一種利用厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種利用玉米粉全水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明采用玉米粉雙酶解法生產(chǎn)的葡萄糖水解液為唯一碳源，玉米粉生產(chǎn)葡萄糖所產(chǎn)生的濾渣——玉米渣經(jīng)中性蛋白酶酶解所得到的玉米糖渣水解液作為唯一氮源，將這兩種水解液組合形成玉米粉全水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在不添加其他營養(yǎng)物質(zhì)條件下，利用其厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，可以代替價格昂貴的酵母粉和蛋白胨，同等條件下，與LB培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸相比，丁二酸的產(chǎn)量提高了1.37%，轉(zhuǎn)化率提高了21.65%。本方法更經(jīng)濟，更清潔，該方法對于丁二酸產(chǎn)業(yè)化有著重大的意義及經(jīng)濟價值。
【專利說明】—種利用厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種厭氧條件下利用玉米粉全水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁二酸又稱琥珀酸，是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。其作為優(yōu)秀的C4平臺化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氫呋喃等有機化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12種最有價值的生物煉制品之一。
[0003]生物合成丁二酸，是利用細菌，真菌等各種微生物，以葡萄糖或其他各種水解液為碳源，經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應(yīng)，故成為近年來研究的熱點。[0004]玉米是世界上最重要的農(nóng)作物之一，而中國是生產(chǎn)玉米的大國之一，有著豐富的玉米資源，有報道稱，中國的玉米年產(chǎn)量超過I億噸。另外，據(jù)報道，玉米中含有對菌體生長和產(chǎn)酸有促進作用的因子，如生物素、Vbi等。玉米粉是制作葡萄糖的重要原料，但是在過濾工藝之后，也產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，玉米渣。因此，將廉價而易得的玉米粉及副產(chǎn)物玉米渣充分利用到發(fā)酵產(chǎn)丁二酸當(dāng)中，這必將對發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸產(chǎn)業(yè)化有著重要的意義。
[0005]大腸桿菌在氧氣缺乏的情況下，丁二酸主要的產(chǎn)生途徑為葡萄糖經(jīng)過糖酵解途經(jīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸，并進而代謝合成草酰乙酸、蘋果酸、富馬酸，最終以丁二酸的形式積累。G.N.Vemuri等人報道利用大腸桿菌兩階段發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法，原理是有氧階段是菌體得到快速積累，然后轉(zhuǎn)為厭氧使菌體產(chǎn)生大量的丁二酸。然而兩階段發(fā)酵過程中，需要消耗大量的營養(yǎng)成分用于菌體的生長，導(dǎo)致丁二酸總得率下降，同時由于菌體有氧生長對溶氧要求較高，攪拌及冷卻等所需要較高的能耗及成本投入，因此，一步厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸受到越來越多的關(guān)注。然而在專一性厭氧條件下，重組大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸需要酵母粉、蛋白胨等復(fù)合氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基成分，但價格過于昂貴，除此之外，還有菌株生長緩慢，丁二酸終濃度和收率較低等問題未解決。為此，尋找一種在專一性厭氧條件下利用發(fā)酵培養(yǎng)基菌株快速生長提高丁二酸終濃度和收率的方法對于發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸產(chǎn)業(yè)化有著突破性的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種能使菌株在厭氧條件下無需價格昂貴的酵母粉、蛋白胨等復(fù)合氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基成分仍能發(fā)酵生產(chǎn)得到高濃度和高收率丁二酸的方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供的一種厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述方法的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉全水解液。[0008]優(yōu)選的，所述的玉米粉全水解液包括玉米粉水解所得的葡糖糖水解液和玉米渣水解液。
[0009]優(yōu)選的，所述的葡萄糖水解液為玉米粉經(jīng)雙酶解法水解所得；所述的玉米渣水解液由上述玉米粉雙酶法水解過慮后的玉米渣經(jīng)中性蛋白水解所的。
[0010]優(yōu)選的，所述的玉米粉雙酶解法的具體步驟為:將玉米粉與純水以固體質(zhì)量分數(shù)38 %的比例混合均勻，并加入鈣離子，其添加量按照每克原料添加0.000175g鈣離子，在pH=6.5，95°C條件下添加7 U/克原料的液化酶，并保溫至液化結(jié)束；將液化液滅完酶活后在pH=4.5，60°C條件下添加200 U/克原料的糖化酶，并保溫48 h，所得糖化液經(jīng)過濾得到的濾液為葡萄糖水解液；
優(yōu)選的，所述的玉米渣水解的具體步驟為:將糖化液過濾后的濾渣和純水按固體質(zhì)量百分數(shù)10%的比例混合，在pH=7.0,55V條件下添加中性蛋白酶,其添加量為濾渣質(zhì)量的
0.3%，24 h后過濾所得濾液為玉米糖渣水解液，并用凱式定氮法對水解液進行氮含量的測定。
[0011]優(yōu)選的，所述的重組大腸桿菌為重組大腸桿菌AFPl 11 {Escherichiaco7iAFPlll)。[0012]優(yōu)選的，所述重組大腸桿菌AFPlll產(chǎn)丁二酸的方法具體步驟如下:
(1)試管培養(yǎng):將抗生素和重組大腸桿菌AscAericAiacolik￥?lll接種在5 ml液體LB培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時間為12 h ；
(2)種子培養(yǎng):將抗生素和試管培養(yǎng)的coliAFPlll接種到種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量50 ml，有氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時間為6 h ；
(3)厭氧搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸:將抗生素和種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，100mL厭氧搖瓶裝液量為30ml，接種量為10 %，堿式碳酸鎂作為pH調(diào)節(jié)劑，充二氧化碳；培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時間為 48 h。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟I)中LB培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5g/L ；
所述的步驟2)中種子培養(yǎng)基配方為蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5 g/L；
所述步驟3)水解液培養(yǎng)基配方為:含1.8 g/L氮元素的玉米糖渣水解液，
葡萄糖水解液10 g/L~80 g/L,堿式碳酸鎂16 g/L。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟3)中葡萄糖水解液為20 g/L。
[0015]優(yōu)選的，所述的步驟3)中充二氧化碳的時間為2分鐘；所述的抗生素為卡那霉素和氯霉素，且添加的終濃度都為100 μ g/mL。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明僅僅利用玉米粉作為原料生產(chǎn)碳源(葡萄糖)和氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基代替價格昂貴的LB培養(yǎng)基(含有進口蛋白胨和酵母粉)，在不添加其他營養(yǎng)物質(zhì)和專一性厭氧條件下，使菌株厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)量和得率相比LB培養(yǎng)基的丁二酸產(chǎn)量和得率略高。并且玉米渣作為工業(yè)上的副產(chǎn)物被充分利用，這種方法不僅經(jīng)濟，節(jié)約，還節(jié)能減排，減少環(huán)境污染。如以重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株，在5 L厭氧發(fā)酵罐中，利用玉米粉經(jīng)酶解所得到的兩種水解液，發(fā)酵120 h消耗50 g/L的葡萄糖，生產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)量為42.29 g/L，丁二酸轉(zhuǎn)化率為84.58%，與LB培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸相比，丁二酸的產(chǎn)量提高了 1.37%，轉(zhuǎn)化率提高了 21.65%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為重組大腸桿菌在純厭氧條件下不同初糖濃度發(fā)酵丁二酸的對比。
[0018]圖2為重組大腸桿菌在純厭氧條件下發(fā)酵120 h實驗結(jié)果曲線圖。
【具體實施方式】
[0019]根據(jù)以下實施例，可以更好的理解本發(fā)明。實施案例中所描述的具體的物料配比，工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0020]本發(fā)明實施例所用的菌株為重組大腸桿菌AFPlll (.Escherichia coli AFPlll[F+ Λ - rpoS396 (Am) rph~l Δ ipfIAB:: Cam) IdhA:: Kan 95)來源于公開文獻(Mutation of the ptsG Gene Results in Increased Production of Succinate inFermentation of Glucose hjEscherichia coli，Appl Environ Microbiol.Jan 2001;67(1): 148 - 154)。由 David P.Clark 教授(Southern Illinois University)惠贈，本發(fā)明人保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料。但本發(fā)明的玉米粉全水解液作為發(fā)酵培養(yǎng)基不僅僅是針對大腸桿菌Escherichia coliAFPlll的，對于其他的菌株也適用。
[0021]實施例1本實施例說明重組大腸桿菌Escherichia co7iAFPlll在厭氧搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的工藝
本實施例所述的培養(yǎng)基配方:
試管、種子培養(yǎng)基的配方包括:蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5 g/L。
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:含1.8 g/L氮元素的玉米渣水解液，葡萄糖水解液20 g/L，堿式碳酸鎂16 g/L。
[0023]具體步驟如下:
(1)試管培養(yǎng):將卡那霉素和氯霉素連同大腸埃希氏菌coliKFVlll接種到試管培養(yǎng)基中，在厭氧條件下，培養(yǎng)溫度37°C，200 r/min，培養(yǎng)時間12 h。；
(2)種子培養(yǎng):將卡那霉素和氯霉素和試管培養(yǎng)的AFPlll接種到種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量50 ml，培養(yǎng)溫度37°C，200 r/min，培養(yǎng)時間6 h ；
(3)厭氧搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸:將卡那霉素和氯霉素和種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10% (v/v), 100 ml血清瓶裝液量30 ml，充二氧化碳2 min,培養(yǎng)48 h后檢測丁二酸的產(chǎn)量為16.39 g/L，丁二酸轉(zhuǎn)化率為81.95 %，詳見下表。
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述方法的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉全水解液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的玉米粉全水解液包括玉米粉水解所得的葡糖糖水解液和玉米渣水解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于:所述的葡萄糖水解液為玉米粉經(jīng)雙酶解法水解所得； 所述的玉米渣水解液由上述玉米粉雙酶法水解過慮后的玉米渣經(jīng)中性蛋白水解所得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的玉米粉雙酶解法的具體步驟為:將玉米粉與純水以固體質(zhì)量分數(shù)38 %的比例混合均勻，并加入鈣離子，其添加量按照每克原料添加0.000175g鈣離子，在pH=6.5，95°C條件下添加7 U/克原料的液化酶，并保溫至液化結(jié)束；將液化液滅完酶活后在pH=4.5，60°C條件下添加200 U/克原料的糖化酶，并保溫48 h，所得糖化液經(jīng)過濾得到的濾液為玉米葡萄糖水解液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的玉米渣水解的具體步驟為:將糖化液過濾后的濾渣和純水按固體質(zhì)量百分數(shù)10%的比例混合，在pH=7.0，55°C條件下添加中性蛋白酶，其添加量為濾渣質(zhì)量的0.3%, 24 h后過濾所得濾液為玉米渣水解液，并用凱式定氮法對水解液中總氮含量進行測定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1權(quán)利要求所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵菌株菌為重組大腸桿菌 AFPll l (.Escherichia co7iAFPlll)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述方法具體步驟如下: (1)試管培養(yǎng):將抗生素和重組大腸桿菌AFPlll接種在5ml液體LB培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時間為12 h ； (2)種子培養(yǎng):將抗生素和試管培養(yǎng)的重組大腸桿菌AFPlll接種到種子培養(yǎng)基中，500ml三角瓶裝液量50 ml，培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時間為6 h ； (3)厭氧搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸:將抗生素和種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，100mL厭氧搖瓶裝液量為30ml，接種量為10 %，堿式碳酸鎂作為pH調(diào)節(jié)劑，充二氧化碳；培養(yǎng)溫度為37°C，200r/min，培養(yǎng)時間為 48 h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述步驟I)中LB培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5 g/L ； 所述的步驟2)中種子培養(yǎng)基配方為蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L, NaCl 5 g/L； 所述步驟3)水解液培養(yǎng)基配方為:含1.8 g/L氮元素的玉米糖渣水解液， 葡萄糖水解液10 g/L~80 g/L,堿式碳酸鎂16 g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述步驟3)中葡萄糖水解液為 20 g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于，所述的步驟3)中充二氧化碳的時間為2分鐘； 所述的抗生素為卡那霉素和氯霉素，且添加的終濃度都為100 yg/mL。
【文檔編號】C12P7/46GK103952447SQ201410212929
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】姜岷, 張漢文, 馬江鋒, 劉嶸明, 梁麗亞 申請人:南京工業(yè)大學(xué)