一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途，該抗氧化膠原肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly（SEQIDNo:1），ESI-MS檢測給出分子量為631.70Da（[M+H]+632.49Da）。制備時(shí)以大黃魚魚鱗作為原料，按固液比1g:10~15mL加入2~3%鹽酸處理20~24h，過濾除去鹽酸后按照固液比1g:10~15mL加入0.08~0.10mol/LNaOH處理20~24h，過濾，蒸餾水洗至pH6.5~7.5，30~35℃干燥后用粉碎機(jī)粉碎；取魚鱗粉末，按照料液比1g:8~10mL加入甘氨酸-NaOH緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.0~10.0，最后將酶解液加熱到90~95℃滅活5~10min，再依次經(jīng)離心、超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。本發(fā)明制備工藝科學(xué)合理，酶解過程易于監(jiān)控，制得的抗氧化膠原肽具有活性強(qiáng)、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等應(yīng)用。
【專利說明】一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種魚類抗氧化物質(zhì)及其制備方法和用途，尤其涉及一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的組成部分，維持著皮膚和組織器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，是修復(fù)各損傷組織的重要原料物質(zhì)，也是使身體保持年輕、防止老化的物質(zhì)。魚鱗中含有大量的膠原蛋白，與其他膠原蛋白相比，魚鱗膠原蛋白易分解，容易被消化、吸收，有較高的利用價(jià)值。
[0003]魚鱗膠原蛋白在酸、堿、熱、酶的作用下水解，會(huì)產(chǎn)生魚鱗膠原肽，外用可阻止陽光對皮膚的直接傷害，內(nèi)服可預(yù)防游離基對皮膚的摧毀，具有良好的抗紫外損傷和抗氧化功效，已被應(yīng)用于各種營養(yǎng)保健食品及化妝品中。
[0004]但是， 申請人:發(fā)現(xiàn)，以大黃魚魚鱗為原料,利用酶解技術(shù)制備大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的工藝研究處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性魚鱗抗氧化膠原肽及其應(yīng)用更是未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽，該抗氧化膠原肽安全無毒副作用，抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收，可清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的制備方法，該工藝科學(xué)合理、易操作。
[0007]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明為解決上述第一個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽，其特征在于該抗氧化膠原肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQID No:1), ES1-MS 檢測給出分子量為 m/z 631.70 Da ([M+H] + 632.49 Da)。
[0009]本發(fā)明為解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)將大黃魚魚鱗用自來水洗凈，按照固液比I g:l(Tl5mL加入2~3%鹽酸處理2(T24h，過濾除去鹽酸后，按照固液比I g: 10~15 mL加入0.08~0.10 mol/L NaOH處理20~24 h ;過濾，蒸餾水洗至pH 6.5^7.5，30-35 1:干燥后用粉碎機(jī)粉碎。
[0010]2)取粉碎后魚鱗粉末，按照料液比I g:8~10 mL加入緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.0~10.0，于 45~50°C保溫 5-10 min;
3)按照魚鱗質(zhì)量的1.5~2.0%加入堿性蛋白酶，于45飛(TC溫度下酶解4飛h，將酶解液加熱到90~95°C滅活5~10 min, 4500~5000 r/min離心10~15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。[0011]作為優(yōu)選，步驟2)中的緩沖液為pH為10的甘氨酸-NaOH緩沖液。
[0012]作為優(yōu)選，步驟3)中的蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力> 1.8 X IO6 U/g。
[0013]作為改進(jìn)，步驟3)的超濾和層析的具體過程為:
超濾:將上清液調(diào)至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作壓力和20~25 V的工作溫度下采用分子量I kDa的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液；將上述離子交換層析酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)。
[0014]優(yōu)選，陰離子交換樹脂為DEAE-52 cellulose，凝膠為葡聚糖凝膠G_15。
[0015]再優(yōu)選，反相高效液相色譜條件為:進(jìn)樣量19~21 μ g ;色譜柱為Kromasil C18 ;柱溫為30 0C ;流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:(T35 min乙腈濃度從O至50% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
[0016]本發(fā)明為解決上述第三個(gè)技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的應(yīng)用，其特征在于 Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)對 DPPH自由基、羥基自由基、ABT S自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)具有抗氧化活性強(qiáng)、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑進(jìn)行應(yīng)用。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明選用堿性蛋白酶作為酶解用酶，通過生物酶解法同時(shí)融合超濾分級和色譜精制，酶解過程易監(jiān)控，同時(shí)制得的膠原肽具有較高的抗氧化活性；與化學(xué)合成的抗氧化劑相比較，本發(fā)明制得的抗氧化膠原肽具有抗氧化活性強(qiáng)、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明的陰離子交換樹脂DEAE-52 cellulose層析圖；
圖2是本發(fā)明的陰離子交換樹脂DEAE-52 cellulose層析所分離各組分的羥基自由基清除活性圖；
圖3是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15層析圖；
圖4是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15層析所分離各組分的羥基自由基清除活性圖；
圖5是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物(F23)的RP-HPLC圖；
圖6是本發(fā)明的Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)的反相高效液相色譜(RP-HPLC)；
圖 7 是本發(fā)明的 Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly(SEQ ID No:1)的高分辨質(zhì)譜(ES1-MS)圖和結(jié)構(gòu)式。【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0020]一種大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽肽的制備方法，制備工藝流程如下:大黃魚魚鱗〃脫鈣、去除非膠原蛋白"酶解"酶解物"超濾"離子交換層析"凝膠過濾層析"高效液相色譜制備"抗氧化膠原肽。
[0021]實(shí)施例1:1)將大黃魚魚鱗用自來水洗凈，按照固液比I g: 10 mL加入2.5%鹽酸處理24 h，過濾除去鹽酸后按照固液比I g: 15 mL加入0.10 mol/L NaOH處理24 h ;過濾,蒸懼水洗至pH 7.0,35 1:干燥后用粉碎機(jī)粉碎。
[0022]2)取粉碎后魚鱗粉末，按照料液比I g: 10 mL加入甘氨酸-NaOH緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至 9.5,于 45°C保溫 10 min;
3)按照魚鱗質(zhì)量1.5%加入堿性蛋白酶(酶活力≤1.8X106U/g)，于45 °C溫度下酶解5 h，將酶解液加熱到95 °C滅活10 min, 4500 r/min離心15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
[0023]①超濾:將酶解上清液調(diào)至pH 7.0，于0.12 MPa的工作壓力和25 V的工作溫度下采用分子量I kDa的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液；
②DEAE-52cellulose陰離子交換層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成10 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液(F2)(圖1)
③凝膠層析:將上述離子交換層析酶解液(F2)用雙蒸水配成10mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物(F23)(圖2)
④高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物(F23)用雙蒸水配成50μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化(條件:進(jìn)樣量20 μ g ;色譜柱為Kromasil C18(250 mm X 4.6 mm, 5 μ m);柱溫為室溫；流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0-35 min乙腈濃度從O至50% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm,根據(jù)抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化肽(見圖3)。
[0024]⑤結(jié)構(gòu)檢測:收集羥基自由基清除活性最高的I個(gè)抗氧化肽經(jīng)檢測為單一峰(見圖4)，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Gly-PiO-Thr-Gly-Phe-PiO-Gly (SEQID No:1)，ES1-MS 檢測給出分子量為 m/z 631.70 Da ([M+H]+ 632.49 Da)(見圖 5)。
[0025]將上述制得的大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ IDNo:1)進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)、ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)、超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)和脂質(zhì)過氧化抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly(SEQ ID No:1)對 DPPH 自由基(EC50 0.83 mg/mL)、羥基自由基(EC5tl 0.25 mg/mL)、ABTS(EC50 0.34 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC50 0.15 mg/mL)具有良好的清除作用；同時(shí)，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。
[0026]最后，尚需注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所 有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種大黃魚魚鱗蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽的氨基酸序列為Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)，分子量為 m/z 631.70 Da。
2.—種權(quán)利要求1所述的大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將大黃魚魚鱗用自來水洗凈，按照固液比Ig:l(Tl5mL加入2~3%鹽酸處理2(T24h，過濾除去鹽酸后按照固液比I g: 10~15 mL加入0.08~0.lmol/L NaOH處理20~24 h ;過濾，蒸餾水洗至pH 6.5^7.5，3(T35 °C干燥后用粉碎機(jī)粉碎； 2)取粉碎后魚鱗粉末，按照料液比Ig: 8~10 mL加入緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至9.0~10.0，于45~50 °C保溫5~10 min ； 3)按照魚鱗質(zhì)量1.5~2.0%加入蛋白酶，于45飛O °C溫度下酶解4飛h，將酶解液加熱到90~95°C滅活5~10 min, 4500~5000 r/min離心10~15 min,取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的緩沖液為pH為10的甘氨酸-NaOH緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力≥1.8 X IO6U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要 求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為: 超濾:將上清液調(diào)至pH 6.5~7.5，于0.10~0.15 MPa的工作壓力和20~25 1:的工作溫度下采用分子量I kDa的超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液； 層析:將上述超濾酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解液；將上述離子交換層析酶解液用雙蒸水配成8~10 mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，羥基自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用羥基配成45飛5 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化，根據(jù)抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化肽Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換樹脂為DEAE-52cellulose，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15 ;所述反相高效液相色譜條件為:進(jìn)樣量19~21μ g ;色譜柱為Kromasil C18 ;柱溫為室溫；流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈；梯度洗脫:0~35 min乙腈濃度從O至50% ;洗脫速度1.0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
7.一種權(quán)利要求1所述的大黃魚魚鱗抗氧化膠原肽的應(yīng)用，其特征在于Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ ID No:1)對 DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS 自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly (SEQ IDNo:1)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用；Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro_Gly(SEQ ID No:1)具有抗氧化活性強(qiáng)、易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品和食品添加劑上應(yīng)用。
【文檔編號】A23L1/305GK103992386SQ201410218199
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】遲長鳳, 王斌, 陳蔭, 胡發(fā)遠(yuǎn) 申請人:浙江海洋學(xué)院