一種豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種豬血有限酶解提取后分離得到的豬血抑菌劑，同時(shí)還提供了該抑菌劑的制備工藝，本發(fā)明的豬血抑菌劑是經(jīng)有限酶解后再通過(guò)超濾及納濾手段得到的分子量為500~3000的小肽混合物，F(xiàn)值為14.5，等電點(diǎn)pI值為4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很強(qiáng)的抑菌活性；提取的豬血抑菌劑是天然資源中得到的產(chǎn)物，具有良好的殺菌抑菌能力，不同于一般化學(xué)成分的殺菌抑菌產(chǎn)品，不會(huì)對(duì)生物體的組織、皮膚產(chǎn)生副作用，有著安全可靠，價(jià)格低廉，制備相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。為制備抑菌殺菌藥物及日常皮膚清潔用品方面提供了新的選擇。
【專利說(shuō)明】一種豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑及其制備方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明提供一種豬血有限酶解提取后分離得到的豬血抑菌劑，同時(shí)還提供了該抑菌劑的制備工藝，屬于生物化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
我國(guó)每年屠宰生豬近6億頭，占世界生豬屠宰量得45%，豬血資源十分豐富，但目前除少量用于制作食用食品外，基本未得到開發(fā)利用，不僅浪費(fèi)資源，而且污染環(huán)境。新鮮豬血中含有豐富的蛋白資源，從豬血中提取的抑菌劑具有良好的生物抑菌活性，能殺滅如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等多種病原菌。同時(shí)，目前采用酶法生產(chǎn)生物蛋白制劑是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，因其安全性極高、價(jià)廉、易于推廣而引起人們的極大興趣。從豬血中所提取的抑菌制劑性質(zhì)穩(wěn)定，是不可多得的穩(wěn)定的生物抑菌制劑，可廣泛的應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域中。
[0003]傳統(tǒng)的從豬血中通過(guò)酶解法獲取抑菌劑方法，首先需要向豬血中添加抗凝劑，如:肝素、檸檬酸鈉，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)自身安全的重視度的增加，外源添加物的使用目前已經(jīng)成為 天然產(chǎn)品加工和生產(chǎn)領(lǐng)域中越來(lái)越需要謹(jǐn)慎對(duì)待的事件。
[0004]另外，從豬血中通過(guò)酶解法獲取抑菌劑，在酶解前需要通過(guò)加酸、加堿或者加熱的辦法誘使血中蛋白質(zhì)變性，變性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散舒展可以被蛋白酶切割成更多的、分子量更小的肽片段。但是，這種變性使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開不具有重復(fù)性，這大大的降低了酶解產(chǎn)物的質(zhì)量穩(wěn)定性，提高了質(zhì)量控制的難度；在酶解法獲取抑菌劑工藝中，主要是采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶等最適溫度范圍較寬、酶切位點(diǎn)較多的蛋白水解酶，目的是獲得分子量盡可能小的肽組分，缺點(diǎn)是上述酶的酶切位點(diǎn)較為廣泛重現(xiàn)性差，酶解制備活性肽的工藝難于穩(wěn)定和具體掌握。同時(shí)，采用控制酶解時(shí)間來(lái)結(jié)束酶解反應(yīng)，往往不另外終止酶解反應(yīng)，酶的自切割產(chǎn)物往往混雜在產(chǎn)品中，從而影響酶解產(chǎn)品的品質(zhì)。而在從酶解液中分離抑菌劑的主要方法是離子交換層析、分子篩層析和膜分離，僅從樣品處理速度和量來(lái)說(shuō)，膜分離 > 離子交換層析 > 分子篩層析。離子交換層析和分子篩層析兩種技術(shù)分別是按照酶解液中各肽類組分的表面電荷性質(zhì)和分子量大小性質(zhì)對(duì)樣品進(jìn)行分類和初步分離，其優(yōu)點(diǎn)在于該類技術(shù)在理論和實(shí)際應(yīng)用中都非常成熟，缺點(diǎn)樣品處理量小，柱子復(fù)生慢，難于進(jìn)行擴(kuò)大化生產(chǎn)和應(yīng)用；膜分離技術(shù)是按照樣品的分子大小進(jìn)行分離，其優(yōu)點(diǎn)在于快速、樣品處理量大、幾乎不需要膜的復(fù)生與額外處理，易于進(jìn)行擴(kuò)大化生產(chǎn)和應(yīng)用。
[0005]對(duì)于酶解法獲取抑菌劑工藝，從酶解液中清除卟啉(血紅素)及卟啉水解物的過(guò)程，主要是活性碳或者大孔樹脂吸附，氯仿等有機(jī)溶劑萃??；活性碳、大孔樹脂的使用在吸附卟啉及其水解物同時(shí)也吸附水解液中的活性肽成分，造成不必要的損失，氯仿等有機(jī)溶劑的使用，提高工藝的難度、成本與質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，也同樣會(huì)降低活性組分的含量。
[0006]所述的從酶解液中分離抑菌劑的方法主要是采用低溫冷凍干燥法或者高溫噴霧干燥法獲得抑菌劑的干粉，使得肽類組分在干燥狀態(tài)下保證其生物活性，或者現(xiàn)用現(xiàn)制備，以保證抑菌劑的生物活性。
[0007]
【發(fā)明內(nèi)容】
:本發(fā)明的目的在于提供一種豬血抑菌劑，具有抑菌活性。
[0008]本發(fā)明的目的還在于提供一種豬血抑菌劑的制備方法，具有高穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、操作簡(jiǎn)便性、可以快速分離活性組分，清除產(chǎn)品中的卟啉及其水解物，便于規(guī)模放大的，適用于工業(yè)化生產(chǎn)的制備方法。
[0009]本發(fā)明公開的豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑，其特征在于:
是經(jīng)有限酶解后再通過(guò)超濾及納濾手段得到的分子量為500-3000的小肽混合物，F(xiàn)值為14.5，等電點(diǎn)pi值為4.4^9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很強(qiáng)的抑菌活性；
上述小肽混合物經(jīng) nanoAcquity-UPLC BEH130 C18 色譜柱分離，AB Sciex 5800 MALDIT0F/T0F質(zhì)譜分析，該混合物中氨基酸序列如:SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3組分含量占豬血抑菌劑總蛋白含量的86%以上，其中SEQ N0.1:SEQ N0.2 =SEQ N0.3的比例為1:1:1。
[0010]以大腸桿菌coliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(5?<3/成r/ocomAsaureus ATCC 25923)、銅綠色假單胞菌iPseudomorms aeruginosa ATCC 27853)、白色念珠菌(.Monilia albican ATCC 10231)為活性檢測(cè)菌，檢測(cè) SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3 三個(gè)序列組分的抑菌活性占豬血抑菌劑總抑菌活性的92%以上。
[0011]本發(fā)明所述的豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑的制備方法，包括以下步驟:
1)將新鮮豬血與3~4倍體積量水充分混合，100~150轉(zhuǎn)每分鐘條件下攪拌30~60分鐘，靜置30到60分鐘，上清液利用膜分離技術(shù)經(jīng)過(guò)中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量30KDa以下的部分；
2)分子量30KDa以下的濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0~8.5，按照質(zhì)量體積比為1:1000~10000的比例加入胰蛋白酶，在37°C條件下酶解8~12小時(shí)；
3)用醋酸將酶解液調(diào)節(jié)pH至3.5~4.0，使酶失活終止酶解反應(yīng)，加熱煮沸5分鐘，靜置至室溫，過(guò)濾，留上清液；
4)上清液利用膜分離技術(shù)經(jīng)中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量3KDa以下部分，再利用膜分離技術(shù)通過(guò)納濾裝置截留分子量0.5KDa以上部分，既得；
5)豬血抑菌劑的F值為14.5，氨基酸組成見(jiàn)(表1 )，其中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，等電點(diǎn)pi分布范圍為4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。
[0012]本發(fā)明制備方法的特點(diǎn)在于:血液中不添加抗凝劑，直接利用大體積的水使紅細(xì)胞進(jìn)行溶血，然后利用膜分離技術(shù)經(jīng)中空纖維素濾膜濾器直接分離分子量小于30KDa的組分，移除未溶血的細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；未采用加酸、加堿或者加熱的辦法誘發(fā)血液中的蛋白質(zhì)變性；本發(fā)明中蛋白酶是在血中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)下進(jìn)行切割的，蛋白質(zhì)在近穩(wěn)定結(jié)構(gòu)時(shí)結(jié)構(gòu)重現(xiàn)度高，蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高了酶解產(chǎn)物的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，酶解產(chǎn)物在各個(gè)批次間差異達(dá)到最小，不同批次產(chǎn)品中三種主要抑菌成分SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3的含量在89±3%之間。
[0013] 本發(fā)明中采用pH在8.0到8.5間的條件進(jìn)行血中蛋白質(zhì)的酶解操作，此時(shí)血中蛋白質(zhì)處于近穩(wěn)定結(jié)構(gòu)狀態(tài)下，一般蛋白質(zhì)在PH4~9范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)處于可逆變化狀態(tài)，其結(jié)構(gòu)具有高度的規(guī)則性和可重現(xiàn)性即稱為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；本發(fā)明中采用胰蛋白酶，與現(xiàn)有技術(shù)采用的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶相比，胰蛋白酶具有較為專一的酶解位點(diǎn)，酶解位點(diǎn)的專一性提高了酶解產(chǎn)物的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
[0014]本發(fā)明采用醋酸酸化和加熱雙重技術(shù)確保胰蛋白酶酶解反應(yīng)的終止，抑制酶自切割產(chǎn)物的產(chǎn)生與混入產(chǎn)品中，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)中豬血中的抑菌活性組分集中在分子量3KDa以上，大分子量抗菌組分在保存和使用時(shí)活性易于因?yàn)榉肿颖旧淼恼郫B、聚集和分解而損失，所以【背景技術(shù)】中抗菌活性組分需要凍干或者現(xiàn)用現(xiàn)制備；本發(fā)明小分子量抑菌活性組分不存在自身的折疊、聚集和分解問(wèn)題，液體狀態(tài)產(chǎn)品在室溫下保存半年以上未見(jiàn)活性有損失。
[0016]表格I豬血抑菌劑的氨基酸組成
【權(quán)利要求】
1.一種豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑，其特征在于； 分子量為500-3000的小肽混合物，F(xiàn)值為14.5，等電點(diǎn)pi值為4.4^9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%,堿性氨基酸占10.3%, 卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一,具有很強(qiáng)的抑菌活性； 抗菌主要成分的氨基酸序列如=SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3所示，比例為1:1:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑的制備方法，包括以下步驟: 1)將新鮮豬血與3~4倍體積量水充分混合，100~150轉(zhuǎn)每分鐘條件下攪拌30~60分鐘，靜置30到60分鐘，上清液利用膜分離技術(shù)經(jīng)過(guò)中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量30KDa以下的部分； 2)步驟I)中所得組分用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0~8.5，按照質(zhì)量體積比為1:1000~10000的比例加入胰蛋白酶，在37°C條件下酶解8~12小時(shí)； 3)用醋酸將酶解液調(diào)節(jié)pH至3.5~4.0，使酶失活終止酶解反應(yīng)，加熱煮沸5分鐘，靜置至室溫，過(guò)濾，留上清液； 4)上清液經(jīng)中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量3KDa以下部分，再通過(guò)納濾裝置截留分子量0.5KD a以上部分，既得； 5)豬血抑菌劑的F值為14.5，氨基酸組成見(jiàn)(表1 )，其中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，pi分布范圍為4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103989707SQ201410202784
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月14日
【發(fā)明者】周杰, 張雪蘭, 吳浪, 劉琪, 馬沐青, 呂明, 滕利榮, 孟慶繁 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)