長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)熒光定量的內(nèi)參基因及其引物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea?gigas)溶藻弧菌(Vibrio?alginolyticus)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)熒光定量?jī)?nèi)參基因的篩選。本發(fā)明篩選出18S?rRNA與28S?rRNA是在溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，牡蠣血細(xì)胞內(nèi)表達(dá)最穩(wěn)定的一對(duì)內(nèi)參基因。這對(duì)內(nèi)參基因在溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)的穩(wěn)定性優(yōu)于候選的另外的其他七個(gè)內(nèi)參基因(包括常用的β-actin和Elongation?factor-1α)，因此能為長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中獲得功能基因表達(dá)的精確定量數(shù)據(jù)提供有力支持。
【專利說(shuō)明】長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)熒光定量的內(nèi)參基因及其引物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域,具體地說(shuō)是適用于長(zhǎng)牡販(Crassostreagigas)溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行功能基因表達(dá)分析的管家內(nèi)參基因的篩選。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)牡販(Crassostrea gigas),也稱太平洋牡販(Pacific oyster),屬于瓣觸綱(Bivalvia),珍珠貝目(Pter1ida),牡販科,是冠輪動(dòng)物(Lophotrochozoa)中軟體動(dòng)物門(Mollusca)內(nèi)的重要分支。其肉質(zhì)肥嫩，鮮美可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界上重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)象。自然分布于日本、中國(guó)和韓國(guó)，為世界性廣布種。太平洋牡蠣作為貝類的“模式種”，一直受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注，尤其是近來(lái)牡蠣基因組序列的破譯引起更廣泛的關(guān)注。
[0003]長(zhǎng)牡蠣天然免 疫系統(tǒng)一直是科學(xué)家們感興趣的領(lǐng)域，開放的循環(huán)系統(tǒng)，每天都要面對(duì)潮間帶各種病原菌的挑戰(zhàn)，而牡蠣卻能應(yīng)付自如，其體內(nèi)必然存在完備精細(xì)的天然免疫系統(tǒng)。病原菌及相關(guān)病原分子應(yīng)激實(shí)驗(yàn)是近年來(lái)研究免疫基因?qū)Σ≡蛳嚓P(guān)分子響應(yīng)機(jī)制的重要手段，研究者通過(guò)對(duì)牡蠣成體進(jìn)行病原菌刺激，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究免疫基因隨時(shí)間對(duì)病原菌的響應(yīng)。
[0004]本研究所選溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所莫照蘭研究員提供，菌株編號(hào)YL1。溶藻弧菌屬于弧菌科(Vibr1naceae),弧菌屬(Vibr1)，是一種嗜鹽性革蘭氏陰性短桿菌。溶藻弧菌是一種常見的海洋致病菌，其數(shù)量居海水弧菌類之首，在世界各地海水及河口處分布廣泛，能引起貝、魚、蝦、蟹等多種養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病，給各國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。因此溶藻弧菌受到廣大貝類免疫系統(tǒng)研究者的關(guān)注，是病原菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)常用到的一種菌株。
[0005]熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)具有操作簡(jiǎn)單，成本較低，靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)常被用來(lái)研究目的基因的表達(dá)。一些對(duì)宿主對(duì)病原菌應(yīng)激反應(yīng)的研究，其轉(zhuǎn)錄水平的研究常常基于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。而相對(duì)熒光定量實(shí)驗(yàn)需要表達(dá)穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參。管家基因是典型的組成性基因，在穩(wěn)定或是病原應(yīng)激的細(xì)胞中，管家基因都能相對(duì)較穩(wěn)定表達(dá)。但是在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，管家基因的表達(dá)量還是有差異的。因此確定穩(wěn)定表達(dá)的管家內(nèi)參基因?qū)Λ@得準(zhǔn)確的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果是非常重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是篩選長(zhǎng)牡販(Crassostrea gigas)溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)熒光定量的內(nèi)參基因。即，基于熒光定量PCR中的相對(duì)定量法在長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中對(duì)免疫基因及其他功能基因進(jìn)行定量分析所用的雙基因熒光定量?jī)?nèi)參基因及其引物。[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0008]篩選出長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)熒光定量的內(nèi)參基因，其特征在于:長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA,具有序列表SEQ ID No:1中堿基序列和28S rRNA具有序列表SEQ ID No: 2中喊基序列。
[0009]根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述貝類基因18S rRNA和28S rRNA在長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)樣品中穩(wěn)定表達(dá)(即，表達(dá)量變化小)，能夠在相對(duì)定量法實(shí)時(shí)熒光定量PCR中作為內(nèi)參基因。
[0010]根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:同時(shí)使用兩個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的管家基因作為雙基因內(nèi)參；雙基因內(nèi)參的表達(dá)量Ct值為兩個(gè)基因在應(yīng)激實(shí)驗(yàn)樣品中的表達(dá)量Ct值的算術(shù)平均數(shù)；通過(guò)該雙基因內(nèi)參校正上樣過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)誤差，能夠提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
[0011]根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:
[0012]18S rRNA的特異性引物為:
[0013]18S-F: 5，-TTGGTTTTCGGAACACGAGGTAAT-3，
[0014]18S-R:5’ -TGCTTGGCAAATGCTTTCGCTG-3’，
[0015]28S rRNA特異性引物為:
[0016]28S-F: 5，-AAGGGCAGGAAAAGAAACTAAC-3，，
[0017]28S-R: 5，-GTTTCCCTCTAAGTGGTTTCAC-3，
[0018]具體步驟為:
[0019]a.候選內(nèi)參基因序列的獲得:選取長(zhǎng)牡蠣熒光定量PCR常用5個(gè)的內(nèi)參基因Elongat1n factor-1α，β -actin,18S rRNA, 28S rRNA 和 Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase (GAPDH),以及在牡販幼蟲發(fā)育過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參Ribosomalprotein (RS18)和Ribosomal protein L7 (RL7),另外3個(gè)從牡販基因組中獲得的人的管家基因的同源基因 S-phase kinase-associated proteinl (SKPl), Heterogeneous nuclearribonucleoprotein Q (HNRQP)和 Ubiquitin-conjugating enzyme E2D2 (UBCDl)共 10 個(gè)基因作為內(nèi)參基因的候選基因。
[0020]b.引物設(shè)計(jì):根據(jù)獲得的候選基因序列設(shè)計(jì)該基因相應(yīng)的特異引物(擴(kuò)增產(chǎn)物單一，具體為溶解曲線峰單一，3%的瓊脂糖膠檢測(cè)條帶單一)。
[0021]c.PCR模板的準(zhǔn)備:收集樣品后，用TRIzol (試劑，市購(gòu)于Life Technologies公司)提取總 RNA,用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(試劑盒，市購(gòu)于TaKaRa公司)按照說(shuō)明書反轉(zhuǎn)成雙鏈cDNA。作為熒光定量PCR的模板。
[0022]d.熒光定量PCR反應(yīng):以反轉(zhuǎn)的cDNA為模版，用內(nèi)參基因相應(yīng)的特異引物在ABI7500FAST real-time PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。獲得各個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)Ct值。
[0023]e.根據(jù)所得Ct值通過(guò)GeNorm v3.4軟件計(jì)算，篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參管家基因并確定最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)目。
[0024]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0025]1.本發(fā)明首次從多達(dá)十種候選內(nèi)參基因中篩選出溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
[0026]2.篩選出的內(nèi)參基因適用于長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中免疫相關(guān)基因或其他功能基因的表達(dá)分析，能顯著提高所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。其應(yīng)用較為普遍，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，靈敏度高，精確度高。
[0027]3.本研究篩選出的的一對(duì)內(nèi)參基因是經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的內(nèi)參篩選程序選出的，是長(zhǎng)牡蠣在溶藻弧菌應(yīng)激條件下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0028]圖1.GeNorm軟件計(jì)算出的各內(nèi)參管家基因表達(dá)穩(wěn)定值；
[0029]圖2.GeNorm通過(guò)成對(duì)變異系數(shù)(Vn/Vn+1)確定最適合的內(nèi)參基因的數(shù)目。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。本發(fā)明所采用實(shí)驗(yàn)用品均來(lái)自市購(gòu)，所用英文標(biāo)記均為產(chǎn)品包裝名稱。
[0031]>序列表⑴SEQ ID NOl的信息18S rRNA基因
[0032]序列特征長(zhǎng)度:1820bp
[0033]類型:核酸 [0034]鏈型:雙鏈
[0035]拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線形
[0036]分子類型:DNA
[0037]特性名稱:18SrRNA
[0038]來(lái)源:長(zhǎng)牡蠣
[0039]序列描述:牡蠣18S rRNA基因全長(zhǎng)，基因編號(hào)AB064942
[0040]TAACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTACATACTCTTGCACAGTGAAACCGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATGGTTCATTAGATGGTACAATCCTACTTGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAACGAAGCTCCGACCTCACGGGAAGAGCGCTTTTATTAGATCAAAACCGATCGGTCGCAAGGCCGTCCTTTTTGGTGACTCTGGATAACTTTGAGCAGATCGCACGGGCTTGTCCCGGCGACGTGTCTTTCAAATGTCTGCCCTATCAACTGTCGGATGGTACGTGCTATGCCTACCATGGTTGTAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCATGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCCTGGCACGGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAATACGGGACTCCTTCGAGGCCCCGTAATTGGAATGAGTACACTTTAAATCCTTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGCTGGATCTCGGGTCCAGGCTGGCGGTCCGCCTCGTTGCGGTCACTGCCTGTCCTGACCCAACCTCTCGGTTGTAAACCCTTGGTGCTCTTGACTGAGTTGCTTCGGGTGGCCGAAACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCGCTTCGCCTGTACAATGGTGCATGGAATAATGGAATAGGACCTCGGTTCTATTTTGTTGGTTTTCGGAACACGAGGTAATGATTAAGAGGGACTGACGGGGGCATTCGTATGGCGGGGTTAGAGGTGAAATTCTTGGATCCTCGCCAGACGGCCTACAGCGAAAGCATTTGCCAAGCATGTTTTCATTAGTCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTTCTGACCATAAACGATGCCAACTAGCAATCCGCCGGAGTTGCTTCAATGACTCGGCGAGCAGCCCCCCGGGAAACCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGAACACTGTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTCTAACCTACTAAATAGTTCACCGATCTATTGCTGTCGGTGTAACTTCTTAGAGGGACAAGTGGCGTTTAGCCACACGAGATTGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCGGGGCCGCACGCGCGCTACACTGAAGGAATCAACAGGTCTCTGTCCTGGCCCGAAAGGGTCGGGT
AACCCGTTGAACCTCCTTCGTGCTAGGGATTGGGGTGTGTAATTCTCCCCATGAACGAGGAATTCCCAGTAAGCGCG
AGTCATCAGCTCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGGATGGTTTAGT
GAGCCCCTTGGACTGGTCCCGACGGCGCGGCAACGCGTTTTCGTCGCTGGTGCCGGGAAGAAGGGCAAACTGTACTT
TCTAGAGGTCGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCAGAAGGATCA
[0041 ] >序列表⑵SEQ ID N02的信息28S rRNA基因
[0042]序列特征長(zhǎng)度:1149bp
[0043]類型:核酸
[0044]鏈型:雙鏈
[0045]拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線形
[0046]分子類型:DNA
[0047]特性名稱:28SrRNA
[0048]來(lái)源:長(zhǎng)牡蠣
[0049]序列描述:牡蠣28S rRNA部分基因序列，基因編號(hào)AY632555
[0050]ACTAAGGGCAGGAAAAGAAACTAACTAGGATTCCCCTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGGAAGAGCCCTGCACCGAATCCCTCATCCTAGCGATGCTGGGAACTGTGGTGTTTGGGACGTCTGTTGTGGTCGTGTGCCGGAGCCCAAGTCCTCTTGATTCGGGCCATCTACCCAGTGCGGGTGTTAGGCCTTTACTGGCTTCGGCCTCGGCTGCTCTGGACTGTCCTAGGAGTCGGGTTGTTTGAGAATGCAGCCCAAAGTGGGTGGTAAACTCCATCTAAGGCTAAATACTTCCCCGAGTCCGATAGCAAACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGAACTTTGAAGAGAGAGTTCAAGAGTACGTGAAACCACTTAGAGGGAAACGGGTGGACCCGCAAAGTCGGCCCGGAGAATTCAGCTCGTCGGAGGGCAGTTGCGGTGTGACTCGCAGGGGGCCGTTCGCGGTCAACGCTTGTCGCTGCTGCGATCTCGTTCGACGACGTGTGCACTTTCTCCGGGCTCGAGCGCCACGACCGGTTTCTATCGGCGGTCAGAAGATCTGGAGGCAGGTGGCCCGCCGGCGGACTCGTTTCCGCCGGTTGGGAGTTATAGCCTCCGGAACGCGGGCCGTCGCGAGACCGAGGACCGGCCGGCCGCTCTTCGCTCCTGTCCTTGCGTGCACGTTTCGACCTGCGGATACTGCCTCTCTGGGGCAGTGGCCGCTAACCGCGTCGTGCGCACCGGACCGGGATGCGTGGGCTGTGCCCGATGGTCAGTGGCGAATCGGTCGGTAGTCCACCCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATGTGCGCAAGTCATTGGGTGTTACGAAACCTAAAGGCGTAATGAAAGTGAAGGCAGCCTCGGGTTCTGCCTAGGTGGGATCCTCGGTCCGTCGCGGCCGGGGCGCACCACCGGCCCGTCCCGTTCGCACTGCGTCGAAGGGGCGGAGCAAGAGCGTACACGTTGGTACCCGAAAGATGGTGAACTATGCTTGAGTAGGATGAAGTCAGAGGAAACTCTGATGGAGGTCCGCAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCAAACTTGAGCATAGGGGCGAAAGACTAATCGAACCATCTAGTAGCTGGTTCC
[0051]實(shí)施例1
[0052]候選內(nèi)參基因的選擇:我們選取長(zhǎng)牡蠣常用5個(gè)的內(nèi)參基因:Elongat1nfactor-1 α，β -actin, 18S rRNA, 28S rRNA和GAPDH，以及在牡蠣幼蟲發(fā)育過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因RS18和RL7，還有另外3個(gè)從牡蠣基因組中獲得的人的管家基因的同源基因SKPl，HNRP和UBCDl共10個(gè)基因作為內(nèi)參基因的候選基因。所選取的內(nèi)參基因序列(見表D
[0053]定量實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)材料:實(shí)驗(yàn)用成體健康長(zhǎng)牡販(平均殼高90mm)購(gòu)于青島膠南。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于充氣的過(guò)濾海水中，水溫維持在18°C ±1°C。溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn):120只長(zhǎng)牡蠣均分為兩組，每組60只。實(shí)驗(yàn)組60只每只注射100 μ I溶藻弧菌(5 X 17ceIlsAiL inPBS)，對(duì)照組60只每只注射100 μ IPBS0在注射后Oh, 3h，6h，12h，24h，48h，72h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每組分別隨機(jī)抽取6只牡蠣，用無(wú)菌注射器抽取血淋巴后，800g離心1min收集血細(xì)胞，重懸于TRIzol試劑中備RNA提取用。
[0054]RNA提取方法用TRIzol按照說(shuō)明書的步驟提取血細(xì)胞總RNA。
[0055]實(shí)施例2
[0056]經(jīng)過(guò)熒光定量PCR評(píng)估候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性:根據(jù)候選基因序列設(shè)計(jì)出特異的引物對(duì)(見表1)，在溶藻弧菌應(yīng)激樣品中進(jìn)行熒光定量PCR，獲得每個(gè)候選基因在各個(gè)應(yīng)激時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)數(shù)據(jù)一Ct值(threshold cycle,每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的突光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))。根據(jù)Ct值，用內(nèi)參篩選常用的GeNorm軟件計(jì)算出每個(gè)候選基因的穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越小，代表基因表達(dá)越穩(wěn)定。另外，GeNorm軟件通過(guò)成對(duì)變異系數(shù)Vn/Vn+1的分析可以確定最適合管家基因的數(shù)目。Vandesompele等建議把0.15設(shè)置為成對(duì)變異系數(shù)的閾值，高于0.15就需要再添加額外的管家基因。GeNorm的具體算法及原理參見文獻(xiàn)【Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F，Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, SpelemanF(2002)Accurate normalizat1n of real-time quantitative RT-PCR data by geometricaveraging of multiple internal controlgenes.Genome B1l3 (7):research0034.1-0034.11】。選出適合的內(nèi)參基因，組合后作為基因定量的內(nèi)參。其具體實(shí)施方案如下:
[0057]1、實(shí)驗(yàn)材料:實(shí)驗(yàn)用成體健康牡販(平均殼高90mm)購(gòu)于青島膠南。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)于充氣的過(guò)濾海水中，水溫維持在18°C ±1°C。溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn):120只牡蠣均分為兩組，每組60只，實(shí)驗(yàn)組60只每只注射100 μ I溶藻弧菌(5Χ 107cells/mL in PBS)，對(duì)照組60只每只注射100 μ I PBS。 在注射后0h，3h，6h，12h，24h，48h，72h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每組分別隨機(jī)抽取6只牡販,用無(wú)菌注射器抽取血淋巴后，800g離心1min收集血細(xì)胞,重懸于TRIzol試劑中備RNA提取用。
[0058]2、RNA提取:用TRIzol按照說(shuō)明書的步驟提取總RNA。
[0059]3、第一鏈 cDNA 的合成:用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser (Perfect Real Time)(試劑盒,市購(gòu)于TaKaRa公司)按照說(shuō)明書將步驟2獲得的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，作為熒光定量PCR模板。
[0060]I)去除基因組DNA反應(yīng)。按如下成分于冰上配制反應(yīng)混合液，
[0061]
mipH

5 X gDNA Eraser Buffer2.0 μ I
gDNA Eraser1.0 μ I
Total RNA^ lug
RNase Free dH20up tolO μ I
[0062]42°C反應(yīng)，2min，然后放置于4°C。
[0063]2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按如下成分于冰上配制20 μ I的反應(yīng)體系:
[0064]
【權(quán)利要求】
1.長(zhǎng)牡販溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)應(yīng)激實(shí)驗(yàn)突光定量?jī)?nèi)參基因，其特征在于:長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中18S rRNA內(nèi)參基因具有序列表SEQ ID No:1中堿基序列和28S rRNA內(nèi)參基因具有序列表SEQ ID No: 2中喊基序列。
2.—種權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述長(zhǎng)牡蠣基因18S rRNA與28S rRNA在長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)取樣樣品中穩(wěn)定表達(dá)(即表達(dá)量變化小)，能夠在相對(duì)定量法實(shí)時(shí)熒光定量PCR中作為內(nèi)參基因。
3.—種權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:同時(shí)使用兩個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因作為雙基因內(nèi)參；雙基因內(nèi)參的表達(dá)量Ct值為18S rRNA和28S rRNA基因在長(zhǎng)牡蠣溶藻弧菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量Ct值的算術(shù)平均數(shù)，通過(guò)以上雙基因內(nèi)參校正實(shí)驗(yàn)誤差，能夠提聞實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
4.一種權(quán)利要求1所述內(nèi)參基因的特異性引物，其特征在于:所用內(nèi)參基因 18S rRNA的特異性引物為:
18S-F:5， -TTGGTTTTCGGAACACGAGGTAAT-3，
18S-R:5’ -TGCTTGGCAAATGCTTTCGCTG-3’ ， 28S rRNA特異性引物為:
28S-F:5， -AAGGGCAGGAAAAGAAACTAAC-3，，
28S-R:5’ -GTTTCCCTCTAAGTGGTTTCAC-3’。
【文檔編號(hào)】C12R1/63GK104031914SQ201410217710
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】黃寶玉, 張琳琳, 李莉, 張國(guó)范 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所