一種小核菌胞外多糖的提取分離方法
【專利摘要】一種小核菌胞外多糖的提取分離方法，屬于多糖提取分離【技術(shù)領(lǐng)域】。其首先是使發(fā)酵液透過微濾膜，除去菌絲；再向濾過清液中加入硫酸銨，磁力攪拌靜置鹽析，然后加蒸餾水使多糖上懸溶解稀釋，將溶解液轉(zhuǎn)移至分子量為100～120KDa的透析袋中透析；再收集透析袋中的多糖溶液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至7～9，加入無水乙醇，靜置醇沉得到小核菌胞外多糖；最后用少量乙醚清洗后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，低溫冷凍干燥后得較高純度的小核菌胞外多糖。本發(fā)明實現(xiàn)了在較小能耗、較少有機溶劑、較少花費的情況下，分離提取高純度小核菌多糖。該發(fā)明具有很強的應(yīng)用性，是目前分離提取高純度小核菌多糖的最優(yōu)化方法。
【專利說明】—種小核菌胞外多糖的提取分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于多糖提取分離【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及小核菌胞外多糖的提取分離方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]真菌多糖是從真菌的子實體、菌絲體和真菌發(fā)酵液中分離出來的一類具有廣泛生物活性的大分子碳水化合物。研究發(fā)現(xiàn)，真菌多糖在許多工業(yè)領(lǐng)域如食品、材料等方面都具有廣泛的應(yīng)用價值，顯示出比動、植物多糖更為廣闊的應(yīng)用前景。醫(yī)學(xué)研究表明，真菌多糖具有提高免疫力、抗腫瘤、降血糖、降血脂、延緩衰老等生理功效。
[0003]小核菌多糖(Scleroglucan)是由小核菌屬(Sclerotium rolfsii)的一些絲狀真菌合成分泌的微生物多糖，其結(jié)構(gòu)為三螺旋結(jié)構(gòu)，主鏈?zhǔn)怯搔?-D-(I — 3)-吡喃葡萄糖基單元組成，每三個單元有一個(1 — 6)鍵連接的β-D-吡喃葡萄糖基[1]。一般來說，該多糖的平均分子質(zhì)量為(1.4~5.4) X IO6Da氣
[0004]小核菌多糖最初應(yīng)用在石油開采中，其作用主要體現(xiàn)在以下3個方面:潤滑鉆頭，增加較稀油漿的粘稠度，增加海水壓力，便于石油開采。小核菌多糖溶液可以耐受高溫、較廣范圍的PH及多種電解質(zhì)，在石油開采上顯示出比黃原膠更好的穩(wěn)定性[3，4，5]。
[0005]近年來，小核菌多糖良好的溶解性、兼容性和流變性使其越來越受食品行業(yè)者的青睞。目前小核菌多糖作為食品增稠劑已應(yīng)用于食品中[6]。研究發(fā)現(xiàn)，小核菌多糖比其他有抗腫瘤活性的胞外多糖顯示出更好的抗腫瘤活性及抗菌活性[7]。
[0006]目前，小核菌多糖 的提取方法主要是將高溫水浴后的發(fā)酵液高速離心除菌絲，然后醇沉得粗多糖，再用Sevag法去除蛋白，活性炭脫色，過層析柱得較高純度的小核菌多糖[8]。以上方法，不僅操作復(fù)雜，步驟繁瑣，且成本較高，使用的儀器價格昂貴，多糖中易存在有機試劑殘留，不適合快速大量生產(chǎn)純度較高的小核菌多糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種工藝簡單、可靠、成本低又能得到較高純度小核菌胞外多糖的提取方法。
[0008]各培養(yǎng)基成分及配制方法:
[0009]PDA斜面培養(yǎng)基(IL):馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水溶解，自然pH。
[0010]種子培養(yǎng)基(IL):葡萄糖30.0g, NaN0s3.0g，酵母浸粉 1.0g, K2HPO4L Og,MgSO4.7Η200.25g, KC10.5g,蒸餾水溶解，I ~3M HCl 溶液調(diào)節(jié) pH 至 4.5 ~5.0。
[0011]發(fā)酵培養(yǎng)基(IL):玉米黃漿(吉林省黃龍食品工業(yè)有限公司提供)50mL,玉米淀粉35g，K2HPO4L 0g, MgSO4.7Η200.25g，KC10.5g，NaN0s3.0g,檸檬酸 0.4g，蒸餾水溶解，I ~3MHCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.5~5.0。
[0012](I)菌種活化:將小核菌(4°C條件下石蠟封存的)接種于121°C滅菌的PDA斜面培養(yǎng)基上，25~30°C條件下恒溫培養(yǎng)2~3d。
[0013](2)種子培養(yǎng)液制備:向PDA斜面培養(yǎng)基中注入適量無菌水，邊注入邊沖洗斜面，得到小核菌菌懸液；將菌懸液按7~10%的接種量接入經(jīng)121°C滅菌的種子培養(yǎng)基中，搖勻；在溫度為25~30°C、攪拌速度為180~230rmp的條件下振蕩培養(yǎng)2~3d。
[0014](3)發(fā)酵液制備:按6~10%的接種量向經(jīng)121°C滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子培養(yǎng)液，在溫度為25~30°C、攪拌速率為180~230rmp、通氣量為2~5L/min條件下培養(yǎng)3~7d，得小核菌發(fā)酵液。
[0015]小核菌胞外多糖的提取方法:
[0016](1)將0.45~1.2μπι孔徑的微濾膜平鋪在微濾器濾篩上，將發(fā)酵液倒入微濾器中，密封微濾器；通過外部連接的空氣壓縮機對發(fā)酵液液面施壓(0.2~0.4MPa)，收集濾過清液；
[0017](2)向步驟⑴得到的濾過清液中加入濾過清液質(zhì)量35~40%的硫酸銨，攪拌使硫酸銨完全溶解，3~8°C條件下靜置鹽析8~12h，多糖上懸，回收硫酸銨；
[0018](3)取步驟(2)鹽析后的多糖，加0.5~2倍體積的蒸餾水使其溶解，將溶解液轉(zhuǎn)移至分子量為100~120KDa的透析袋中，密封透析袋，將透析袋置于蒸餾水中，2~10°C透析2~5d，從而除去多糖中的離子等雜質(zhì)；
[0019](4)收集透析袋中的多糖溶液，將其pH調(diào)節(jié)至7~9，加入無水乙醇，使無水乙醇體積濃度為50~70%，2~10°C條件下靜置醇沉10~20h，所得沉淀用水溶解后在50~60°C條件下減壓蒸發(fā)濃縮； [0020](5)將步驟(4)獲得的濃縮液在-50~_40°C條件下低溫冷凍干燥，從而得白色海綿狀或粉末狀小核菌胞外多糖。
[0021]本發(fā)明所述的小核菌為羅耳阿太菌(Athelia roffsii)或齊整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0023]本發(fā)明實現(xiàn)了在較小能耗、較少有機溶劑、較少花費的情況下，分離提取高純度小核菌多糖。該發(fā)明具有很強的應(yīng)用性，是目前分離提取高純度小核菌多糖的最優(yōu)化方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1:本發(fā)明實施例1獲得的羅耳阿太菌胞外多糖溶液的紫外吸收圖譜；
[0025]羅耳阿太菌胞外多糖紫外吸收圖譜顯示羅耳阿太菌胞外多糖在197nm處具有單一峰，且在280nm處無明顯雜峰出現(xiàn)，表明本發(fā)明提取的多糖物質(zhì)純度較高，無蛋白等雜質(zhì)。經(jīng)蒽酮一硫酸法及熒光法測得提取的多糖樣品中羅耳阿太菌胞外多糖純度高于85%。
[0026]圖2:多糖熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0027]實施例1
[0028]其步驟如下:
[0029](I)獲取小核菌發(fā)酵液:
[0030]各培養(yǎng)基成分及配制方法:
[0031]PDA斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂2g，蒸餾水lOOmL，自然pH。
[0032]種子培養(yǎng)基:葡萄糖9g，NaNO30.9g，酵母浸粉0.3g，K2HPO40.3g，MgSO4.7H200.075g, KC10.15g，用蒸餾水溶解，配制成300mL種子培養(yǎng)基，用2M HCl溶液調(diào)節(jié)pH至4.5。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米黃漿150mL,玉米淀粉 105g, Κ2ΗΡ043.0g, MgSO4.7Η200.75g，KCl 1.5g，NaN039.0g，檸檬酸1.2g，用蒸餾水溶解，配制成3L發(fā)酵培養(yǎng)基，2M HCl溶液調(diào)節(jié)pH 至 4.5。
[0034](I)菌種活化:將4 °C條件下石臘封存的羅耳阿太菌[9] (Athelia roffsiiAY6657741,保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵實驗室)接種于滅菌后的3管PDA斜面培養(yǎng)基上，29°C條件下恒溫培養(yǎng)2d。
[0035](2)種子培養(yǎng)液制備:向活化后的PDA斜面培養(yǎng)基中注入若干毫升無菌水，邊注入邊沖洗斜面，得到菌懸液，放入經(jīng)121°C滅菌20min的300mL種子培養(yǎng)基中，搖勻，29°C，200rmp振蕩培養(yǎng)3d。
[0036](3)發(fā)酵液制備:向5L發(fā)酵罐中加入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，降溫至29°C，加入270mL種子培養(yǎng) 液，在29°C、通氣量為2L/min，攪拌速率180rmp的條件下培養(yǎng)
3.5d，得到羅耳阿太菌發(fā)酵液。
[0037]羅耳阿太菌胞外多糖的提取，其步驟如下:
[0038](I)將0.8 μ m孔徑的混合纖維素酯微濾膜平鋪在微濾器的濾篩上，固定；將羅耳阿太菌發(fā)酵液倒入微濾器中，密封微濾器；通過外部連接的空氣壓縮機對發(fā)酵液液面施加
0.4Mpa的大氣壓，使發(fā)酵液透過微濾膜，除去菌絲，收集濾過清液；
[0039](2)向IL濾過清液中加入350g的硫酸銨，攪拌使硫酸銨完全溶解，4°C條件下靜置鹽析12h，多糖上懸，部分蛋白沉降，回收硫酸銨；
[0040](3)取鹽析后的上懸多糖，加I倍體積的蒸餾水使其溶解，將溶解液轉(zhuǎn)移至分子量為IOOKDa的透析袋中，密封透析袋，將透析袋置于蒸餾水中，40C條件下，透析3d，期間換5次水。
[0041](4)收集透析袋中的羅耳阿太菌多糖溶液，用0.25M的NaOH溶液調(diào)節(jié)其pH至
7.5，加入無水乙醇，使無水乙醇體積濃度為70%，4°C靜置醇沉12h，所得沉淀用水溶解后在50°C條件下減壓蒸發(fā)濃縮；
[0042](5)將濃縮液置于-50°C條件下低溫冷凍干燥，得白色海綿狀羅耳阿太菌胞外多糖。
[0043]羅耳阿太菌胞外多糖純度的測定，其步驟如下:
[0044](I)羅耳阿太菌胞外多糖濃度-熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0045]配制濃度為10.601g/L的NaOH溶液，pH值為13.5。用pH值為13.5的NaOH溶液配制lmg/mL的羅耳阿太菌胞外多糖標(biāo)準(zhǔn)品(購自英國Dextra公司)溶液。室溫條件下，磁力攪拌0.5h。
[0046]分別取0，0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5，4mLlmg/mL的上述羅耳阿太菌胞外多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用10.601g/L的NaOH溶液(pH為13.5)分別補足5mL，配制成濃度為0，0.1，0.2，
0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/mL的羅耳阿太菌胞外多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長366nm處測各濃度羅耳阿太菌胞外多糖溶液的熒光強度值。以多糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)，繪制羅耳阿太菌胞外多糖濃度-熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。得到下列擬合公式:[0047]y = 31.155x(R2 = 0.9990);其中，
[0048]y—焚光強度；
[0049]X一多糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度，mg/mL。
[0050](2)發(fā)酵獲得多糖樣品中羅耳阿太菌胞外多糖的純度測定。
[0051]取本發(fā)明上述步驟提取的羅耳阿太菌胞外多糖，用10.601g/L的NaOH溶液(pH為13.5)配制成0.4mg/mL的多糖樣品溶液，室溫條件下，磁力攪拌0.5h。在激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長366mn處測其熒光強度值。根據(jù)擬合公式y(tǒng) = 31.155x(R2 = 0.9990)計算出樣品糖液中羅耳阿太菌胞外多糖的濃度，從而獲得樣品糖液羅耳阿太菌胞外多糖的純度。
[0052]經(jīng)熒光法測得該多糖樣品中羅耳阿太菌胞外多糖純度為85.41%。紫外全波長掃描發(fā)現(xiàn)該多糖在197mn處有單一峰出現(xiàn)，且無明顯雜峰，說明該多糖純度較高。再經(jīng)蒽酮一硫酸法測(公知的測試方法)得該多糖樣品中羅耳阿太菌胞外多糖純度為85.23%。
[0053]參考文獻[0054][I] G.Brigand:Scleroglucan.1n:1ndustrial Gums, Academic Press, NewYork, USA (1993) pp.461 - 472.[0055][2] J.1.Farina, F.Sineriz，0.E.Molina，N.1.Perotti，Isolation andphysicochemical characterization of soluble scleroglucan from Sclerotiumrolfsi1- Rheological properties,molecular weight and conformationalcharacteristics, Carbohydr.Polym.44(2001)41 - 50.[0056][3] B.McNeil，L.M.Harvey, Viscous fermentation products, Cr it.Rev.Biotechnol.13(1993)275 - 304.[0057][4] S.A.Williams, Enhanced oil recovery.US patent3，373，810 (1968).[0058][5]G.Holzworthj Xanthan and scleroglucan:Structure and use in enhancedoil recovery, Dev.1nd.Microbiol.26 (1985) 271 - 280.[0059][6]S.A.SURVASE et al.Fermentative Production of Scleroglucan[J].FoodTechno 1.Biotechnol, 2007，45 (2): 107 - 118.[0060][7] P.P.Singh, R.L.Wislerj R.Tokuzenj W.Nakahara，Scleroglucan, ananti tumor polysaccharide from Sclerotium glucanicum，Carbohydr.Res.37(1974)245 - 247.[0061][8]Griffith WLj Compere A LDev Int J Biol Micromolj 1987 ；9:153-157.[0062][9]金蘋，高曉余.白絹病的研究[J].農(nóng)業(yè)病蟲害研究，2011，I (I):14-22.
【權(quán)利要求】
1.一種小核菌胞外多糖的提取方法，其步驟如下: (1)將0.45~1.2μπι孔徑的微濾膜平鋪在微濾器濾篩上，將發(fā)酵液倒入微濾器中，密封微濾器；通過外部連接的空氣壓縮機對發(fā)酵液液面施壓，收集濾過清液； (2)向步驟(1)得到的濾過清液中加入濾過清液質(zhì)量35~40%的硫酸銨，攪拌使硫酸銨完全溶解，3~8°C條件下靜置鹽析8~12h，多糖上懸，回收硫酸銨； (3)取步驟(2)鹽析后的多糖，加0.5~2倍體積的蒸餾水使其溶解，將溶解液轉(zhuǎn)移至分子量為100~120KDa的透析袋中，密封透析袋，將透析袋置于蒸餾水中，2~10°C透析2~5d，從而除去多糖中的離子等雜質(zhì)； (4)收集透析袋中的多糖溶液，將其pH調(diào)節(jié)至7~9，加入無水乙醇，使無水乙醇體積濃度為50~70%，2~10°C條件下靜置醇沉10~20h，所得沉淀用水溶解后在50~60°C條件下減壓蒸發(fā)濃縮； (5)將步驟(4)獲得的濃縮液在-50~-40°C條件下低溫冷凍干燥，從而得白色海綿狀或粉末狀小核菌胞外多糖。
2.如權(quán)利要求1所述的一種小核菌胞外多糖的提取方法，其特征在于:小核菌發(fā)酵液由如下步驟制備得到， (1)菌種活化:將小核菌接種于121°C滅菌的PDA斜面培養(yǎng)基上，25~30°C條件下恒溫培養(yǎng)2~3d。 (2)種子培養(yǎng)液制備:向PDA斜面培養(yǎng)基中注入適量無菌水，邊注入邊沖洗斜面，得到小核菌菌懸液；將菌懸液按7~10%的接種量接入經(jīng)121°C滅菌的種子培養(yǎng)基中，搖勻；在溫度為25~30°C、攪拌速度為180~230rmp的條件下振蕩培養(yǎng)2~3d。 (3)發(fā)酵液制備:按6~10%的接種量向經(jīng)121°C滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入種子培養(yǎng)液，在溫度為25~30°C、攪拌速率為180~230rmp、通氣量為2~5L/min條件下培養(yǎng)3~7d，得小核菌發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求1~2任一項所述的一種小核菌胞外多糖的提取方法,其特征在于:小核菌為羅耳阿太菌(Athelia roffsii)或齊整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc)。
【文檔編號】C12R1/645GK103951762SQ201410222584
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】李鴻梅, 魏明, 趙慧 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)