NA序列，實(shí)現(xiàn)特定突變或定點(diǎn)導(dǎo)入外源DNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一種山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)及其在山羊MSTN基因修飾中的應(yīng)用方法。
[0009]本發(fā)明中術(shù)語(yǔ)山羊MSTN基因是指山羊肌肉生成抑制蛋白(Myostatin，MSTN)基因。
[0010]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:
[0011]一種山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)，所述定點(diǎn)修飾系統(tǒng)為一對(duì)山羊MSTN基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs，能夠有效剪切山羊MSTN基因靶序列；
[0012]所述山羊MSTN基因靶序列如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列，23-40位核苷酸為識(shí)別模塊TALMEX-1F，57-74位核苷酸的反向互補(bǔ)序列為識(shí)別模塊TALMEX-1R，41-56位核苷酸為間隔序列；
[0013]所述的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R組成；
[0014]所述核酸酶TALEN-L，其特征在于，由TALMEX-1F識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-L與經(jīng)過(guò)人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成；所述核酸酶TALEN-R，其特征在于，由TALMEX-1R識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-R與經(jīng)過(guò)人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成；
[0015]所述識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述DNA切割蛋白Fok-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示2023-2814位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述DNA切割蛋白Fok-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示2023-2808位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
[0016]本發(fā)明還提供上述山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟:
[0017] (I)根據(jù)山羊MSTN基因選擇SEQ ID N0.1所示核苷酸序列為靶序列，SEQ ID N0.1所示核苷酸序列中23-40位核苷酸為識(shí)別模塊TALMEX-1F，與57-74位核苷酸反向互補(bǔ)的序列為識(shí)別模塊TALMEX-1R，41-56位核苷酸為間隔序列；[0018](2)根據(jù)步驟(1)所得識(shí)別模塊TALMEX-1F和識(shí)別模塊TALMEX-1R合成剪切所述靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs ;所述轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R 組成；
[0019]所述核酸酶TALEN-L的核苷酸編碼序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示，所述核酸酶TALEN-R的核苷酸編碼序列如SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示；
[0020]本發(fā)明還公開(kāi)了含有上述山羊MSTN基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)編碼基因的重組表達(dá)載體、重組菌或重組細(xì)胞系；
[0021]公開(kāi)了所述山羊MSTN基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)在靶細(xì)胞中修飾目的基因核酸序列的應(yīng)用。所述MSTN基因定點(diǎn)敲除系統(tǒng)在其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞MSTN基因修飾中的應(yīng)用。
[0022]一種定點(diǎn)敲除山羊MSTN基因的方法，包括在山羊細(xì)胞中表達(dá)上述定點(diǎn)敲除系統(tǒng)的步驟。
[0023]進(jìn)一步提供了能夠表達(dá)所述TALENs的mRNA,其特征在于，所述mRNA序列以TALEN-L和TALEN-R所示的核苷酸序列為轉(zhuǎn)錄模板。以及所述mRNA在山羊細(xì)胞或受精卵中刪除MSTN基因的應(yīng)用。 [0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0025]1、已經(jīng)發(fā)現(xiàn)牛、綿羊和人等物種出現(xiàn)MSTN基因的天然突變，并且能夠引起雙肌性狀，但受限于技術(shù)因 素，應(yīng)用同源打靶技術(shù)或ZFN方法很難實(shí)現(xiàn)山羊MSTN基因的高效突變。因此，本發(fā)明通過(guò)TALEN技術(shù)對(duì)山羊MSTN基因進(jìn)行TALENs編輯，獲得MSTN基因靶序列發(fā)生突變的細(xì)胞系，為進(jìn)一步驗(yàn)證MSTN基因?qū)ι窖蚣∪馍L(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制提供了可行的材料和方法。
[0026]2、本發(fā)明獲得的MSTN基因靶序列發(fā)生突變的細(xì)胞系，能夠作為體細(xì)胞核移植制備MSTN基因突變山羊的核供體細(xì)胞，為改善山羊肉質(zhì)和提高山羊出肉率提供新的技術(shù)途徑，對(duì)于在山羊上對(duì)MSTN基因進(jìn)行敲除或改造以獲得優(yōu)質(zhì)瘦肉率的新品種及研究MSTN基因?qū)ι窖蚣∪馍L(zhǎng)的調(diào)控機(jī)理具有重大應(yīng)用價(jià)值。
[0027]3、本發(fā)明TALENs構(gòu)建是針對(duì)山羊MSTN基因特定靶序列的重組核酸酶，在特異的位點(diǎn)切斷基因DNA，引發(fā)非同源末端連接修復(fù)，進(jìn)而產(chǎn)生MSTN基因Knock-out突變。他克服了常規(guī)的ZFN方法不能識(shí)別任意目標(biāo)基因序列，脫靶率高，以及識(shí)別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問(wèn)題；也克服了同源重組工作量大，突變率低，需要引入外源基因或標(biāo)記基因等問(wèn)題；而具有ZFN相等或更高的活性，在不引入外源基因或標(biāo)記基因情況下，使MSTN基因定點(diǎn)突變變得更加簡(jiǎn)單、方便，并且使用此類(lèi)突變細(xì)胞在后續(xù)應(yīng)用中能夠獲得生物安全性更高的基因突變動(dòng)物品系。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為T(mén)ALENs定點(diǎn)修飾山羊MSTN基因的作用原理示意圖；
[0029]圖2為pTALEN-L和pTALEN-R質(zhì)粒示意圖；
[0030]圖3為細(xì)胞樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；
[0031]圖4為細(xì)胞樣品擴(kuò)增產(chǎn)物AluI酶切電泳圖；
[0032]圖5為T(mén)ALENs活性檢測(cè)測(cè)序峰圖；[0033]圖6為突變細(xì)胞株L4測(cè)序峰圖
[0034]圖7為L(zhǎng)4、L6、L7、L10、L11、L13樣品TA克隆測(cè)序結(jié)果；注:WT表示野生型基因序列；八表示出現(xiàn)基因缺失突變；fragmesshift表示發(fā)生堿基替換；
[0035]圖8為L(zhǎng)9、L16樣品測(cè)序峰值圖；注:峰值單一無(wú)套峰，表明發(fā)生雙等位基因發(fā)生的突變情況完全一致；
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，具體操作過(guò)程按照下面步驟進(jìn)行:
[0037]第一步、根據(jù)需敲除的基因序列設(shè)計(jì)出具有特異性的序列TALEN靶點(diǎn)；
[0038]第二步、根據(jù)設(shè)計(jì)出的TALEN靶點(diǎn)構(gòu)建出TALEN質(zhì)粒；
[0039]第三步、將TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞；[0040]第四步、對(duì)轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞進(jìn)行篩選、培養(yǎng)、挑取單克隆，單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，鑒定單克隆細(xì)胞基因組突變情況，挑選出符合突變要求的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。
[0041]下述實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0042]下述實(shí)例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)獲得，可用類(lèi)試劑或試劑盒替代。
[0043]實(shí)例山羊胎兒成纖維細(xì)胞MSTN基因修飾
[0044]MSTN基因與肌肉生長(zhǎng)調(diào)控有關(guān)。本發(fā)明應(yīng)用TALENs技術(shù)，針對(duì)山羊MSTN基因exonl的AGCT位點(diǎn)進(jìn)行密碼子突變操作，從而實(shí)現(xiàn)MSTN基因的修飾。
[0045]1、本實(shí)例所需材料與試劑
[0046]FastTALETM TALEN Assembly kit 試劑盒由 Sidansai BiotechnologyC0., LTD (http://www.sidansa1.com/)提供。該試劑盒由8個(gè)骨架載體，172個(gè)RVD單體識(shí)別模塊及5種模塊連接操作液等組成。
[0047]感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生興生物技術(shù)(南京)有限公司，Cla 1.AluI內(nèi)切酶、DNA Marker等購(gòu)自寶生生物工程(大連)有限公司，測(cè)序及引物合成由華大基因(北京)科技有限公司完成，其他生化試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，Multiporator、HypotonicElectroporationBufTer 及 electroporation cuvettes 購(gòu)自 Eppendorf 公司，山羊胎兒成纖維細(xì)胞取自懷孕35~40天薩能奶山羊。
[0048]pL15、pRlI 骨架載體均來(lái)源于 FastTALETM TALEN Assembly kit。
[0049]2、山羊MSTN基因特異性TALENs靶點(diǎn)的選擇
[0050]本實(shí)例的針對(duì)山羊MSTN基因exonl序列，米用TAL effector NucleotideTarger2.0 (https: //tale-nt.cac.Cornell, edu/node/add/talen)設(shè)計(jì)識(shí)別模塊，5’ 端保留T堿基。選取TALMEX-1F和TALMEX-1R為識(shí)別模塊對(duì)山羊MSTN基因exonl序列的AGCT位點(diǎn)進(jìn)行修飾。
[0051]TALMEX-1F CCTCAGTAAACTTCGCCT
[0052]TALMEX-1R TATAGCATCTTTGCTGAT
[0053]識(shí)別模塊TALMEX-1F對(duì)應(yīng)的RVD序列:
[0054]HD-HD-NG-HD-N1-NN-NG-N1-N1-N1-HD-NG-NG-HD-NN-HD-HD-NG 或[0055]HD-HD-NG-HD-N1-NH-NG-N1-N1-N1-HD-NG-NG-HD-NH-HD-HD-NG
[0056]識(shí)別模塊TALMEX-1F對(duì)應(yīng)的RVD序列:
[0057]NG-N1-NG-N1-NN-HD-N1-NG-HD-NG-NG-NG-NN-HD-NG-NN-N1-NG 或
[0058]NG-N1-NG-N1-NH-HD-N1-NG-HD-NG-NG-NG-NH-HD-NG-NH-N1-NG
[0059]其中HD識(shí)別C，NI識(shí)別A，NG識(shí)別T，NN或NH識(shí)別G。
[0060]本實(shí)例編碼TALEN-L識(shí)別區(qū)蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3序列229-2022位核苷酸所示，編碼TALEN-R識(shí)別區(qū)蛋白質(zhì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.4或SEQ IDN0.4序列229-2022位核苷酸所示，分別能夠特異的識(shí)別MSTN基因中的18個(gè)核苷酸(TALEN-1^PJij CCTCAGTAAACTTCGCCT ; TALEN-R 識(shí)別 TATAGCATCTTTGCTGAT)，由 TALEN-L 與TALEN-R共同組成TALENs突變系統(tǒng)，其作用原理如圖1所示。
[0061]3、TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建
[0062]參照FastTALETM TALEN Assembly kit 使用說(shuō)明，根據(jù) TALMEX-1F 和 TALMEX-1R識(shí)別模塊選擇對(duì)應(yīng)的連接模塊，TALMEX-1F選擇9個(gè)識(shí)別單體模塊(CC1-T2-CA3-CT4-AA5-AC6-TT7-CG8-CC9)與pL15骨架載體連接，構(gòu)建pTALEN-L質(zhì)粒；TALMEX_1R選擇9個(gè)識(shí)別單體模塊(TA1-T2-AG3-CA4-TC5-TT6-TG7-CT8-GA9)與 pRll 骨架載體連接，構(gòu)建 pTALEN-R 質(zhì)粒。
[0063]轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行篩選，ClaI酶切鑒定及測(cè)序獲得連接正確的pTALEN-L和pTALEN-R質(zhì)粒，pTALEN-L和pTALEN-R示意圖如圖2所示。
[0064]4、TALENs活性檢測(cè)及單克隆突變細(xì)胞株的獲得
[0065]pTALEN-L和pTALEN-R質(zhì)粒擴(kuò)增、提取與純化參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版的方法進(jìn)行。
[0066]手術(shù)方法取35日齡薩能奶山羊胎兒，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用D-Hank’ s液洗滌三次，用眼科剪剪去胎兒頭、四肢及內(nèi)臟，剩余組織用剪刀剪成lmm3的小塊組織，移入IOml離心管中并加入0.25% Trypsin消化液手握吹打消化15min,靜置2min后，吸取下部較大組織塊至新離心管，重復(fù)消化操作，將上清1500r/min、5min離心,棄去上清,加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液(含10% FBS+1% PS)重懸細(xì)胞，稀釋成3X IO5個(gè)/ml，鋪板培養(yǎng)(37°C、5% CO2、飽和濕度的CO2)。細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化處理，洗滌收集后獲得山羊胎兒成纖維細(xì)胞備用。
[0067]向收集的細(xì)胞中加入1ml Electroporation Buffer懸浮細(xì)胞，1500r/min離心5min,棄上清液,將細(xì)胞重懸于400 μ L的轉(zhuǎn)染液(Hypotonic Electroporation Buffer分別含有20 μ g/ml的pTALEN-L和pTALEN-R質(zhì)粒)中，使細(xì)胞密度為I~3 X IO6個(gè)/ml，將400 μ I 的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 electroporation cuvettes (徑寬 2mm)內(nèi)，放入 Multiporator電轉(zhuǎn)染槽中進(jìn)行電轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染模式(Mode)為:Eukaryotes “Θ”、Voltage (V) 400V、Timeconstant ( τ ) 300us、N0.0f pulse (n) I次)。電脈沖后,使細(xì)胞懸液在cuvette (轉(zhuǎn)染杯)中室溫條件下靜置5min ;將細(xì)胞懸液加入正常細(xì)胞培養(yǎng)液,鋪于6孔板后置于37°C、5% CO2>飽和濕度培養(yǎng)。
[0068]鋪板24h 后更換篩選培養(yǎng)液(DMEM+10 % FBS+1 % PS+3 μ g/ml Puro)，篩選 72h 后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，消化收集3孔細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)，編號(hào)為L(zhǎng)I~L3，其余細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)5~10天，挑取細(xì)胞克隆96個(gè)至48孔板繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度70%時(shí)，收集部分細(xì)胞進(jìn)行突變檢測(cè)，編號(hào)為L(zhǎng)4~L45，同時(shí)收集部分正常細(xì)胞作為對(duì)照組，編號(hào)為Wl~W30
[0069]通過(guò)單細(xì)胞PCR方法進(jìn)行活性檢測(cè)及突變檢測(cè)。收集的細(xì)胞樣品編號(hào)為:L1~L3為篩選72h后收集的細(xì)胞；L4~L45為單克隆細(xì)胞株；W1~W3為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將細(xì)胞樣品置于200 μ I離心管內(nèi)，離心去除培養(yǎng)液，加入10 μ L細(xì)胞裂解液(見(jiàn)表1)，45°C孵育15min，96°C孵育20min后直接作為普通PCR檢測(cè)的DNA模板，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0070]表1細(xì)胞裂解液
[0071]
【權(quán)利要求】
1.一種山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)，其特征在于有效的基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)為剪切山羊MSTN基因靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs ； 所述山羊MSTN基因靶序列如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列，23-40位核苷酸為識(shí)別模塊TALMEX-1F，與57-74位核苷酸的互補(bǔ)序列為識(shí)別模塊TALMEX-1R，41-56位核苷酸為間隔序列； 所述的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R組成； 所述核酸酶TALEN-L，由TALMEX-1F識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-L與經(jīng)過(guò)人工改造的DNA切割蛋白Fok-L融合而成；所述核酸酶TALEN-R，由TALMEX-1R識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-R與經(jīng)過(guò)人工改造的DNA切割蛋白Fok-R融合而成； 所述識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述DNA切割蛋白Fok-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示2023-2814位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述識(shí)別結(jié)構(gòu)域TALE-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示229-2022位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)；所述DNA切割蛋白Fok-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示2023-2808位核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)根據(jù)山羊MSTN基 因選擇SEQID N0.1所示核苷酸序列為靶序列，SEQ ID N0.1所示核苷酸序列23-40位核苷酸為識(shí)別模塊TALMEX-1F、與57-74位核苷酸互補(bǔ)的序列為識(shí)別模塊TALMEX-1R、41-56位核苷酸為間隔序列、47-50位核苷酸為剪切靶點(diǎn)并可作為AluI限制性內(nèi)切酶酶切突變檢測(cè)位點(diǎn)； (2)根據(jù)步驟(1)所得識(shí)別模塊TALMEX-1F和識(shí)別模塊TALMEX-1R合成剪切所述靶序列的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs ;所述轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶TALENs由識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1F的核酸酶TALEN-L和識(shí)別所述識(shí)別模塊TALMEX-1R的核酸酶TALEN-R 組成； 所述核酸酶TALEN-L為SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，所述核酸酶TALEN-R為SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示所示核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。
3.含有權(quán)利要求1所述山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)的重組表達(dá)載體、重組菌或重組細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求1所述山羊MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)在靶細(xì)胞目的基因識(shí)別、修飾中的應(yīng)用。
5.根據(jù)要求I或3所述載體或核苷酸序列合成或轉(zhuǎn)錄能夠表達(dá)權(quán)利要求1所述TALENs的mRNA，其特征在于，所述mRNA序列以TALEN-L或TALEN-R所示的核苷酸序列為轉(zhuǎn)錄模板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述mRNA在山羊細(xì)胞MSTN基因修飾中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述MSTN基因定點(diǎn)修飾系統(tǒng)在其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞MSTN基因修飾中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103952405SQ201410201664
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】成勇, 于寶利 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)