一株沙氏芽孢桿菌及其在降解黃曲霉毒素中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株沙氏芽孢桿菌及其在降解黃曲霉毒素中的應用。本發(fā)明公開的一株沙氏芽孢桿菌(Bacillus?shackletonii)，其保藏編號為CGMCC?No.8868。作為黃曲霉毒素降解的生物材料，無論開發(fā)新的生物降解菌劑或者生物降解無菌制劑，該菌都具有很好的應用前景。
【專利說明】一株沙氏芽孢桿菌及其在降解黃曲霉毒素中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一株沙氏芽孢桿菌及其在降解黃曲霉毒素中的應用。
【背景技術】
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)是一類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，具有致癌、致畸、致細胞突變的作用，僅0.294mg/kg劑量就能引起敏感動物的急性中毒死亡(Bondy and Pestka, 2000 ；ffanget al., 2002 ；Rawal, et al., 2010),其主要的作用祀標是肝臟,是誘發(fā)惡性腫瘤原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的主要因素之一,此外還可以引起腎臟和腎上腺的急性病變(Poirier et al., 2000 ；Kensler et al.,2011)。
[0003]黃曲霉毒素的基本結構是二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮(香豆素)，前者為基本毒性結構，后者有加強毒性及致癌作用。目前已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素約有20種，在紫外光下發(fā)藍色光(Blue)的為B 族(黃曲霉毒素B1和B2),發(fā)綠光(Green)的為G族(黃曲霉毒素G1和G2)。黃曲霉毒素M1是AFB1的羥基化衍生物。其中AFB1分布最廣、含量最高、毒性最強，其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。
[0004]傳統(tǒng)的黃曲霉毒素去毒方法有物理和化學方法，包括氨化法、堿法、高溫法、射線輻照法及超濾-滲濾法等，這些方法存在效果不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失大、降解產(chǎn)物復雜、降解產(chǎn)物毒性難以確定，以及難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點；此外，還有吸附法，吸附法在吸附毒素的同時也會吸附營養(yǎng)成分。生物法，是利用微生物及其分泌的酶等代謝產(chǎn)物降解黃曲霉毒素的方法。生物法具有效率高、特異性強以及對食品、飼料和環(huán)境沒有污染的特點，是黃曲霉毒素降解的方向。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株沙氏芽孢桿菌。
[0006]本發(fā)明提供的一株沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii)L7,其保藏編號為CGMCC N0.8868。
[0007]上述的沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii) L7和/或其培養(yǎng)液和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產(chǎn)物在降解黃曲霉毒素中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0008]上述的沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii) L7和/或其培養(yǎng)液和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產(chǎn)物在制備降解黃曲霉毒素的產(chǎn)品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。
[0009]上述應用中，所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2或黃曲霉毒素Μ:。
[0010]本發(fā)明的另一個目的是提供一種降解黃曲霉毒素的方法。
[0011]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:用上述的沙氏芽孢桿菌(Bacillusshackletonii)L7對黃曲霉毒素進行降解處理。
[0012]上述方法中，所述降解處理的方式為將上述的沙氏芽孢桿菌(Bacillusshackletonii)L7的培養(yǎng)液和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產(chǎn)物與含有黃曲霉毒素的樣品和/或產(chǎn)品混合。
[0013]上述方法中，所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2或黃曲霉毒素Μ:。
[0014]所述黃曲霉毒素可以為B族黃曲霉毒素、B族黃曲霉毒素的衍生物和/或G族黃曲霉毒素，其中，所述B族黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1或黃曲霉毒素B2 ;所述G族黃曲霉毒素為黃曲霉毒素G1或黃曲霉毒素G2。所述B族黃曲霉毒素的衍生物為黃曲霉毒素M1。
[0015]所述含有黃曲霉毒素的樣品和/或產(chǎn)品具體為含有黃曲霉毒素的農產(chǎn)品加工原料、飼料、食品及環(huán)境樣品和/或產(chǎn)品。
[0016]在本發(fā)明的實施例中，所述降解處理為沙氏芽孢桿菌L7的培養(yǎng)液與黃曲霉毒素溶液混合；黃曲霉毒素溶液由黃曲霉毒素和色譜純甲醇組成，且黃曲霉毒素在黃曲霉毒素溶液中的終濃度為IOOppb。
[0017]沙氏芽孢桿菌L7的培養(yǎng)液為將沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii)L7CGMCCN0.8868接種于液體NB培養(yǎng)基中，在溫度為37°C和轉速為200rpm(旋轉半徑20mm)的條件下振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)容器內的所有物質記作L7培養(yǎng)液。
[0018]所述混合為 混勻后37°C靜置72h。
[0019]菌株L7已于2014年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.8868，分類命名為沙氏芽孢桿菌Bacillus shackletonii。
[0020]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一株沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii)L7，經(jīng)過研究本發(fā)明提供的沙氏芽孢桿菌L7可高效降解黃曲霉毒素，該菌作為黃曲霉毒素降解的生物材料，無論在開發(fā)新的生物降解菌劑還是生物降解無菌制劑方面都具有很好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為黃曲霉毒素B1降解效果液相色譜圖
[0022]圖2為黃曲霉毒素B2降解效果液相色譜圖
[0023]圖3為黃曲霉毒素G1降解效果液相色譜圖
[0024]圖4為黃曲霉毒素G2降解效果液相色譜圖
[0025]圖5為黃曲霉毒素M1降解效果液相色譜圖
【具體實施方式】
[0026]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0027]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028]NB液體培養(yǎng)基:由溶劑和溶質組成；溶質為蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶劑為水；蛋白胨在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為1%，牛肉膏在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.3%,NaCl在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5%，所述％均為質量體積百分比(g/100ml)。[0029]NA固體培養(yǎng)基:在NB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂(瓊脂與液體培養(yǎng)基的比例為1.5g:100ml)，得到NA固體培養(yǎng)基。
[0030]實施例1、菌的分離與鑒定
[0031]一、菌的分離
[0032]( 一)2013年6月，在超凈工作臺中，將采集自北京郊區(qū)的土壤樣品放在無菌蒸餾水中震蕩15分鐘制備菌懸液，搖床轉速為180rpm。
[0033]( 二)將菌懸液用無菌蒸餾水進行濃度梯度稀釋后涂布在NA培養(yǎng)基平板上，300C條件下培養(yǎng)24小時，菌落布滿整個平板，用接種環(huán)挑取平板上形態(tài)、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，點接純化后的菌株應用于黃曲霉毒素降解實驗。得到的一株黃曲霉毒素降解能力強的菌株命名為L7。
[0034]二、鑒定
[0035](一 )按照“伯杰細菌鑒定手冊”(第八版)和“常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京:科學出版社，2001.2)中描述的方法，對菌株L7進行形態(tài)特征和生理生化特性鑒定，具體結果如下:
[0036]菌體的形態(tài):
[0037]在NA培養(yǎng)基，2 8°C培養(yǎng)I天，菌體桿狀，直徑約為1.0-2.0 μ mX 2.5-6.5 μ m ;菌落奶白色，圓形，微凸，邊緣不整齊。
[0038]生理生化特性:氧化酶:_ ;精氨酸雙水解酶:_ ;明膠水解:_ ;淀粉水解:_ ;過氧化氫酶:+ ;三丁酸甘油脂水解:_ ;硝酸鹽還原:_ ;七葉靈水解:+ ;酪素水解:+ ；Tween80水解:_ ;吲哚實驗:_ ;服酶:_ ;梓橡酸利用:+ ;H2S生成:-；VP實驗:-；5% NaCl:+ ;厭氧生長:_ ；50°C:+ ；55°C:+ ；pH9.0:+。
[0039](二)16S rDNA 試驗
[0040]提取L7的總DNA，以其為模板，利用細菌16S rDNA通用引物(27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ；1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT)進行 PCR 擴增，得到長度約為
1.4kb的擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物回收并進行測序，測得的序列如序列I所示。
[0041]根據(jù)Gen-Bank 序列同源性比較，菌株 L7 與 Bacillus shackletonii bE58 (2011)(GenBank登錄號JF772506.1)同源性為100 %，初步判定該菌為沙氏芽孢桿菌屬細菌(Bacillus shackletonii)。
[0042]基于以上特征，將菌株L7鑒定為沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii)。該菌株已于2014年2月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC N0.8868，分類命名為沙氏芽孢桿菌Bacillus shackletonii。
[0043]實施例2、沙氏芽孢桿菌L7在降解黃曲霉毒素中的應用
[0044]一、沙氏芽孢桿菌L7的培養(yǎng)
[0045]將沙氏芽孢桿菌(Bacillusshackletonii) L7CGMCC N0.8868 接種于液體NB 培養(yǎng)基中，在溫度為37°C和轉速為200rpm(旋轉半徑20mm)的條件下振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)容器內的所有物質記作L7培養(yǎng)液，用于后續(xù)的黃曲霉毒素降解實驗。
[0046]二、沙氏芽孢桿菌L7對黃曲霉毒素B1降解作用
[0047]1、黃曲霉毒素B1的配制:[0048]將Img黃曲霉毒素B1標準品(Sigma-aldrich?，貨號A6636)溶解于2ml色譜純
甲醇中獲得濃度為500ppb的黃曲霉毒素B1溶液。
[0049]2、降解實驗
[0050]處理組:取0.4ml上述一得到的L7培養(yǎng)液置于1.5ml離心管中，加入0.1ml濃度為500ppb的黃曲霉毒素B1至其終濃度為lOOppb，充分混勻37°C靜置72h后，1000Og離心IOmin去除細胞。
[0051]對照組:以0.4ml不接菌的NB培養(yǎng)基加入0.1ml濃度為500ppb的黃曲霉毒素B1至其終濃度為IOOppb作為對照組。
[0052]3、黃曲霉毒素B1的檢測
[0053]首先使用甲醇:水出:4)溶液對其進行萃取，然后使用免疫親和柱對樣品殘留毒素進行凈化提取(方法參照免疫親和柱使用說明書)；最后用HPLC(柱后光化學衍生)對凈化提取得到的樣品進行檢測。
[0054]HPLC檢測條件為流動相甲醇冰=I:1 ;流速lml/min ;色譜柱C18150mmX4.6mm,0.5 μ m ;激發(fā)波長350nm，檢測波長450nm ;柱溫30°C ;進樣量20 μ I。
[0055]AFB1降解率(％ )=(對照組殘留AFB1含量-處理組殘留AFB1含量)/對照組殘留AFB1含量X 100。
[0056]結果如圖1和表1所示，圖1中，A:黃曲霉毒素標準品(黃曲霉毒素B1的保留時間為11.412min) ;B:對照組(黃曲霉毒素B1的保留時間為11.962min) ;C:L7組(黃曲霉毒素B1的保留時間為11.892min)；
[0057]對照組殘留AFB1含量為97.25± 1.56 ；
[0058]處理組殘留AFB1含量27.45 ± 2.88 ;
[0059]結果表明，L7對黃曲霉毒素B1有較好的降解效果，降解率為71.77%。
[0060]表1沙氏芽孢桿菌L7對黃曲霉毒素的降解效果
[0061]
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【權利要求】
1.一株沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii)L7，其保藏編號為 CGMCC N0.8868。
2.權利要求1所述的沙氏芽孢桿菌(Bacillusshackletonii)L7和/或其培養(yǎng)液和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產(chǎn)物在降解黃曲霉毒素中的應用。
3.權利要求1所述的沙氏芽孢桿菌(Bacillusshackletonii)L7和/或其培養(yǎng)液和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產(chǎn)物在制備降解黃曲霉毒素的產(chǎn)品中的應用。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的應用，其特征在于:所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2或黃曲霉毒素Mp
5.一種降解黃曲霉毒素的方法，包括如下步驟:用權利要求1所述的沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii)L7對黃曲霉毒素進行降解處理。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于:所述降解處理的方式為將權利要求1所述的沙氏芽孢桿菌(Bacillus shackletonii) L7的培養(yǎng)液和/或其菌懸液和/或其發(fā)酵液和/或其代謝產(chǎn)物與含有黃曲霉毒素的樣品和/或產(chǎn)品混合。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于: 所述黃曲霉毒素為黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2或黃曲霉毒素Μ:。
【文檔編號】C12R1/07GK103981135SQ201410204210
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權日:2014年5月14日
【發(fā)明者】趙月菊, 劉陽, 蘭茨納·桑格, 婭娃·米妮·埃爾迪·富麗, 邢福國, 周露, 王龑 申請人:中國農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所