一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測(cè)家畜內(nèi)毒素中毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測(cè)家畜體內(nèi)毒素中毒的方法，不僅省時(shí)省力，而且結(jié)果可信。提取宿主肝臟線粒體DNA，設(shè)計(jì)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(COI)基因特異性引物，運(yùn)用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)肝臟COI基因片段進(jìn)行分析并測(cè)序。內(nèi)毒素中毒后的家畜樣本PCR條帶泳動(dòng)異常，測(cè)序COI基因片段在5322和5331處同時(shí)發(fā)生T－G的置換點(diǎn)突變，表明宿主機(jī)體已經(jīng)遭受到內(nèi)毒素的中毒并產(chǎn)生了毒性效應(yīng)。該方法重復(fù)性、特異性和敏感性較好，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測(cè)家畜內(nèi)毒素中毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及家畜內(nèi)毒素中毒的檢測(cè)方法，具體涉及利用宿主肝臟線粒體COI基因點(diǎn)突變來檢測(cè)家畜內(nèi)毒素中毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]規(guī)?；曫B(yǎng)家畜過程中細(xì)菌感染和濫用抗生素容易導(dǎo)致家畜發(fā)生內(nèi)毒素中毒，內(nèi)毒素中毒檢測(cè)是診斷家畜疾病的重要手段。傳統(tǒng)方法是分離制備毒素，給小白鼠灌胃，通過臨床癥狀進(jìn)行判斷，或者是采集血液，用昂貴的鱟試驗(yàn)法進(jìn)行診斷。以上兩種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)成本高，檢測(cè)結(jié)果對(duì)于不同種類家畜不準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目 的在于提供一種準(zhǔn)確，快速，簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本低，易于推廣應(yīng)用的利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測(cè)家畜內(nèi)毒素中毒的方法。
[0004]本發(fā)明公開了一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測(cè)家畜內(nèi)毒素中毒的方法，包括肝臟mtDNA提取、mtDNA COI基因片段的擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的SSCP分析和DNA序列測(cè)定步驟，其特征在于選擇了肝臟線粒體基因中的細(xì)胞色素C氧化酶(COI)基因，設(shè)計(jì)了特異性引物，可以擴(kuò)增該基因的5308-5611位置上的基因片段。
[0005]在上述的檢測(cè)方法中，所述的mtDNA提取步驟中試劑配方如下:
(1)SE 溶液(pH: 7.8):0.25M 蔗糖、2.5mMCaC12、30mM Tris-HCl、IOmM EDTANa2 ;
(2)溶液I (TEN, ρΗ8.0):0.15Μ NaCl、IOmM EDTANa2、IOmM Tris-HCl ；
(3)溶液I1:1%SDS，其中含0.2NNa0H，現(xiàn)用現(xiàn)配，混勻，立即使用；
(4)溶液II1:3MKac，其中含3MKAc、5M冰乙酸，混勻，高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆茫?br> (5)TE 溶液(pH: 8.0):10mM Tris-HCl、0.1mM EDTANa2、20ug/ml DNase-free RNase。
[0006]所述的肝臟mtDNA提取步驟如下:
(1)取樣品的肝組織0.5g~1.0g，在冰預(yù)冷的SE溶液中洗去血污后轉(zhuǎn)入6ml冰預(yù)冷SE中剪碎，再轉(zhuǎn)入IOml離心管中，高速分散器上1500rpm勻漿3次，每次間隔20sec，每次勻衆(zhòng)IOsec,然后離心機(jī)上2000rpm離心15min,棄沉淀，上清轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管中；
(2)Eppendorf管中的上清液12000rpm離心15min,棄上清,每管加Iml 0°C預(yù)冷的SE溶液重懸沉淀，混勻后轉(zhuǎn)入第二支的eppendorf管，12000rpm離心8min,棄上清，每管加150 μ I溶液I，輕輕充分混勻，室溫靜置15min，每管加300 μ I新配制的溶液II，小心混勻，(TC冰箱中冰浴IOmin后，每管加4°C預(yù)冷的225 μ I溶液III，小心混勻，于0°C冰箱中冰浴30min后，12000rpm離心6min，棄沉淀，小心取上清(注意不要吸取白色物質(zhì)以免造成污染)轉(zhuǎn)入第三支的Eppendorf管；
(3)加入水飽和酹于第三支Eppendorf管的上清液中，混勻，上下顛倒輕輕搖動(dòng)20min后，再加入氯仿-異戍醇，上下顛倒輕搖15min混勻后，12000rpm離心8min,取水相轉(zhuǎn)入第四支的Eppendorf管,重復(fù)步驟(2) —至三次至液體中間層無白色物質(zhì)為止；
(4)取經(jīng)過步驟(3)處理后的水相于Eppendorf管中，加入2倍體積于水相的無水乙酉享，混勻，于O°C冰箱內(nèi)冰浴30min, 12000rpm離心10min,棄上清,用0°C預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后，12000rpm離心5min，徹底去上清，所得沉淀即為純化的mtDNA ；
(5)純化的mtDNA于空氣中自然干燥90-120min(或真空干燥)，然后每管加50 μ I TE溶液，于室溫下充分溶解60-90min，轉(zhuǎn)入4°C冰箱中過夜，第二天于恒溫水浴箱中68°C水浴30min或100°C水浴IOmin以滅活DNase和RNase，分裝后于4°C保存?zhèn)溆没騙20°C長(zhǎng)期保存。
[0007]所述的mtDNA COI基因片段的擴(kuò)增步驟如下:
特異性引物序列如下:
表1 COI基因片段的PCR引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種利用宿主肝臟線粒體基因突變檢測(cè)家畜內(nèi)毒素中毒的方法，包括肝臟mtDNA提取、mtDNA COI基因片段的擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的SSCP分析和DNA序列測(cè)定步驟，其特征在于選擇了肝臟線粒體基因中的細(xì)胞色素C氧化酶(COI)基因，設(shè)計(jì)了特異性引物，可以擴(kuò)增該基因的5308-5611位置上的基因片段，結(jié)合SSCP技術(shù)檢測(cè)該基因片段的突變來確定家畜內(nèi)毒素是否中毒。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的mtDNA提取步驟中試劑配方如下:
(1)SE 溶液(pH: 7.8):0.25M 蔗糖、2.5mMCaC12、30mM Tris-HClUOmM EDTANa2 ;
(2)溶液I (TEN, ρΗ8.0):0.15M NaCl、IOmM EDTANa2、IOmM Tris-HCl ； (3)溶液I1:1%SDS，其中含0.2NNa0H，現(xiàn)用現(xiàn)配，混勻，立即使用； (4)溶液II1:3MKac，其中含3MKAc、5M冰乙酸，混勻，高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆茫?br> (5)TE 溶液(pH: 8.0):10mM Tris-HCl.0.1mM EDTANa2、20ug/ml DNase-free RNase。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的肝臟mtDNA提取步驟如下: (1)取樣品的肝組織0.5g~1.0g，在冰預(yù)冷的SE溶液中洗去血污后轉(zhuǎn)入6ml冰預(yù)冷SE中剪碎，再轉(zhuǎn)入IOml離心管中，高速分散器上1500rpm勻漿3次，每次間隔20sec，每次勻衆(zhòng)IOsec,然后離心機(jī)上2000rpm離心15min,棄沉淀，上清轉(zhuǎn)入1.5ml Eppendorf管中； (2)Eppendorf管 中的上清液12000rpm離心15min,棄上清,每管加Iml 0°C預(yù)冷的SE溶液重懸沉淀，混勻后轉(zhuǎn)入第二支的eppendorf管，12000rpm離心8min,棄上清，每管加150 μ I溶液I，輕輕充分混勻，室溫靜置15min，每管加300 μ I新配制的溶液II，小心混勻，(TC冰箱中冰浴IOmin后，每管加4°C預(yù)冷的225 μ I溶液III，小心混勻，于0°C冰箱中冰浴30min后，12000rpm離心6min，棄沉淀，小心取上清(注意不要吸取白色物質(zhì)以免造成污染)轉(zhuǎn)入第三支的Eppendorf管； (3)加入水飽和酹于第三支Eppendorf管的上清液中，混勻，上下顛倒輕輕搖動(dòng)20min后，再加入氯仿-異戍醇，上下顛倒輕搖15min混勻后，12000rpm離心8min,取水相轉(zhuǎn)入第四支的Eppendorf管,重復(fù)步驟(2) —至三次至液體中間層無白色物質(zhì)為止； (4)取經(jīng)過步驟(3)處理后的水相于Eppendorf管中，加入2倍體積于水相的無水乙酉享，混勻，于O°C冰箱內(nèi)冰浴30min, 12000rpm離心10min,棄上清,用0°C預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后，12000rpm離心5min，徹底去上清，所得沉淀即為純化的mtDNA ； (5)純化的mtDNA于空氣中自然干燥90-120min(或真空干燥)，然后每管加50 μ I TE溶液，于室溫下充分溶解60-90min，轉(zhuǎn)入4°C冰箱中過夜，第二天于恒溫水浴箱中68°C水浴30min或100°C水浴IOmin以滅活DNase和RNase，分裝后于4°C保存?zhèn)溆没騙20°C長(zhǎng)期保存。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的mtDNACOI基因片段的擴(kuò)增步驟如下: 特異性引物序列如下: 表1 COI基因片段的PCR引物序列
Table I PCR primer sequncee of every target gene fragment
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的PCR產(chǎn)物的SSCP分析步驟如下: (1)制備聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置，對(duì)PCR樣品進(jìn)行變性處理； 0.3-1.5μ I PCR樣品、8 μ I滅菌去離子水和8μ I SSCP載樣緩沖液在0.5ml滅菌PCR管中混合、于PCR儀中98°C變性13-18min，變性完畢，迅速取出各樣品置于_20°C冰箱中？冷卻3-5min以避免溫度緩慢下降導(dǎo)致ssDNA退火重新形成dsDNA ； (2)各點(diǎn)樣孔依次加滿0.5 X TBE緩沖液，然后將經(jīng)過變性處理的PCR樣品依次加入凝膠加樣孔中，跑膠，電泳電壓和電泳時(shí)間分別是520V和2-3h ； (3)將玻璃板中的凝膠塊小心剝離，放入染色盤中，用銀染法顯色，數(shù)碼相機(jī)拍照或在凝膠成像系統(tǒng)上照相。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的DNA序列測(cè)定是在SSCP分析結(jié)果中，將出現(xiàn)泳動(dòng)異常的PCR樣品，及正常對(duì)照的PCR樣品進(jìn)行DNA序列測(cè)定，序列測(cè)定由上海生物工程有限公司完成。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993080SQ201410208494
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】高洪, 嚴(yán)玉霖, 彭輅, 周銘濤, 陳利平, 陳玲, 趙汝 申請(qǐng)人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)