一種用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株，該菌株命名為草酸青霉(Penicillium?oxalicum)M3QΔ15A，已于2014年4月25日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC?No.9092。本發(fā)明還公開了所述菌株在生產(chǎn)絲狀真菌蛋白中的應(yīng)用。實驗證實利用本發(fā)明提供的工程菌在表達草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI上，分泌背景低，與用草酸青霉菌株Δ15A表達宿主相比，本發(fā)明的草酸青霉M3QΔ15A宿主表達蛋白量高，運用廉價淀粉作為碳源生產(chǎn)蛋白時，生產(chǎn)成本低，周期短，具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種在淀粉上具有低胞外分泌蛋白背景的工程菌株，尤其涉及一種用
于提高絲狀真菌蛋白表達的宿主菌-草酸青霉菌(Penicillium oxalicum),屬于基因工
程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白表達系統(tǒng)是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現(xiàn)外源基因在宿主中表達的目的。表達蛋白的宿主即表達蛋白的生物體，可以為細菌、酵母、植物細胞、動物細胞等。由于各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。異源表達絲狀真菌的蛋白尤其是糖苷水解酶類最常用的表達系統(tǒng)有原核蛋白表達系統(tǒng)和畢赤酵母蛋白表達系統(tǒng)。
[0003]原核蛋白表達系統(tǒng)以大腸桿菌表達系統(tǒng)為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產(chǎn)物分離純化相對簡單等優(yōu)點，缺點主要是蛋白質(zhì)翻譯后缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。酵母蛋白表達系統(tǒng)以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達量高，可誘導(dǎo)，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實現(xiàn)高密度發(fā)酵等優(yōu)點 。缺點為部分蛋白產(chǎn)物易降解，表達量不可控，在表達絲狀真菌蛋白時過度糖基化現(xiàn)象常見。
[0004]目前，絲狀真菌表達宿主主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)的突變株Axyr，因其缺失了一個主要的纖維素酶正調(diào)控因子，導(dǎo)致纖維素酶不能被誘導(dǎo)產(chǎn)生并分泌到胞外，從而在葡萄糖上培養(yǎng)時形成了一個低蛋白分泌背景，利于異源表達得到較純的目標蛋白，但是里氏木霉生長較慢，在PDA培養(yǎng)基上需要約7天才能完成生孢(Uzbas etal.2012.A homologous production system for Trichoderma reesei secreted proteinsin a cellulase-free background.Appl Microbiol Biotechnol 93(4):1601-1608)。由于絲狀真菌蛋白的研究需要適合的表達宿主，而目前可供選擇的表達宿主又很少，僅有的里氏木霉突變株Axyr生長緩慢，從而限制了很多目標蛋白的表達，進而影響我們對一些蛋白的相關(guān)研究以及商業(yè)應(yīng)用，因而構(gòu)建一個生長快，可利用廉價底物淀粉，且具有低的胞外蛋白分泌背景的表達宿主有著重要的理論和現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的問題是，針對絲狀真菌蛋白表達尤其是糖苷水解酶表達中存在的上述問題，提供一種能夠以較廉價底物淀粉為碳源，快速生長且產(chǎn)生低胞外蛋白分泌背景的用于提高絲狀真菌蛋白表達的宿主菌——草酸青霉菌菌株。
[0006]本發(fā)明所述的用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于:所述菌株命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A,該菌株已于2014年4月25日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC N0.9092。
[0007]上述用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株在10%的麩皮汁固體培養(yǎng)基上生長約四天完成生孢，孢子顏色比出發(fā)株稍淺，在淀粉上生長時胞外分泌少量蛋白。
[0008]本發(fā)明所述用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株的構(gòu)建方法，步驟是:
[0009](I) PGA3持續(xù)性激活菌株構(gòu)建:
[0010]以pUC_Mpga3為模板，在突變的pga3編碼區(qū)設(shè)計特異引物MG3-F:和MG3-R:進行PCR擴增出核苷酸序列如SEQ ID N0.28所示的突變后的pga3 (具體是將氨基酸序列第208位的谷氨酰氨突變成亮氨酸:Q208L ;也即堿基序列上的CAG突變成CTA);然后從GenBank: KC695878所示全基因克隆pga3基因編碼區(qū)的下游區(qū)，以及篩選標記ptrA基因序列(硫胺吡啶抗性基因)，利用Double-joint PCR方法融合成pga3持續(xù)性激活型重組片段，然后通過制備原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將pga3持續(xù)性激活型重組片段轉(zhuǎn)入到草酸青霉菌株CGMCC N0.5302 ；pga3持續(xù)性激活型重組片段兩端的同源臂與基因組上的原目的基因Pga3相對應(yīng)的同源序列發(fā)生雙交換重組，使突變的pga3基因?qū)⒈驹吹幕虻木幋a區(qū)置換下來，得到Pga3持續(xù)性激活型重組菌株草酸青霉，命名為草酸青霉M3Q，其基因型為:pga3 (P)::pga3Q208L::ptrA ；
[0011](2) Amy 15A 基因的敲除:
[0012]設(shè)計帶有amyl5A基因序列(GenBank:EPS34453)同源臂的和篩選標記bar (草胺磷抗性基因)的重組片段；然后通過制備原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將該amyl5A敲除盒重組片段轉(zhuǎn)入到草酸青霉重組菌株M3Q中，amyl5A敲除盒兩端的同源臂與基因組上的目的基因amyl5A相對應(yīng)的同源序列發(fā)生雙交換重組，使抗性基因bar將原有的基因的編碼區(qū)置換下來，得到在草酸青霉M3Q中敲除amyl5A基因同時pga3持續(xù)性激活的重組菌株，該菌株命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A,其基因型為:Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA0
[0013]本發(fā)明所述用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株在生產(chǎn)絲狀真菌蛋白中的應(yīng)用。
[0014]其中，上述的應(yīng)用中優(yōu)選是將草酸青霉纖維素外切酶CBHI基因在所述草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A 中過表達獲得名為草酸青霉 M3Q Δ 15A-Pamy-CBHI 菌株，以實現(xiàn)高效表達絲狀真菌蛋白。其具體方法是:
[0015](I)以草酸青霉 CGMCC N0.5302 基因組為模板，克隆 amyl5A(GenBank:EPS34453)編碼區(qū)上游啟動子序列以及cbhl (GenBank:ACV95805)基因的編碼區(qū)與終止子區(qū)，以及篩選標記hph基因序列(潮霉素抗性基因)利用Double-joint PCR方法融合成cbhl過表達盒重組片段，將cbhl過表達盒轉(zhuǎn)入到草酸青霉菌株M3QA 15A以及只敲除amy15A基因的草酸青霉菌株Λ 15Α中，獲得轉(zhuǎn)化子CBHI的過表達菌株，命名為草酸青霉M3QA 15A-Pamy-CBHI以及 Δ 15A-Pamy-CBHI,其基因型為(amyl5A(p):: cbhl::hph_ Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA)以及(amyl5A (p):: cbhl::hph- Δ amyl5A::bar)。
[0016](2)菌種選擇:選工程菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A(CGMCCN0.9092) ;M3QA 15A-Pamy-CBHI。 [0017](3)平板培養(yǎng):將上述工程菌草酸青霉M3QA 15A和M3Q Λ 15A_Pamy-CBHI菌種接種于含有質(zhì)量百分比為1.5~2.0%的瓊脂的固體基本培養(yǎng)基平板上，30°C條件下，靜置培養(yǎng) 48h ；[0018](4)種子培養(yǎng):將步驟⑶培養(yǎng)的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)接I~2環(huán)分生孢子于100毫升并加有2% (質(zhì)量百分比)葡萄糖為碳源的液體基本培養(yǎng)基中，30°C條件下，150~250轉(zhuǎn)/分鐘，pH5.0~5.8，搖床振蕩培養(yǎng)16~24小時，制得種子液；
[0019](5)產(chǎn)酶培養(yǎng):以質(zhì)量體積比為10%的接種量，將步驟(4)的種子液接種于100毫升并加有終濃度2%淀粉為碳源的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，pH5.0~5.8，30°C條件下，150~250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24~96h，制得發(fā)酵培養(yǎng)菌液；
[0020](6)收集發(fā)酵培養(yǎng)菌液:發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在8，000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集上清液，分別取上清液跑蛋白電泳膠(SDS-PAGE)分析蛋白條帶；
[0021]上述的應(yīng)用中，步驟(4)、(5)中所述振蕩培養(yǎng)，優(yōu)選220轉(zhuǎn)/分鐘。
[0022]上述的應(yīng)用中，步驟(5)所述的振蕩培養(yǎng)，優(yōu)選培養(yǎng)時間為48小時。
[0023]上述的應(yīng)用中，步驟(5)所述的pH優(yōu)選為pH5.6。
[0024]本發(fā)明應(yīng)用生物工程技術(shù)獲得并公開了草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ15A ( Δ amyl5A: :bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA)工程菌株(CGMCC N0.9092)，實驗證實利用本發(fā)明提供的工程菌在表達草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI上，分泌背景低，與用草酸青霉菌株Λ 15A表達宿主相比，M3QA15A宿主表達蛋白量高，運用廉價淀粉作為碳源生產(chǎn)蛋白時，生產(chǎn)成本低，本發(fā)明提供的工程菌生產(chǎn)目標蛋白周期較短，具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng)用前
旦
-5^ O
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]本發(fā)明提供的菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QA 15A,已于2014年4月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101，其保藏編號為CGMCC N0.9092。
[0026]圖1使用本發(fā)明宿主菌以及在本宿主中表達蛋白CBHI在淀粉上的發(fā)酵液上清25 μ I進行蛋白電泳膠分析(SDS-PAGE)電泳圖
[0027]其中:(Α)草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI在114 Λ 15Α (在草酸青霉114-2中缺失了淀粉酶Amyl5A的菌株)上過表達后胞外蛋白電泳條帶；(B)草酸青霉外切葡聚糖酶CBHI在宿主菌(M3QA15A)過表達后胞外蛋白電泳條帶。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0029]一般性說明:
[0030]微生物來源
[0031]實施例中的出發(fā)菌株草酸青霉(Penicillium oxalicum)CGMCC N0.5302是 申請人:課題組先前專利申請時保藏的菌株，該菌株已于2011年9月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。 申請人:課題組于2013年公布了草酸青霉基因組序列(Liu, G., et al.2013.Genomic and secretomic analyses reveal uniquefeatures of the lignoceIlulolyticenzyme system of Penicillium decumbens.PLoSOne, 8 (2), e55185.)。
[0032]培養(yǎng)基
[0033]所述基本培養(yǎng)基(Vogel，s)鹽組分(IL)=Na3Citrate.2H20, 125g，KH2PO4, 250g,NH4NO3, 100gjMgSO4.7Η20，IOg, CaCl2.2Η20，5g，微量元素溶液 5ml，生物素溶液 2.5ml, 121。。滅菌30min。
[0034]所述微量元素溶液(100ml):Citric acid.H20,5g, ZnSO4.7H205g,Fe (NH4) 2 (SO4) 2.6H20 lg, CuSO4.5H20 0.25g, MnSO4.H2O 0.05g, H3BO3 0.05g, Na2MoO4.2H200.05g。
[0035]所述生物素溶液:5.0mg溶于50ml無菌水中。
[0036]所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基中加2%的葡萄糖為碳源，IM D-山梨醇為原生質(zhì)體的滲透壓穩(wěn)定劑。基本培養(yǎng)基中根據(jù)轉(zhuǎn)化外源片段遺傳篩選標記基因的不同，分別加入終濃度200ug/ml的潮霉素B(EMRESC0，產(chǎn)品編號2012C098，抗性基因hph)、終濃度300ng/ml的硫胺吡唳(Sigma,產(chǎn)品編號P0256,抗性基因ptra)或終濃度1.6mg/ml的草胺磷(PESTANAL，產(chǎn)品編號 278-636-5，抗性基因 bar)，115°C滅菌 30min，pH5.6。
[0037]所述分單孢培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基中加2%的葡萄糖為碳源，根據(jù)轉(zhuǎn)化外源片段中遺傳篩選標記基因的不同，分別加入終濃度200 μ g/ml的潮霉素B (hph)、終濃度300ng/ml的硫胺吡唳(ptra)或終濃度1.6mg/ml的草胺磷(bar), 115°C滅菌30min, pH5.6。
[0038]所述發(fā)酵產(chǎn)酶培 養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基鹽組分中，添加2%的淀粉為碳源，pH5.6。
[0039]硫胺吡啶溶液配制:用無菌水配制100 μ g/ml的硫胺吡啶母液。
[0040]草胺磷溶液:用無菌水配制10%的草胺磷母液。
[0041]洗分生孢子生理鹽水:0.9%的NaCl和0.05 %的吐溫-80水溶液，121 °C滅菌30mino
[0042]pUC-Mpga3質(zhì)粒由中國上海生工生物有限公司合成。含有突變的pga3編碼序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.28所示。
[0043]pME2892質(zhì)粒釆用如下論文中記載的方法制備(Krappmann，S et al.2005.Deletion and allelic exchange of the Aspergillus fumigatus veA locus via a novelrecyclable marker module.Eukaryot Cell，4(7)，1298-307.)。
[0044]pSilent-1質(zhì)粒釆用如下論文中記載的方法制備(Nakayashiki，H et al.2005.RNA silencing as a tool for exploring gene function in ascomycete fung1.FungalGenetics and Biology，42 (4)，275-283.)。
[0045]pUC-bar質(zhì)粒釆用如下論文中記載的方法制備(Luo，Z.et al.2013.Ablation of the creA regulator results in amino acid toxicity, temperaturesensitivity,pleiotropic effects on cellular development and loss of virulencein the filamentous fungus Beauveria bassiana.Environ Microbiol.)。
[0046]草酸青霉染色體DNA大量提取:
[0047](I)將草酸青霉I X IO6數(shù)量的分生孢子接種于100mL的Vogel’ s鹽基本培養(yǎng)基中，碳源為2%的葡萄糖，200rpm, 30°C培養(yǎng)48h。
[0048](2)將菌懸液用真空抽濾泵除去培養(yǎng)基，并用0.09M NaCl溶液洗滌一次，轉(zhuǎn)移抽干的菌絲體至研缽中，加液氮冷凍并將菌絲體研磨至粉末狀。
[0049](3)把菌絲體粉末以質(zhì)量體積比1: 5(菌絲重:抽提液)加入到抽提液緩沖液(200mM Tris-HCl、pH8.5，250mM NaCl,25mM EDTA,2% SDS)中，混勻，65°C保溫 30min。
[0050](4)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25: 24: I)溶液至樣品中，顛倒混勻，12, OOOrpm 室溫離心 lOmin。
[0051](5)緩慢吸取上層水相至另一離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，顛倒混勻，_20°C放置 20min, 12, OOOrpm, 4°C, IOmin,收集沉淀。
[0052](6)以70%乙醇洗滌沉淀一次，12，OOOrpm，2min，然后，真空干燥，用適量ddH20完全溶解沉淀。
[0053](7)加入終濃度 0.1 μ g/ μ I 的 RNAase, 37°C溫育 Ih0
[0054](8)再加入等體積苯酹/氯仿抽提一次，12，OOOrpm, 20min。
[0055](9)將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加0.1倍體積3M NaAc (pH4.8)和0.6倍體積異丙醇，于 _20°C放置 20min，12，OOOrpm, 4°C，IOmin,收集沉淀。
[0056](10)加70%乙醇，洗滌一次，待乙醇揮發(fā)完全，用適量ddH20溶解，制得草酸青霉基因組DNA。
[0057]實施例1、草酸青霉PGA3基因持續(xù)性激活菌株的構(gòu)建
[0058](I)草酸青霉pga3突變編碼區(qū)片段的克隆
[0059]以pUC_Mpga3為模板，在突變的pga3編碼區(qū)設(shè)計特異引物MG3-F:和MG3-R:進行PCR擴增，獲得片段1，引物序列如下:
[0060]上游引物
[0061]MG3-F:
[0062]5， -CTCATCTTCATCGCATCCCAA-3’
[0063]下游引物
[0064]MG3-R:
[0065]5， -AATGGGATCCCGTAATCAATTGCCCTCGGGAGGAAGACAAGAAGG-3，。
[0066](2)草酸青霉pga3下游同源臂的克隆
[0067]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設(shè)計引物MG3-3F和MG3-3R進行PCR擴增，獲得片段2，引物序列如下:
[0068]上游引物
[0069]MG3-3F
[0070]5， -CAAGAGCGGCTCATCGTCACCCCATTCCTCTTCCGCACGATGATT-3’
[0071]下游引物=MG3-3R:
[0072]5， -GAAGACGGGAGGGACCATAGT-3，。
[0073](3)PGA3基因持 續(xù)性激活表達盒篩選標記ptra序列的擴增
[0074]篩選標記表達盒的構(gòu)建以質(zhì)粒pME2892為模板，設(shè)計引物PtraFl和PtraRl，PCR擴增制得片段3，引物序列如下:
[0075]上游引物PtraFl: 5 ’ -GGGCAATTGATTACGGGATC-3 ’
[0076]下游引物PtraRl: 5’ -ATGGGGTGACGATGAGCCGC-3，。
[0077](4) PGA3基因持續(xù)性激活表達盒pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA的擴增[0078]將上述(I)、⑵和(3)步驟中PCR擴增出的片段1、片段2和片段3以摩爾比1:2:1混合并作為融合PCR反應(yīng)的模板(50 μ I融合PCR反應(yīng)體系中，模板總添加量不超過500ng)，獲得融合PCR產(chǎn)物4。融合PCR條件為:94°C，90s，12個循環(huán)(94°C，30s，58°C，10min，72°C 3min)，72°C lOmin，然后將上述PCR產(chǎn)物4稀釋20倍后作為模板，設(shè)計引物MG3-NF和MG3-NR進行PCR擴增，獲得PGA3基因持續(xù)性激活表達盒片段(其核苷酸序列如SEQ ID N0.25所示)，引物序列如下:
[0079]上游弓丨物:MG3-NF:5 ’ -TTCCTAACACAGTGAAGGCTGCGGC-3 ’
[0080]下游引物:MG3-NR:5，-CATCAATCACTCCTGTCTATCCCAT-3，
[0081](5)PGA3基因持續(xù)性激活表達盒轉(zhuǎn)化草酸青霉菌株
[0082](I)草酸青霉菌株(菌種保藏號=CGMCC N0.5302)原生質(zhì)體的制備
[0083]①取新鮮生孢的草酸青霉平板或斜面，用無菌的生理鹽水(0.9% NaCl10.05%Tween)，將分生孢子洗下，制備草酸青霉分生孢子懸液。
[0084]②在Vogel’s基本培養(yǎng)基(2%葡萄糖為碳源)平板上蓋一層玻璃紙，并用玻璃棒鋪平，在玻璃紙上加入50-100 μ I孢子懸液，涂布均勻。做8-10個同樣處理，30°C培養(yǎng)約
12-15h。
[0085]③加0.1g 裂解酶(Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum, Sigma 產(chǎn)品編號 L1412)到 20ml 溶液 I 中(1.2M sorbitol, 0.1M KH2PO4, ρΗ5.6)，輕輕搖均，并用 0.2 μ m濾器過濾除菌到培養(yǎng)皿 或試管中。
[0086]④吸取2_3ml裂解酶溶液到無菌培養(yǎng)皿中，在溶液表面覆蓋一層長有草酸青霉菌體的玻璃紙，然后再加2-3ml裂解酶液，按此順序依次疊放6-7層，在兩層玻璃紙之間不能留存大的氣泡。放置培養(yǎng)皿于30 V培養(yǎng)箱中，為使酶液在培養(yǎng)皿中分布均勻，酶解期間可輕輕晃動培養(yǎng)皿1-2次。
[0087]⑤酶解約90min后，用鑷子挑取玻璃紙，用移液槍吸取溶液沖掉玻璃紙上殘留的菌絲體，大的菌絲團塊可用移液槍(槍尖剪掉)緩慢吹打。
[0088]⑥準備帶有玻璃棉的漏斗，并滴加數(shù)滴溶液I到玻璃棉使其緊貼漏斗內(nèi)壁。用玻璃棉漏斗過濾原生質(zhì)體懸液到50ml離心管中，并置于冰上,然后用數(shù)毫升溶液I沖洗玻璃棉，過濾液的總體積不超過35ml。利用水平轉(zhuǎn)子2000rpm,4°C離心10min后，小心棄掉上清液，并用 4ml 冰冷的溶液 2(1M sorbitol 18.22g ；50mmol/L CaCl2 ；10mM/L TrisHCl，pH7.5)重懸原生質(zhì)體，然后離心4°C，2000rpm,離心10min，小心棄掉上清液，并用0.5-1.0ml冰冷的溶液2重懸原生質(zhì)體，置原生質(zhì)體懸液于冰上。
[0089]⑦原生質(zhì)體的質(zhì)量控制(顯微鏡觀察):a、在載玻片上滴加3 μ I原生質(zhì)體懸液，在蓋玻片旁滴加3μ I無菌水，原生質(zhì)體細胞內(nèi)因滲透壓高于細胞外水的滲透壓吸水脹裂，而分生孢子則不受影響山、通過血球計數(shù)板小室計算原生質(zhì)體數(shù)量(幾個小格即可)。原生質(zhì)體終濃度應(yīng)大于108，如果原生質(zhì)體數(shù)量太高，可用溶液2稀釋到5X108。z = nX (400/f) X IO5, η =原生質(zhì)體計數(shù)數(shù)量，f =計數(shù)的小格數(shù)量。
[0090](II)草酸青霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
[0091]①在200 μ I草酸青霉原生質(zhì)體懸液中加入不超過10 μ I的質(zhì)粒PTClrB和50 μ IPEG 溶液(25% PEG6000，50mmol/L CaCl2,10mmol/L TrisHCl，ρΗ7.5)，混勻轉(zhuǎn)化體系，并在冰上放置20min。轉(zhuǎn)化用DNA片段應(yīng)純化，DNA濃度應(yīng)不少于I μ g/ μ I。[0092]②加2ml PEG (室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，然后加入4ml溶液2，輕輕混勻。
[0093]③吸取0.2-lml轉(zhuǎn)化體系混合液到4ml預(yù)保溫(55°C )的上層轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，輕輕混勻，并立即倒入鋪有下層轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的平板上，等培養(yǎng)基凝固后，置30°C培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的上、下層均加有終濃度300ng/ml的硫胺吡啶作為篩選轉(zhuǎn)化子的抗性試劑。
[0094]④在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4天后，用接種針挑取轉(zhuǎn)化子到分單孢培養(yǎng)基，分單孢培養(yǎng)基中加入終濃度300ng/ml的硫胺吡啶作為轉(zhuǎn)化子的篩選試劑，30°C培養(yǎng)2_3天，長出分生孢子，用無菌的生理鹽水將分生孢子洗下，制成孢子懸液，并將其在含有Triton-XlOO的分單孢培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，以消除轉(zhuǎn)化子異核體的影響，獲得PGA3持續(xù)性激活的重組草酸青霉，命名為草酸青霉M3Q(pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA)。
[0095]實施例2、草酸青霉amyl5A啟動子及編碼基因的敲除
[0096](I)草酸青霉」amyl5A::bar敲除盒上游同源臂片段的克隆
[0097]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板,設(shè)計特異引物amyl5A_F和amyl5Abar_R進行PCR擴增amyl5A啟動子上游同源臂片段1，引物序列如下:
[0098]上游引物amy 15A-F: 5 ’ -CAGCATCCAATGGACGTTCA-3 ’
[0099]下游引物
[0100]amy 15Abar-R: 5，-GCCTGTAAGCGAATTAGCAAGCGTCCAAAGTTTCCTTGGCAGCGT-3，。
[0101](2)草酸青霉」 amyl5A::bar敲除盒下游同源臂片段的克隆
[0102]以上述一般性說明中的方法提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設(shè)計特異引物amyl5Abar-F和amyl5A_R進行PCR擴增amyl5A編碼基因敲除盒下游同源臂片段2，引物序列如下:
[0103]上游引物
[0104]amy 15Abar_F: 5，-GCAAGAGAGGGCAGCAAGCCAGTGCTCTCGGCTCGTCCTTTCG-3，
[0105]下游引物amy 15A-R: 5，-AATCGTGTTCGCACCCTCT-3，。
[0106](3) Zl amy 15A:: bar敲除盒遺傳轉(zhuǎn)化篩選標記表達盒bar序列的擴增
[0107]以質(zhì)粒pUC-bar為模板，設(shè)計引物Bar-F和Bar-R進行PCR擴增，獲得篩選標記表達盒片段3，引物序列如下:
[0108]上游引物Bar-F: 5，-GACGCTTGCTAATTCGCTTAC-3 ’
[0109]下游引物Bar-R: 5，-GCACTGGCTTGCTGCCCTC-3，。
[0110]⑷amyl5A敲除盒序列的擴增
[0111]將實施例2中上述(I)、⑵和(3)步驟PCR擴增出的片段1、片段2和片段3以摩爾比1: 2: I混合并作為融合PCR反應(yīng)的模板(50ul融合PCR反應(yīng)體系中，模板總添加量不超過500ng)，獲得融合PCR產(chǎn)物4，將PCR產(chǎn)物4稀釋20倍后作為模板，設(shè)計引物amyl5A-NF和amyl5A-NR進行特異性擴增,獲得Zl amyl5A::bar敲除盒片段(其核苷酸序列如SEQ ID N0.26所示)，引物序列如下:
[0112]上游引物:amy15A-NF: 5，-TTGTTGGTGAATGCCCGAGGAGAT-3 ’
[0113]下游引物:amy15A-NR: 5，-TCCCGTGAAAAGTCTAACGAAGC-3，。
[0114](5)草酸青霉重組菌株M3Q原生質(zhì)體的制備
[0115]amyl5A的敲除以實施例1中構(gòu)建的重組草酸青霉菌株M3Q為出發(fā)菌株，該菌株原生質(zhì)體的制備方法根據(jù)實施例1中草酸青霉出發(fā)菌株(CGMCC N0.5302)原生質(zhì)體的制備方法執(zhí)行。
[0116](6) Zl amyl5A::bar敲除盒片段的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
[0117]①在200 μ I草酸青霉ClrB過表達菌株M3Q原生質(zhì)體懸液中加入不超過10 μ I的 Z amyl5A::bar 敲除盒和 50 μ I PEG 溶液(25 % PEG6000, 50mmol/L CaCl2,1OmmoI/LTrisHCl，pH7.5)，混勻轉(zhuǎn)化體系，并在冰上放置20min。轉(zhuǎn)化用DNA片段應(yīng)純化，DNA濃度應(yīng)不少于I μ g/μ I。
[0118]②加2ml PEG (室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，然后加入4ml溶液2，輕輕混勻。
[0119]③吸取0.2-lml轉(zhuǎn)化體系混合液到4ml預(yù)保溫(55°C )的上層選擇培養(yǎng)基中，輕輕混勻，并立即倒入鋪有下層培養(yǎng)基的平板上，等培養(yǎng)基凝固后，置30°C培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)化的上、下層培養(yǎng)基中均加入終濃度1.6mg/ml的草胺磷作為篩選試劑。
[0120]④在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4d后，用接種針挑取轉(zhuǎn)化子到分單孢培養(yǎng)基，分單孢培養(yǎng)基中加入終濃度1.6mg/ml的草胺磷作為轉(zhuǎn)化子的篩選試劑，30°C培養(yǎng)2_3天，長出分生孢子，用無菌的生理鹽水將分生孢子洗下，制成孢子懸液，并將其在含有Triton-XlOO的分單孢培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，以消除轉(zhuǎn)化子異核體的影響，獲得PGA3過表達同時敲除amyl5A基因的重組草酸青霉,命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QA 15A(基因型為 Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA)。
[0121]上述草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Λ 15A已于2014年4月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101，其保藏編號為CGMCC N0.9092。
[0122]實施例3、草酸青霉纖維素外切酶CBHI基因在草酸青霉M3QA 15Α的過表達
[0123](I)草酸青霉amyl5A(p)::cbhl::hph過表達盒上游啟動子片段的克隆
[0124]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，設(shè)計特異引物P15A-F和P15ACBH-R進行PCR擴增CBHI過表達盒的上游啟動子片段1，引物序列如下:
[0125]上游引物P15A-F: 5 ’ -AGTCCCAGATCGCTTGTGACA-3 ’
[0126]下游引物P15ACBH-R:
[0127]5，-GTAGGAGATGGAACCCTTCATCTTTGGTAGACAGTTGAAAGTGTCG-3，。
[0128](2)草酸青霉CBHI編碼區(qū)及終子區(qū)片段的克隆
[0129]以提取到的草酸青霉基因組DNA為模板，在CBHI編碼區(qū)及終子區(qū)設(shè)計特異引物CBH1-F和CBH1-R進行PCR擴增，獲得片段1，引物序列如下:
[0130]上游引物
[0131 ] CBH1-F: 5，-ATGAAGGGTTCCATCTCCTAC-3，
[0132]下游引物
[0133]CBH1-R:5’ -CCTGAGCCCTGATTGACTTTC-3’
[0134](3)草酸青霉CBHI過表達盒遺傳轉(zhuǎn)化篩選標記表達盒序列的擴增
[0135]以質(zhì)粒PSlient-l為模板，設(shè)計引物Hphs-cbhF和Hphs-R進行PCR擴增，獲得篩選標記hph表達盒片段3，引物序列如下:
[0136]上游引物
[0137]Cbh-hphF: 5，-GAAAGTCAATCAGGGCTCAGGCGACCTTAACTGATATTGAA-3，
[0138]下游引物Hphs-R: 5 ’ -CAACCCAGGGCTGGTGACGG-3 ’。[0139](4)草酸青霉CBHI過表達盒序列的擴增
[0140] 將實施例3中上述(I)、⑵和(3)步驟PCR擴增出的片段1、片段2和片段3以摩爾比1: 2: I混合并作為融合PCR反應(yīng)的模板(50ul融合PCR反應(yīng)體系中，模板總添加量不超過500ng)，獲得融合PCR產(chǎn)物4，將PCR產(chǎn)物4稀釋20倍后作為模板，設(shè)計引物bgl2-F2和bgl2-R2進行特異性擴增,獲得amyl5A(p)::cbhl::hph過表達盒片段(其核苷酸序列如SEQ ID N0.27所示)，引物序列如下:
[0141 ]上游引物:P15A-NF: 5，-CTATCACAGTCTTCCCACATCCA-3，
[0142]下游引物:Hphs-NR:5’ -CAACCCAGGGCTGGTGACGG-3’。
[0143](5)草酸青霉重組菌株M3QA 15A原生質(zhì)體的制備
[0144]bgl2的敲除以實施例2中構(gòu)建的重組草酸青霉菌株M3Q Λ 15A為出發(fā)菌株，該菌株原生質(zhì)體的制備方法根據(jù)實施例1中草酸青霉出發(fā)菌株(CGMCC N0.5302)原生質(zhì)體的制備方法執(zhí)行。
[0145](6)amyl5A (p)::cbhl::hph過表達盒片段的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
[0146]①在200μ I重組草酸青霉菌株M3QA15A原生質(zhì)體懸液中加入不超過10 μ I的 amyl5A(p):: cbhl::hph 敲除盒片段和 50 μ I PEG 溶液(25 % PEG6000, SOmmoI /L CaCl2,1OmmoI/L TrisHCl, pH7.5)，混勻轉(zhuǎn)化體系，并在冰上放置20min。轉(zhuǎn)化用amyl5A(p)::cbhl::hph敲除盒片段應(yīng)純化,DNA濃度應(yīng)不少于1μ g/μ I。
[0147]②加2ml PEG(室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，然后加入4ml溶液2，輕輕混勻。
[0148]③吸取0.2-lml轉(zhuǎn)化體系混合液到4ml預(yù)保溫(55°C )的上層轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，輕輕混勻，并立即倒入鋪有下層轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的平板上，等培養(yǎng)基凝固后，置30°C培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的上、下層均加有終濃度200ug/ml的潮霉素B作為篩選轉(zhuǎn)化子的抗性試劑。
[0149]④在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4天后，用接種針挑取轉(zhuǎn)化子到分單孢培養(yǎng)基，分單孢培養(yǎng)基中加入終濃度200ug/ml的潮霉素B作為轉(zhuǎn)化子的篩選試劑，30°C培養(yǎng)2_3天，長出分生孢子，用無菌的生理鹽水將分生孢子洗下，制成孢子懸液，并將其在含有Triton-XlOO的分單孢培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，以消除轉(zhuǎn)化子異核體的影響，獲得CBHI過表達菌株為一例提高絲狀真菌蛋白表達量且低背景的草酸青霉菌株，命名為草酸青霉M3Q Δ 15A_Pamy-CBHI,其基因型為(amyl5A(p):: cbhl::hph- Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA)。
[0150]實施例4草酸青霉CBHI在M3Q Δ 15A表達的SDS-PAGE驗證
[0151](I)草酸青霉纖維素外切酶CBHI表達的驗證
[0152]將草酸青霉出發(fā)菌株M3QA 15A(CGMCC N0.9092)以及草酸青霉CBH過表達菌株M3Q Λ 15A-Pamy-CBHI，接種于基本培養(yǎng)基(50ml)，碳源為2%葡萄糖，200rpm, 3 (TC培養(yǎng)24h，分別制備出發(fā)菌株M3QA15A(CGMCC N0.9092)以及草酸青霉CBH過表達菌株M3QA15A-Pamy-CBHI種子培養(yǎng)液，然后將種子液中菌絲真空抽濾，各稱取0.5g的濕菌絲體轉(zhuǎn)接到裝有100ml2%淀粉為碳源培養(yǎng)基的三角瓶中，200rpm，30°C培養(yǎng)72h，分別取菌體培養(yǎng)液樣品，然后將所獲取的每個時間點的樣品1000Orpm離心5min，吸取樣品上清液25ul，然后在制備好的12.5%蛋白分離膠上上樣。首先以90V電壓跑30min，然后140V電壓直至上樣buffer跑出分離膠底部。結(jié)果見圖1。
[0153]本發(fā)明應(yīng)用生物工程技術(shù)獲得并公開了草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QΔ 15Α,其基因型為:Aamyl5A::bar_pga3(p)::pga3Q208L::ptrA,該工程菌株保藏編號為CGMCC N0.9092，上述實驗證實其在產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件下蛋白表達量明顯提高，并且背景較低，且生產(chǎn)周期較短(縮短48~96h)，可以應(yīng)用于絲狀真菌蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，具有良好的工業(yè)開發(fā)和應(yīng) 用前景。
【權(quán)利要求】
1.一種用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株，其特征在于:所述菌株命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3Q Δ 15A,該菌株已于2014年4月25日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC N0.9092。
2.權(quán)利要求1所述用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株的構(gòu)建方法，步驟是: (1)PGA3持續(xù)性激活菌株構(gòu)建: 以草酸青霉CGMCC N0.5302基因組為模板，從質(zhì)粒上克隆合成的核苷酸序列如SEQ IDN0.28所示的突變后pga3 ;然后從GenBank:KC695878所示全基因克隆pga3基因編碼區(qū)的下游區(qū)，以及篩選標記PtrA基因序列,利用Double-joint PCR方法融合成pga3持續(xù)性激活型重組片段，然后通過制備 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將Pga3持續(xù)性激活型重組片段轉(zhuǎn)入到草酸青霉菌株CGMCC N0.5302 ；pga3持續(xù)性激活型重組片段兩端的同源臂與基因組上的目的基因原來Pga3相對應(yīng)的同源序列發(fā)生雙交換重組，使突變的pga3基因?qū)⒈驹吹幕虻木幋a區(qū)置換下來，得到pga3持續(xù)性激活型重組菌株草酸青霉，命名為草酸青霉M3Q，其基因型為:pga3(p)::pga3Q208L::ptrA ； ⑵Amy 15A基因的敲除: 設(shè)計帶有amyl5A基因序列同源臂的和篩選標記bar的重組片段，然后通過制備原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將amyl5A敲除盒重組片段轉(zhuǎn)入到草酸青霉重組菌株M3Q中,amyl5A敲除盒兩端的同源臂與基因組上的目的基因amyl5A相對應(yīng)的同源序列發(fā)生雙交換重組，使抗性基因bar將原有的基因的編碼區(qū)置換下來，得到在草酸青霉M3Q中敲除amy15A基因同時pga3持續(xù)性激活的重組菌株,該菌株命名為草酸青霉(Penicillium oxalicum)M3QA 15A,其基因型為:Δ amyl5A::bar-pga3 (p)::pga3Q208L::ptrA。
3.權(quán)利要求1所述用于提高絲狀真菌蛋白表達的草酸青霉宿主菌菌株在生產(chǎn)絲狀真菌蛋白中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:將草酸青霉纖維素外切酶CBHI基因在所述草酸青霉(Penicillium oxalicum) M3Q Δ 15A中過表達獲得名為草酸青霉M3QA15A-Pamy-CBHI菌株，以實現(xiàn)高效表達絲狀真菌蛋白。
【文檔編號】C12N1/14GK103966110SQ201410222903
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】宋欣, 胡益波 申請人:山東大學(xué)