還原亞硒酸鹽產(chǎn)納米硒的芽胞桿菌es2-45及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株還原亞硒酸鹽產(chǎn)納米硒的芽胞桿菌ES2-45及應(yīng)用，其保藏編號為CCTCCNO：M2014094。該菌株具有快速將有毒的亞硒酸鹽還原成低毒的納米硒的能力，在含有1mmol/LNa2SeO3的1/10TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，4h開始產(chǎn)紅色納米硒，48h可以將1mmol/LNa2SeO3還原完，產(chǎn)納米硒的量高達(dá)239,290±20.11mg/kg。因此將該菌在含亞硒酸鹽的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)的納米硒和菌體添加到動物飼料中安全低毒，容易吸收，提高動物肉質(zhì)品質(zhì)。因芽胞桿菌的易發(fā)酵、易保存特性和該菌株高效還原亞硒酸鹽的特性，該菌株在硒污染土壤的微生物治理方面也有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】還原亞砸酸鹽產(chǎn)納米砸的芽胞桿菌ES2-45及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株能將亞硒酸鹽還原為紅色納米硒的芽胞桿菌ES2-45，以及該菌在飼料中添加納米硒和硒污染環(huán)境生物修復(fù)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]硒(Selenium),元素符號Se,位于元素周期表VI主族,是生命體所必須的非金屬微量元素。自然界中，硒主要以4種價態(tài)存在:還原態(tài)的硒化物(_2)、單質(zhì)態(tài)的硒(O)和氧化態(tài)的亞硒酸鹽(+4)及硒酸鹽(+6)，其中又以亞硒酸鹽(+4)毒性最強(qiáng)，以單質(zhì)硒(O)的毒性最弱。[0003]硒是第21位氨基酸(硒代半胱氨酸See, U)的成分，也是體內(nèi)重要的過氧化物酶谷胱甘肽過氧化酶的組成部分，因而對人體健康至關(guān)重要。它在抗氧化防御體系、免疫細(xì)胞功能、甲狀腺激素功能等方面具有不可替代的作用。但是硒在體內(nèi)的安全閾值很窄，食物中含硒量低于0.05mg/kg,就會缺硒；高于5mg/kg,就可能出現(xiàn)硒中毒；0.I~lmg/kg屬于正常范圍。在急性毒性(LD5tl)標(biāo)準(zhǔn)方面,無機(jī)硒為15mg/kg,有機(jī)硒為30~40mg/kg,納米硒則高達(dá)113mg/kg。在亞慢毒性方面,飼料中無機(jī)硒或有機(jī)硒的含量在4~5mg/kg時，即可導(dǎo)致大鼠體重下降和肝硬化，而納米硒含量在6mg/kg時，也不出現(xiàn)上述現(xiàn)象。在生物功效方面，納米硒體外清除羥基自由基的效率為無機(jī)硒的5倍，為有機(jī)硒的25倍。另外，納米硒能夠提高機(jī)體抗氧化能力、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、改善畜禽肉品質(zhì)，具有比亞硒酸鹽低的毒性及高的生物利用率等特點。細(xì)菌可還原亞硒酸鹽形成含單質(zhì)硒的納米球，用于生物補(bǔ)硒則高效低毒。目前飼料中一般加入亞硒酸鹽，但毒性較大。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)紅色單質(zhì)硒粒徑在5~200nm時,在生物補(bǔ)硒方面有很高的應(yīng)用價值,而且單質(zhì)硒納米球活性與亞硒酸鹽有相似的上調(diào)含硒酶的能力，但毒性只有其1/7，替代亞硒酸鹽前景廣闊。杭紅仙等(2003)的研究中指出，日糧中添加適當(dāng)水平的酵母硒(0.35mg/kg)可顯著改善種公豬的精液品質(zhì)和精清生殖激素水平，對提高種公豬的繁殖性能有積極的作用。
[0004]我國同時存在生物補(bǔ)硒和高硒土壤微生物修復(fù)兩個問題。人體的硒主要來自動植物食品。我國72%的土壤缺硒((0.6mg/kg)，屬嚴(yán)重缺硒的國家，然而嚴(yán)重缺硒會導(dǎo)致克山病等40多種疾病，因此，在動物飼料中加入一定量的亞硒酸鹽以提高肉食中硒的含量是目前普遍的做法。但硒是一把雙刃劍，當(dāng)攝入量大于400 μ g/天就可能出現(xiàn)硒中毒，如我國湖北恩施和陜西安康屬于高硒區(qū)，當(dāng)?shù)厝顺霈F(xiàn)脫毛、貧血等疾病。許多細(xì)菌可以將亞硒酸鹽或硒酸鹽等毒性較高的氧化態(tài)硒還原為毒性較低的單質(zhì)納米硒，成為植物不易吸收的狀態(tài)，從而降低植物中的含硒量，是高硒土壤進(jìn)行微生物修復(fù)的環(huán)境友好、成本較低的方法。
[0005]芽胞桿菌作為最理想的微生物添加劑，至今已有100多年的歷史，芽胞桿菌已經(jīng)發(fā)明的專利數(shù)多達(dá)200多項，它具有營養(yǎng)條件要求不高、抗逆性強(qiáng)、容易發(fā)酵和易保存等優(yōu)點，在飼料和環(huán)境修復(fù)中有大量的應(yīng)用。在飼料添加劑方面，專利CN101390571B公開了一種凝結(jié)芽胞桿菌飼料添加劑及其制備方法，CN101638627A公開了一株枯草芽胞桿菌及其在生物飼料添加劑中的應(yīng)用，CN101228920B公開了一株側(cè)胞芽胞桿菌WY9701制備的微生態(tài)制劑在飼料添加劑中的應(yīng)用，CN102232479B公開了一株芽胞桿菌飼料添加劑的制備工藝。在環(huán)境修復(fù)方面，專利CN101429486A公開了一株具有錳氧化能力的芽胞桿菌MK3-1及其在凈化錳污染方面的應(yīng)用，CN102031230B公開了一種解淀粉芽胞桿菌以及采用該菌種制備污染水體修復(fù)劑的方法，CN1632105A公開了一枯草芽胞桿菌制劑用于水質(zhì)改良，CN1629104A公開了一種土壤環(huán)境生物修復(fù)肥料(側(cè)耳、枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和淡青鏈霉菌)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一株能還原亞硒酸鹽產(chǎn)紅色納米硒的芽胞桿菌。該菌株由 申請人:從湖北恩施高硒土壤中分離而來。該菌株已于2014年03月18日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，分類命名:芽胞桿菌ES2-45Bacillus sp.ES2-45，保藏號為CCTCC NO:M2014094，地址:中國武漢武漢大學(xué)。該菌株在加有ImM亞硒酸鹽的1/10TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h開始產(chǎn)紅色物質(zhì)即產(chǎn)生納米硒顆粒，48h能將ImM亞硒酸鹽完全還原，且對人、畜和環(huán)境安全。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供了芽胞桿菌ES2-45在制備富硒飼料添加劑中的應(yīng)用，高毒的亞硒酸鹽被芽胞桿菌ES2-45還原成低毒的納米硒顆粒用于飼料添加劑。
[0008]本發(fā)明最后一個目的在于提供了芽胞桿菌ES2-45在高硒土壤微生物修復(fù)中的應(yīng)用。該菌株的粉劑施入土壤，可降低土壤可溶性亞硒酸鹽的含量。
[0009]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0010]一株能還原亞硒酸鹽產(chǎn)紅色納米硒的芽胞桿菌，其篩選過程如下:
[0011]A.利用菌株可還原無色的亞硒酸鹽成紅色的納米硒，從而使菌落呈紅色的特點，從“中國硒都”-湖北恩施自治州某特征硒礦土取樣，稱取IOg礦土溶于90mL無菌水，逐步稀釋成ΙΟ—1，10_2直至10_5懸液，取合適稀釋度涂布于普通固體細(xì)菌培養(yǎng)基1/10TSB上，培養(yǎng)基中添加Na2SeO3至終濃度為lmmol/L，28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d。
[0012]B.挑選變紅的菌落劃線于亞硒酸鹽終濃度為lmmol/L的1/10TSB平板上，確定變紅后記錄形態(tài)并保藏。
[0013]C.用加有l(wèi)mmol/L Na2SeO3的1/10TSB液體培養(yǎng)基對篩選出的亞硒酸鹽還原菌進(jìn)行還原能力的測定，即在各菌株培養(yǎng)24h后用原子熒光形態(tài)分析儀檢測培養(yǎng)基中剩余Na2SeO3的濃度經(jīng)過比較得到該還原能力強(qiáng)的菌株。
[0014]D.對獲得的菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序并構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合其生理生化特征，將該菌株命名為芽胞桿菌ES2-45，該菌株已于2014年03月18日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，分類命名:芽胞桿菌ES2-45Bacillus sp.ES2-45，保藏號為CCTCC NO:M2014094，地址:中國武漢武漢大學(xué)。
[0015]所述芽胞桿菌ES2-45(CCTCC N0:M2014094)是革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下呈桿狀，
2.2-3.7 μ m長，0.6-1.0 μ m寬，產(chǎn)橢圓形芽胞。在1/10TSB瓊脂平板培養(yǎng)基上生長良好，24h形成乳白色、圓形、表面不光滑、隆起、邊緣不整齊呈齒輪狀，直徑0.1~0.7mm大小的菌落，可在厭氧條件下生長。
[0016]一種亞硒酸鹽還原菌株ES2-45的發(fā)酵方法，其步驟為:
[0017] A.制備1/10TSB的平板，劃線活化芽胞桿菌ES2-45的純培養(yǎng)物，在28°C下培養(yǎng)24h。
[0018]B.種子液制備，將活化好的單菌落接種于1/10TSB液體培養(yǎng)基中作為種子培養(yǎng)液，在28°C下培養(yǎng)24h。
[0019]C.發(fā)酵，將活化好的種子液按1-5%的接種量接種于含有1/10TSB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，28 0C，160rpm培養(yǎng)48h。
[0020]所述的1/10TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨1.5g/L、大豆蛋白胨0.5g/L、氯化鈉 0.5g/L，調(diào) pH 值 7.3±0.2，115°C，滅菌 30min。
[0021]1/10TSB的平板培養(yǎng)基的配方為:1/10TSB液體培養(yǎng)基中加入1.5-2.0%的瓊脂
[0022]芽胞桿菌ES2-45在制備富硒飼料添加劑中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下:
[0023]A. 制備1/10TSB的平板，劃線活化芽胞桿菌ES2-45的純培養(yǎng)物，在28°C下培養(yǎng)24h。
[0024]B.種子液制備，將活化好的單菌落接種于1/10TSB中作為種子培養(yǎng)液，在28°C下培養(yǎng)24h。
[0025]C.發(fā)酵，將活化好的種子液按1-5%的接種量接種于含有l(wèi)mmol/L Na2SeO3的I/10TSB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，28°C培養(yǎng)48h。
[0026]D.離心收集沉淀，即納米硒與菌的混合物，噴霧干燥，制成粉劑，然后在畜禽喂養(yǎng)的日糧中添加適當(dāng)水平(0.3-0.5mg/kg)的此粉劑，混勻后喂養(yǎng)。
[0027]芽胞桿菌ES2-45在高硒土壤微生物修復(fù)中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程如下:
[0028]A.制備1/10TSB的平板，劃線活化芽胞桿菌ES2-45的純培養(yǎng)物，在28°C下培養(yǎng)24h。
[0029]B.活化好的單菌落接種于1/10TSB中作為種子培養(yǎng)液，在28°C，160rpm培養(yǎng)24h。
[0030]C.活化好的種子液按5-10%的接種量接種于1/10TSB液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，28°C 培養(yǎng) 48h。
[0031]D.發(fā)酵液6000rpm離心20min,收集菌體,用發(fā)酵液相同體積的生理鹽水懸浮菌體，采用穴灌的方法在種植植被(如煙草)時加入此菌懸液(每個洞穴加50mL)或采用噴淋的方法，按29.6-59.2mL/min的速度將菌懸液均勻的噴淋到土壤上，具體噴淋時長根據(jù)實時測量數(shù)據(jù)而定。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0033] 申請人:從湖北恩施高硒區(qū)篩選出一株能高效還原亞硒酸鹽為紅色納米單質(zhì)硒的芽胞桿菌，其重金屬抗性、逆環(huán)境生存能力和轉(zhuǎn)硒效率都很高，一方面可以將該菌制成菌粉劑投入土壤進(jìn)行硒污染微生物治理，環(huán)境友好，成本低，另一方面，通過該菌發(fā)酵所產(chǎn)的納米硒添加到飼料中進(jìn)行補(bǔ)硒，對動物安全友好，并通過肉食安全進(jìn)入人體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1為芽胞桿菌ES2-45的生長與亞硒酸鹽還原示意圖。
[0035]?為芽胞桿菌ES2-45的生長曲線；為芽胞桿菌ES2-45的亞硒酸鹽還原曲線。
[0036]圖2為芽胞桿菌ES2-45的光學(xué)顯微鏡下觀察的形態(tài)示意圖。
[0037]左:不加硒培養(yǎng)24h ;右:加ImM硒培養(yǎng)24h,箭頭表示紅色納米硒在胞外的富集。
[0038]圖3為芽胞桿菌ES2-45的掃描電鏡下觀察的形態(tài)示意圖。[0039]左:不加硒培養(yǎng)24h ;右:加ImM硒培養(yǎng)24h，箭頭表示所產(chǎn)納米硒。
[0040]圖4為芽胞桿菌ES2-45的透射電鏡觀察及X-射線能譜分析示意圖。
[0041]左上:不加硒培養(yǎng)；右上:加ImM硒培養(yǎng)，箭頭表示所產(chǎn)納米硒
[0042]左下:加ImM硒培養(yǎng)24h ;右下:左下圖所產(chǎn)納米硒顆粒的X_射線能譜分析
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0044]實施例1:
[0045]一種亞硒酸鹽還原菌株ES2-45的獲得，其篩選過程如下:
[0046]A.利用 菌株可還原無色的亞硒酸鹽成紅色的納米硒，從而使菌落呈紅色的特點，從“中國硒都”-湖北恩施自治州某特征硒礦土取樣，稱取IOg礦土溶于90mL無菌水，逐步稀釋成Κ1，10_2直至10_5懸液，取合適稀釋度涂布于普通固體細(xì)菌培養(yǎng)基1/10TSB上，培養(yǎng)基中添加Na2SeO3至終濃度為lmmol/L，28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d。
[0047]B.挑選變紅的菌落劃線于亞硒酸鹽終濃度為lmmol/L的1/10TSB平板上，確定變紅后記錄形態(tài)并保藏。
[0048]C.用加有l(wèi)mmol/L Na2SeO3的1/10TSB液體培養(yǎng)基對篩選出的亞硒酸鹽還原菌進(jìn)行還原能力的測定，即在各菌株培養(yǎng)24h后用原子熒光形態(tài)分析儀檢測培養(yǎng)基中剩余Na2SeO3的濃度經(jīng)過比較得到該還原能力強(qiáng)的菌株。
[0049]D.對獲得的菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序并構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)合其生理生化特征，將該菌株命名為芽胞桿菌ES2-45，該菌株已于2014年03月18日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，分類命名:芽胞桿菌ES2-45Bacillus sp.ES2-45，保藏號為CCTCC NO:M2014094，地址:中國武漢武漢大學(xué)。
[0050]該菌株的具體特征如下:
[0051]A.形態(tài)學(xué)特征
[0052]芽胞桿菌ES2-45的細(xì)胞形態(tài)為桿狀，2.2-3.7 μ m長，0.6-1.0ym寬，產(chǎn)橢圓形芽胞。
[0053]B.培養(yǎng)特征
[0054]芽胞桿菌ES2-45在1/10TSB瓊脂平板培養(yǎng)基上28°C培養(yǎng)24h，形成圓狀的乳白色，小菌落，表面不光滑，邊緣不整齊，隆起。能夠在貧瘠營養(yǎng)的培養(yǎng)基(CDM，Weeger etall999)中生長良好。
[0055]C.菌株的分類學(xué)鑒定
[0056]對菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序，分析其序列相似度，鑒定其為芽胞桿菌。
[0057]D.生理生化特性
[0058]按Bacillus sp.的傳統(tǒng)方法進(jìn)行生理生化試驗，其生理生化特征如表1所示。
[0059]表1芽胞桿菌ES2-45菌株的生理生化特征
【權(quán)利要求】
1.一種分離的芽胞桿菌，其特征在于:芽胞桿菌sp.)ES2-45，CCTCC NO:M2014094。
2.權(quán)利要求1所述的芽胞桿菌的制備方法，包括將活化好的芽胞桿菌ES2-45種子液按1-5%的接種量接種于1/10 TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，280C，160 rpm培養(yǎng)48 h ； 所述的1/10 TSB液體培養(yǎng)基的配方為:胰蛋白胨1.5 g/L、大豆蛋白胨0.5 g/L、氯化鈉 0.5 g/L，調(diào) pH 值 7.3 ± 0.2，115°C，滅菌 30 min ； 所述的平板的培養(yǎng)基的配方為:1/10 TSB液體培養(yǎng)基中加入1.5-2.0%的瓊脂。
3.利用權(quán)利要求1所述芽胞桿菌制備富硒芽胞桿菌的方法，包括將芽胞桿菌ES2-45種子液按1%的接種量接種于加有I mmol/L Na2SeO3的1/10 TSB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48 h。
4.權(quán)利要求1所述的芽胞桿菌在制備富硒飼料添加劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的芽胞桿菌在高硒土壤微生物修復(fù)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK103952363SQ201410206573
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】鄭世學(xué), 王革嬌, 姚蓉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)