一種李氏木霉菌株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及通過原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶的菌株，以及李氏木霉原生質(zhì)體制備、分離、融合、再生及其篩選方法。本發(fā)明以三種李氏木霉為出發(fā)菌株，經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化、培養(yǎng)后，利用蝸牛酶、溶壁酶等水解細胞壁，在恒溫下振蕩，制備原生質(zhì)體，經(jīng)原生質(zhì)體融合后，利用含纖維素的平板進行篩選，最后，得到一株纖維素酶高產(chǎn)菌株(Trichoderma?reesei?JL16)，該菌產(chǎn)纖維素酶的能力比出發(fā)菌株提高了25％。本發(fā)明李氏木霉菌株JL16可以用于工業(yè)生產(chǎn)；針對李氏木霉提出的原生質(zhì)體制備、分離、融合、再生及其篩選方法具有很強的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種李氏木霉菌株及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及通過原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建的高產(chǎn)纖維素酶的李氏木霉菌株，以及李氏木霉的制備方法。
技術(shù)背景
[0002]用于生產(chǎn)的纖維素酶一般來自于霉菌，比較典型的是木霉屬。而李氏木霉則是木霉屬中最為重要的一種，并在纖維素降解領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。從分離得到第一株李氏木霉到現(xiàn)在，李氏木霉經(jīng)歷了多輪誘變、篩選，得到了包括MCG-77，QM9414，RUTC-30等眾多高產(chǎn)菌株。
[0003]工業(yè)生產(chǎn)上，一般使用真菌等生產(chǎn)纖維素酶，其中最著名的是李氏木霉，李氏木霉具有纖維素酶酶譜全、活力高的特點。自20世紀60年代以來，人們以野生菌株T.reeseiQM6a為出發(fā)菌株，進行了大量的誘變育種工作，其中QM9414、RutC30和MCG77等能夠大量表達內(nèi)切和外切葡聚糖酶，是國內(nèi)外纖維素酶生產(chǎn)的主要菌種。
[0004]通過使用原生質(zhì)體融合的方法能夠得到高產(chǎn)纖維素酶的李氏木霉菌株。原生質(zhì)體融合指通過人為的方法，把常規(guī)誘變所獲得的優(yōu)良性狀菌株，通過原生質(zhì)體融合集中到一個菌株中。目前，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得優(yōu)良菌株的主要專利包括CN201210301323.5、CN201010210226.6、CN201010174196.8、CN200880132218.5 等，這些原生質(zhì)體融合主要采用“雙親滅活法”，操作方法仍需進一步簡化，誘變率還需進一步提高。本發(fā)明選擇三株纖維素酶高產(chǎn)菌株進行融合，從而提高纖維素酶系的整體活力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的之一是通過多株李氏木霉的原生質(zhì)體融合，得到一株纖維素酶高產(chǎn)菌株。
[0006]本發(fā)明目的之二是建立李氏木霉誘變及篩選方法。
[0007]原生質(zhì)體融合在本質(zhì)上是基因組水平的隨機重組，它的一般步驟是，通過經(jīng)典的誘變育種方法得到多個正突變菌株，也就是多樣性的的基因組庫，然后，將這些突變菌株制備成原生質(zhì)體，通過原生質(zhì)體融合，進行全基因組水平的隨機重組，篩選得到高產(chǎn)菌株。
[0008]本發(fā)明對QM9414、RutC30和MCG77進行原生質(zhì)體融合，通過篩選，得到纖維素酶高產(chǎn)菌株。同時，建立了李氏木霉原生質(zhì)體制備、分離、融合、再生和高產(chǎn)菌株的篩選方法。本發(fā)明構(gòu)建的高產(chǎn)纖維素酶(李氏木霉幾16)，于2014年I月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.8807，分類命名為李氏木霉(Trichoderma reesei)。該菌株纖維素酶產(chǎn)率高，遺傳穩(wěn)定性好。
[0009]本發(fā)明請求保護的一種李氏木霉菌株，是于2014年I月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8807的菌株，菌株的名稱為李氏木霉幾16。
[0010]所述的李氏木霉幾16，是采用三株纖維素酶高產(chǎn)菌株通過原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體分離、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生和篩選的制備步驟構(gòu)建；所述的三株纖維素酶高產(chǎn)菌株，是李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30。
[0011]本發(fā)明的李氏木霉JL16的制備方法的技術(shù)方案如下所述。
[0012]一種李氏木霉菌株的制備方法，有原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體的再生和篩選的過程；
[0013]所述的原生質(zhì)體的制備，是將李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌絲；將三株李氏木霉孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基中，得到含有抱團菌絲體的李氏木霉；將菌絲體用PH6.5的檸檬酸緩沖液定容，離心，棄上清后重新補加檸檬酸緩沖液并混勻；再分別加入到去壁混合酶液中酶解細胞壁，得到含原生質(zhì)體的溶液；最后經(jīng)分離得到白色沉淀的李氏木霉原生質(zhì)體；
[0014]所述的原生質(zhì)體的融合，用融合劑將三種白色沉淀原生質(zhì)體一起吹溶，室溫靜置10~60min ;所述的融合劑，由按下列重量配比的物質(zhì)組成:20 %~80 %聚乙二醇(PEG4000)、0.01 ~0.05M CaCl2 和 0.2 ~1.0M 山梨醇；
[0015]所述的原生質(zhì)體的再生，是將融合完的原生質(zhì)體懸液用NaCl溶液梯度稀釋，取稀釋液涂在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，28°C見光培養(yǎng)96h，保持相對濕度大于60%，直到長出透明圈；所述的再生培養(yǎng)基，由下列重量配比的物質(zhì)組成=KH2PO4 3~5g/L、NaNO3 2.6~3.0g/L、尿素 0.5 ~1.0g/L、FeSO4.7Η20 7.5 ~I Omg/L、MnSO4.H2O 2.5 ~3.0mg/L、ZnSO4.7Η20 3.6 ~5 .0mg/L、CoCl2.6Η20 3.7 ~5.0mg/L、MgSO4.7Η20 0.5 ~1.0g/L、CaCl20.5~1.0g/L、脫氧膽酸鈉2~5g/L、蛋白胨10~15g/L、NaCl 35~50g/L、瓊脂16~20g/L、球磨纖維素20g/L ；
[0016]所述的篩選，是挑取透明圈直徑/菌落直徑大的菌株一環(huán)至甘油中，得到李氏木霉JL16于-80°C下保存。
[0017]在原生質(zhì)體的制備中，檸檬酸緩沖液由下列重量配比的物質(zhì)組成:每升中含有
0.1M檸檬酸溶液70ml、0.1M檸檬酸鈉溶液930ml、NaCl 0.6mol。
[0018]在原生質(zhì)體的制備中，去壁混合酶液由溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶，加入pH6.5檸檬酸緩沖液構(gòu)成，各成分含量為溶壁酶2~8mg/ml、蝸牛酶2~8mg/ml、纖維素酶2~8mg/ml ο
[0019]在原生質(zhì)體的制備中，分離所使用的分離裝置是由一支5~50ml的離心管，在距底部I~1cm處塞滿脫脂棉，厚度約為I~5cm，底部插入槍頭，用檸檬酸緩沖液浸濕脫脂棉，在分離裝置頂部加入酶解后的菌液，1000~3000rpm離心8~lOmin，底部液體即為含有原生質(zhì)體的穩(wěn)滲液，取出分離裝置中的脫脂棉，將分離裝置底部液體分裝至I~1ml離心管中，3000~8000rpm離心12~15min，去掉上清后底部殘留的白色沉淀即為原生質(zhì)體。
[0020]在原生質(zhì)體的再生中所述的球磨纖維素，是經(jīng)直徑2~4mm的玻璃珠在200rpm下振蕩處理48小時得到的纖維素。
[0021]本發(fā)明提供的李氏木霉原生質(zhì)體制備、分離及融合的方法，更具體的操作步驟敘述如下:
[0022]1.制備三親本的李氏木霉孢子懸液
[0023]分別挑取甘油凍存管中的三株李氏木霉菌株QM9414、MCG77、RutC-30 一環(huán)，接種在含有50ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基制成的固體斜面上，在溫度28°C、培養(yǎng)72h，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌絲，加入2ml無菌蒸餾水，用vortex振蕩2min，得到含有孢子的孢子液，將該孢子液進行倍比稀釋，并在顯微鏡下計數(shù)，使得成熟的李氏木霉孢子濃度在I X 106/ml的李氏木霉孢子懸液。
[0024]所述PDA培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成:土豆:200g/L (煮沸30min并過濾)；匍萄糖:20g/L ;瓊月旨:20g/L。
[0025]2.制備三親本的菌絲懸液
[0026]分別將三株Iml的李氏木霉孢子懸液接種至20ml種子培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度28°C，培養(yǎng)72h，用8層紗布過濾掉培養(yǎng)基，得到含有抱團菌絲體的李氏木霉。
[0027]將菌絲體導入50ml的離心管中，用pH6.5的檸檬酸緩沖液定容至15ml，5000轉(zhuǎn)4°C離心10min，棄掉上清后重新補加檸檬酸緩沖液至15ml，重復3次，最后，將菌絲體在緩沖液中混勻。
[0028]所述pH6.5的檸檬酸緩沖液由下列重量配比的物質(zhì)組成:每升中含有:0.1M檸檬酸溶液70ml、0.1M檸檬酸鈉溶液930ml、NaCl 0.6mol。
[0029]3.去壁酶的制作
[0030]取三支5ml的EP管，分別加入的溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶，并分別加入pH6.5檸檬酸緩沖液，充分溶解。
[0031]用孔徑為0.2μπι的濾膜分別過濾三種酶液并混合到一起，最終得到的混合酶液，含量為溶壁酶2~8mg/ml、蝸牛酶2~8mg/ml、纖維素酶2~8mg/ml。
[0032]4.酶解細胞壁
[0033]三株菌各取3ml的菌絲懸液，并分別加入1ml的混合酶液，溫度35°C輕微振蕩酶解3個小時，每半個小時一鏡檢觀察。
[0034]5.三親本的原生質(zhì)體的分離及融合
[0035]酶解去壁后,取一支5~50ml的離心管,在距底部I~1cm處塞滿脫脂棉,厚度約為I~5cm，底部插入槍頭，構(gòu)成自制的原生質(zhì)體分離裝置(如圖1)。用pH6.5的檸檬酸緩沖液浸濕分離裝置中的脫脂棉，在分離裝置頂部分別加入酶解去壁后的三種菌液，1000~3000rpm離心8~lOmin，離心后，用鑷子取出脫脂棉，將分離裝置底部含有原生質(zhì)體的檸檬酸緩沖液分裝至I~1ml離心管中，3000~8000rpm離心12~15min,去掉上清后底部殘留的白色沉淀即為原生質(zhì)體，立刻加入400 μ I融合劑將3種菌株的白色沉淀一起吹溶，最終室溫靜置10~60min，并鏡檢觀察。
[0036]所述的融合劑由下列重量配比的物質(zhì)組成:20%~80%聚乙二醇(PEG4000)；
0.01 ~0.05M CaCl2 ；0.2 ~1.0M 山梨醇。
[0037]本發(fā)明又提供了纖維素酶高產(chǎn)菌株的再生、篩選方法，具體操作步驟如下:
[0038]1.原生質(zhì)體的再生
[0039]將融合完的原生質(zhì)體懸液用濃度0.6mol/L的NaCl溶液梯度稀釋100倍，取0.1ml稀釋液涂在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，28°C見光培養(yǎng)96h，保持相對濕度大于60%，直到長出透明圈為止。
[0040]所述的再生培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成=KH2PO4:3~5g/L ；NaN03:2.6~3.0g/L ;尿素:0.5 ~1.0g/L ；FeS04.7H20:7.5 ~I Omg/L ；MnS04.H2O:2.5 ~3.0mg/L ；ZnSO4.7H20:3.6 ~5.0mg/L ；CoCl2.6H20:3.7 ~5.0mg/L ；MgS04.7H20:0.5 ~1.0g/L ；CaCl2:0.5 ~1.0g/L ;脫氧膽酸鈉:2 ~5g/L ;蛋白胨:10 ~15g/L ；NaCl:35 ~50g/L ;瓊脂:16~20g/L ;球磨纖維素20g/L (球磨纖維素事先用10g直徑3mm左右的玻璃珠200rpm振蕩處理48h)。
[0041]2.高產(chǎn)纖維素酶的李氏木霉菌株的篩選和檢測方法:
[0042]挑取透明圈直徑/菌落直徑大的6株菌落一環(huán)至Iml去離子水中，在顯微鏡下計數(shù)，適量稀釋至菌濃度為lX106/ml，取Iml加入發(fā)酵液中，200rpm 28~32°C培養(yǎng)96~144h,后取Iml的發(fā)酵液，8000rpm離心8~1min取上清，測定酶活，發(fā)現(xiàn)JL16號菌株的酶活明顯高于三株原始菌株高，即幾16號菌株為突變株。
[0043]每一個250ml的錐形瓶中含有10ml的發(fā)酵液，所述的發(fā)酵液由下列重量配比的物質(zhì)組成:蛋白胨3~5g/L、酵母提取物0.5~1.0g/L、KH2P043~5g/L、(NH4)2S042~5g/L、尿素 0.3 ~0.5g/L、MgS040.3 ~0.5g/L、CaC035 ~10g/L、氣爆秸桿 30 ~40g/L，調(diào)節(jié) pH至 5.5。
[0044]酶活的測定方法:將l*6cm濾紙條對折卷起放入試管底部，加入1ml檸檬酸緩沖液，注:緩沖液要將濾紙完全浸透，水浴50°C保溫，加入適當稀釋的酶液，50°C 60min反應(yīng)。加3ml DNS，充分混勻后放入沸水浴中5min，如作標準曲線，則同時加3mlDNS?？瞻?1.5ml檸檬酸緩沖液，酶空:1.0ml檸檬酸緩沖液+0.5ml酶液，濾紙空白:1.5ml檸檬酸緩沖液+濾紙，繪制葡萄糖標準曲線，計算樣品的葡萄糖含量，在樣品葡萄糖含量為2mg/ml處找出對應(yīng)的酶濃度，用0.37/酶濃度即為此纖維素酶的活力。
[0045]本發(fā)明選擇三株纖維素酶高產(chǎn)菌株進行融合，得到纖維素酶高產(chǎn)菌株李氏木霉JL16 (Trichoderma reesei JL16),從而提高纖維素酶系的整體活力，產(chǎn)纖維素酶的能力比出發(fā)菌株提高了 25%，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。另外，本發(fā)明針對李氏木霉提出的原生質(zhì)體制備、分離、融合、再生及其篩選方法具有很強的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為原生質(zhì)體分離裝置。提供的原生質(zhì)體分離裝置附圖，幫助相關(guān)人員實施本發(fā)明。

【具體實施方式】
[0047]實施例1:優(yōu)選條件下的李氏木霉的原生質(zhì)體制備和融合
[0048]1.制備三親本的李氏木霉孢子懸液
[0049]李氏木霉菌QM9414和李氏木霉菌MCG77購買于ATCC(American Type CultureCollect1n),李氏木霉菌 RutC-30 購買于 CGMCC(China General Microb1logicalCulture Collect1n Center)。分別挑取甘油凍存管中的三株李氏木霉菌株QM9414、MCG77、RutC-30—環(huán)，接種在含有50ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基制成的固體斜面上，在溫度28°C、培養(yǎng)72h，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌絲，加入2ml無菌蒸餾水，用vortex振蕩2min，得到含有孢子的孢子液，將該孢子液進行梯度稀釋，并在顯微鏡下計數(shù)，使得成熟的李氏木霉孢子濃度在IXlOfVml的李氏木霉孢子懸液；
[0050]所述PDA培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成:土豆:200g/L (煮沸30min并過濾)；匍萄糖:20g/L ;瓊月旨:20g/L。
[0051]2.制備三親本的菌絲懸液
[0052]分別將三株Iml的李氏木霉孢子懸液接種至20ml種子培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度28°C培養(yǎng)72h，用8層紗布過濾掉培養(yǎng)基，得到含有抱團菌絲體的李氏木霉。
[0053]將菌絲體導入50ml的離心管中，用pH6.5的檸檬酸緩沖液定容至15ml，5000轉(zhuǎn)4°C離心10min，棄掉上清后重新補加檸檬酸緩沖液至15ml，重復3次，最后，后將菌絲體在緩沖液中混勻。
[0054]3.去壁酶的制作
[0055]取三支5ml的EP管,分別加入144mg的溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶,并分別加入3ml的pH6.5檸檬酸緩沖液,充分溶解。
[0056]用孔徑為0.2 μ m的濾膜分別過濾三種酶液，得到約1.5ml左右的三種酶液，各取Iml混合到一起，最終得到3ml的混合酶液，含量為溶壁酶4mg/ml、蝸牛酶4mg/ml、纖維素酶 4mg/ml。
[0057]4.酶解細胞壁
[0058]三株菌各取3ml的菌絲懸液，并分別加入1ml的混合酶液，溫度35°C輕微振蕩酶解3個小時,每半個小時一鏡檢觀察,最終液體的酶液濃度為溶壁酶4mg/ml、蝸牛酶4mg/ml、纖維素酶4mg/ml。
[0059]5.原生質(zhì)體的分離及融合
[0060]酶解去壁后，取三支15ml的離心管，在距底部4cm處塞滿脫脂棉，厚度約為1cm，底部插入Iml槍頭，構(gòu)成原生質(zhì)體分離裝置。用pH6.5的檸檬酸緩沖液浸濕分離裝置中的脫脂棉，在分離裝置頂部分別加入酶解后的三種菌液，100rpm離心10min，離心后，用鑷子取出脫脂棉，將分離裝置底部液體分裝至Iml離心管中，4000rpm離心15min，去掉上清后底部殘留的白色沉淀即為原生質(zhì)體，立刻加入400 μ I融合劑將3種菌株的白色沉淀一起吹溶，最終室溫靜置30min，并鏡檢觀察。
[0061]所述的融合劑由下列重量配比的物質(zhì)組成:50% PEG4000 ；0.01M CaCl2 ；0.6M山梨醇。
[0062]實施例2:優(yōu)選條件下的纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選方法
[0063]1.原生質(zhì)體的再生
[0064]將融合完的原生質(zhì)體懸液用濃度0.6mol/L的NaCl溶液梯度稀釋100倍，取0.1ml稀釋液涂在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，28°C見光培養(yǎng)96h，保持相對濕度大于60%，直到長出透明圈為止。
[0065]所述的再生培養(yǎng)基由下列重量配比的物質(zhì)組成::KH2PO4: 3g/L ；NaNO3:2.6g/L ；尿素:0.5g/L ；FeS04.7H20:7.5mg/L ；MnSO4.H20:2.5mg/L ；ZnSO4.7H20: 3.6mg/L ；CoCl2 *6H20:3.7mg/L ；MgS04 *7H20:0.5g/L ；CaCl2:0.5g/L ;脫氧膽酸鈉:2g/L ;蛋白胨:10g/L ；NaCl:35g/L ;瓊脂:16g/L ;球磨纖維素20g/L (球磨纖維素事先用10g直徑3mm左右的玻璃珠200rpm振蕩處理48h)。
[0066]2.高產(chǎn)纖維素酶李氏木霉菌株的篩選方法
[0067]挑取透明圈直徑/菌落直徑大的6株菌落一環(huán)至Iml去離子水中，在顯微鏡下計數(shù)，適量稀釋至菌濃度為lX106/ml，取Iml加入發(fā)酵液中，200rpm轉(zhuǎn)28°C培養(yǎng)144h，后取Iml的發(fā)酵液，8000rpm離心1min取上清,測定酶活,發(fā)現(xiàn)JL16號菌株的酶活明顯高于三株原始菌株高，纖維素酶酶活提高25%，即JL16號菌株為突變株。
[0068]每一個250ml的錐形瓶中含有10ml的發(fā)酵液，所述的發(fā)酵液由下列重量配比的物質(zhì)組成:蛋白胨:3g/L ;酵母提取物:0.5g/L ；KH2P04:3g/L ； (NH4) 2S04:2g/L ;尿素:0.3g/L ；MgS04:0.3g/L ；CaC03:5g/L ;氣爆秸桿:30g/L ;調(diào)節(jié) pH 至 5.5。
[0069]實施例3:李氏木霉的原生質(zhì)體制備和融合、纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選方法
[0070]在優(yōu)選條件的基礎(chǔ)上，在
【發(fā)明內(nèi)容】
公開的制備條件范圍內(nèi)，均可以實施本發(fā)明，得到李氏木霉幾16的菌株。
[0071]實施例4:由實施例1、2制得的李氏木霉JL16菌株與三株原始菌株的β -葡萄糖苷酶酶活及蛋白產(chǎn)量比較
[0072]1.發(fā)酵液樣品的提取
[0073]分別挑取斜面生長的高產(chǎn)菌株JL16和三株原始菌株一環(huán)至Iml去離子水中，在顯微鏡下計數(shù)，適量稀釋至菌濃度為lX106/ml，取Iml加入發(fā)酵液中，200rpm轉(zhuǎn)28°C培養(yǎng)144h,后取適量的發(fā)酵液，8000rpm離心1min取上清，上清于_20°C冰箱內(nèi)保存。
[0074]每一個250ml的錐形瓶中含有10ml的發(fā)酵液，所述的發(fā)酵液由下列重量配比的物質(zhì)組成:蛋白胨:3g/L ;酵母提取物:0.5g/L ；KH2PO4:3g/L ； (NH4) 2SO4:2g/L ;尿素:0.3g/L ；MgS04:0.3g/L ；CaC03:5g/L ;氣爆秸桿:30g/L ;調(diào)節(jié) pH 至 5.5.
[0075]2.β-葡萄糖苷酶及蛋白的測定方法
[0076]①.β -葡萄糖苷酶酶活的測定:用50mM檸檬酸緩沖液pH4.8適當稀釋酶液，取Iml酶液+Iml 15mmol/L纖維二糖,50°C反應(yīng)30min,再沸水浴5min,迅速冷卻,用葡萄糖試劑盒測其葡萄糖含量。通過測定，JL16菌株的β -葡萄糖苷酶酶活提高15%。
[0077]②.蛋白含量的測定:配制考馬斯亮藍G-250試劑及l(fā)mg/ml的BSA溶液，并配制BSA濃度為O~lmg/ml的BSA標準溶液若干，分別取BSA標準溶液和適當稀釋的酶液0.1ml于15ml試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑充分混勻，5分鐘后測0D595。通過測定，JL16菌株的蛋白產(chǎn)量提高12%。
【權(quán)利要求】
1.一種李氏木霉菌株，其特征在于，是于2014年I月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.8807的菌株，菌株的名稱為李氏木霉幾16。
2.如權(quán)利要求1所述的李氏木霉菌株，其特征在于，所述的李氏木霉菌株幾6，采用三株纖維素酶高產(chǎn)菌株通過原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體分離、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生和篩選的制備步驟構(gòu)建；所述的三株纖維素酶高產(chǎn)菌株，是李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30。
3.一種權(quán)利要求1的李氏木霉菌株的制備方法，有原生質(zhì)體的制備、原生質(zhì)體的融合、原生質(zhì)體的再生和篩選的過程； 所述的原生質(zhì)體的制備，是將李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌絲；將三株李氏木霉孢子懸液接種至種子培養(yǎng)基中，得到含有抱團菌絲體的李氏木霉；將菌絲體用PH6.5的檸檬酸緩沖液定容，離心，棄上清后重新補加檸檬酸緩沖液并混勻；再分別加入到去壁混合酶液中酶解細胞壁，得到含原生質(zhì)體的溶液；最后經(jīng)分離得到白色沉淀的李氏木霉原生質(zhì)體； 所述的原生質(zhì)體的融合，用融合劑將三種白色沉淀原生質(zhì)體一起吹溶，室溫靜置10~60min ;所述的融合劑，由按下列重量配比的物質(zhì)組成:20%~80%聚乙二醇、0.01~0.05MCaCl2和0.2~1.0M山梨醇； 所述的原生質(zhì)體的再生，是將融合完的原生質(zhì)體懸液用NaCl溶液梯度稀釋，取稀釋液涂在原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，28°C見光培養(yǎng)96h，保持相對濕度大于60%，直到長出透明圈；所述的再生培養(yǎng)基 ，由下列重量配比的物質(zhì)組成:KH2P043~5g/L、NaN032.6~3.0g/L、尿素 0.5 ~1.0g/L,FeSO4.7Η207.5 ~10mg/L、MnS04.Η202.5 ~3.0mg/L,ZnSO4.7Η203.6 ~5.0mg/L、CoCl2.6Η203.7 ~5.0mg/L、MgSO4.7Η200.5 ~1.0g/L、CaCl20.5 ~1.0g/L、脫氧膽酸鈉2~5g/L、蛋白胨10~15g/L、NaC135~50g/L、瓊脂16~20g/L、球磨纖維素20g/L ； 所述的篩選，是挑取透明圈直徑/菌落直徑大的菌株一環(huán)至甘油中，得到李氏木霉JL16于-80°C下保存。
4.如權(quán)利要求3所述的李氏木霉菌株的制備方法，其特征在于，在原生質(zhì)體的制備中，所述的檸檬酸緩沖液，由下列重量配比的物質(zhì)組成:每升中含有0.1M檸檬酸溶液70ml、0.1M 檸檬酸鈉溶液 930ml、NaCl0.6mol。
5.如權(quán)利要求3所述的李氏木霉菌株的制備方法，其特征在于，在原生質(zhì)體的制備中，所述的去壁混合酶液，由溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶，加入PH6.5檸檬酸緩沖液構(gòu)成，各成分含量為溶壁酶2~8mg/ml、蝸牛酶2~8mg/ml、纖維素酶2~8mg/ml。
6.如權(quán)利要求3所述的李氏木霉菌株的制備方法，其特征在于，在原生質(zhì)體的制備中，所述的分離，使用的分離裝置是由一支5~50ml的離心管，在距底部I~1cm處塞滿脫脂棉，厚度約為I~5cm，底部插入槍頭，用檸檬酸緩沖液浸濕脫脂棉，在分離裝置頂部加入酶解后的菌液，1000~3000rpm離心8~lOmin，底部液體即為含有原生質(zhì)體的穩(wěn)滲液，取出分離裝置中的脫脂棉，將分離裝置底部液體分裝至I~1ml離心管中，3000~8000rpm離心12~15min，去掉上清后底部殘留的白色沉淀即為原生質(zhì)體。
7.如權(quán)利要求3所述的李氏木霉菌株的制備方法，其特征在于，在原生質(zhì)體的再生中，所述的球磨 纖維素，是經(jīng)直徑2~4mm的玻璃珠在200rpm下振蕩處理48小時得到的纖維素。
【文檔編號】C12N1/14GK104130946SQ201410208676
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】任曉冬, 劉嘉婧, 崔雨瀟, 滕利榮, 孟慶繁, 逯家輝, 劉艷, 孟令軍, 程琪越, 張廣吉 申請人:吉林大學