檢測乙型肝炎病毒的pcr引物、引物組、探針及其試劑盒和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測乙型肝炎病毒的PCR引物、引物組、探針及其試劑盒和檢測方法，該試劑盒含有高敏感度檢測的引物組和探針，可以檢測出單拷貝HBVDNA，在血清標本中定量檢測限可達2IU/mL，比進口試劑羅氏的COBAS更敏感；本發(fā)明的檢測方法可以檢測出世界范圍內(nèi)各種不同亞型的乙型肝炎病原體；且加入內(nèi)控系統(tǒng)，可有效防止假陰性；加入UNG酶體系，可有效避免污染；可應用于乙型肝炎的診斷、抗乙型肝炎新藥研發(fā)篩選的評價、抗乙型肝炎治療成效和復發(fā)的評估等，具有廣泛的臨床應用作用，有利于推廣應用。
【專利說明】檢測乙型肝炎病毒的PCR引物、引物組、探針及其試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒檢測領域，涉及一種檢測乙型肝炎病毒的PCR引物、引物組、探針及其試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002]乙型肝炎病毒(!fepatitis B virus, HBV)感染呈全球性分布，其感染者已超過二十億，是我國目前危害最嚴重的傳染病之一。2010年開展的全國乙肝流行病學調(diào)查顯示，我國目前仍有乙肝表面抗原攜帶者約9300萬人，乙肝和肝癌患者約占全球的四分之一。慢性HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝癌的主要原因，并且每年導致100余萬人死亡，造成極大的社會及經(jīng)濟危害。
[0003]乙肝病毒復制是慢乙肝活動的根本原因，有效的抗病毒治療可延緩疾病的進展，改善肝臟的生化學及組織學損害，降低肝硬化與肝細胞癌的發(fā)病率，降低病死率?？共《局委熓锹腋沃委熓飞系睦锍瘫?，從病原學角度控制病情的進展，使慢乙肝的治療取得巨大的進步，但仍存在療程不確定，停藥后復發(fā)等問題，其中停藥后復發(fā)是臨床上亟需解決的問題。取得e抗原血清學轉換的患者停藥后復發(fā)率較低，是最可能實現(xiàn)停藥的人群。但實際上，即使達到指南停藥標準的e抗原(+ )患者，仍有相當部分患者出現(xiàn)反彈，其機制尚不明確。有些文獻報道停藥后HBeAg血清學轉換持久率達80-90%，然而也有文獻報道停藥后復發(fā)率達70%。我國最近發(fā)表的一項研究，對拉米夫定，阿德福韋和恩替卡韋治療獲得血清學轉換后再平均治療7個月 的42名病人平均隨訪59個月，只有31%的病人能夠維持持續(xù)應答(HBeAg消失和HBV DNA < 10，OOOcp/ml)，且復發(fā)多發(fā)生于停藥半年后。如何減少停藥后復發(fā)，提高停藥后持久應答率，是臨床上十分重要的問題。
[0004]停藥時的HBV DNA水平可能是影響停藥后復發(fā)的因素之一，在臨床上可觀察到，對HBV DNA抑制能力強的藥物停藥后復發(fā)出現(xiàn)較遲，而對HBV DNA抑制作用較弱的藥物，停藥后復發(fā)出現(xiàn)較早。日本的一項研究15對22例復發(fā)的病例及11例獲得持久應答的病例進行對比，發(fā)現(xiàn)治療過程中HBV-DNA水平〈0.71ogIU/ml持續(xù)6個月以上可降低停藥后復發(fā)率。因此，采用高敏感的HBV DNA檢測方法來檢測停藥時的HBV DNA載量，并探討停藥時的HBV DNA水平對復發(fā)率的影響，有著重要的臨床意義。
[0005]目前國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院普遍采用國產(chǎn)的熒光定量PCR試劑來檢測血清HBV DNA載量，其價格便宜，但敏感性較差，檢測下限一般為100 IU/ml，對于低于此下限的HBV DNA載量不能再進一步區(qū)分，而且對于較高的HBV DNA載量，檢測準確性欠佳，檢測值往往低于實際水平。目前在國內(nèi)應用的進口試劑主要有羅氏的COBAS ampIicor及COBAS Taqman，其中COBASTaqman HBV DNA是美國FDA批準的唯——種采用Taqman技術的試管診斷自動控制技術，是慢性乙型肝炎臨床實踐指南中推薦的HBV DNA檢測方法，它具有靈敏度高、線性范圍寬、實時監(jiān)控、重復性好等優(yōu)點，檢測范圍可達20 IU/mL~1.7X108IU/mL，因其設備昂貴，檢測費用高，目前還難以在臨床廣泛應用。而且，停藥時的HBV DNA水平可能低于羅氏的試劑的檢測下限20 IU/mL。因此，目前亟需建立一種更加敏感的HBV DNA檢測方法，以指導慢乙肝的臨床治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明通過大量實驗研究篩選出高靈敏和高特異性的引物序列和檢測探針，及特定的PCR反應程序和條件，構建了高敏感PCR檢測試劑盒及檢測方法，定量檢測限可達2 IU/mL,比進口試劑羅氏COBAS HBV檢測更敏感。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供檢測乙型肝炎病毒的PCR引物。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供檢測乙型肝炎病毒的PCR引物組。
[0009]本發(fā)明的再一目的在于提供一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測方法。
[0011]本發(fā)明所采取 的技術方案是:
檢測乙型肝炎病毒的PCR引物，其引物序列為SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2, SEQ IDN0:3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ IDN0:6、SEQ ID NO:7,SEQ IDN0:8、SEQ IDN0:9SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 ;或者為該些序列的核苷酸互補序列；
上述引物的核苷酸序列分別如下所示:
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:3:TGACGCAACCCCCACTG,
SEQ ID NO:4:GCTGCGAGCAAAACAAG,
SEQ ID NO:5:GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO:6:GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC,
SEQ ID NO:7:GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG,
SEQ ID NO:8:GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT,
SEQ ID NO:9:GCTGACGCAACCCCCAC,
SEQ ID NO: 10:CGGCTGCGAGCAAAACA,
SEQ ID NO: 11:CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO: 12:CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC?
[0012]檢測乙型肝炎病毒的PCR引物組，引物組為引物組I或引物組2，其中，
引物組 I 由引物序列 SEQ ID NO: USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6組成；或者由該些序列的核苷酸互補序列組成；
引物組2 由引物序列 SEQ ID NO: 7,SEQ IDN0:8、SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12組成；或者由該些序列的核苷酸互補序列組成。
[0013]檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測探針，其序列如下所示:
SEQ ID NO: 13:CCGATCCATACTGCGGAACT,
SEQ ID NO: 14:CCGATCCATACTGCGGAAC，
SEQ ID NO: 15:GCCGATCCATACTGCGGAACT,
SEQ ID NO: 16:GCCGATCCATACTGCGGAAC ；
或者為該些序列的核苷酸互補序列；上述探針序列5’端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3’端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中一種。
[0014]一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒，該試劑盒含有上述所述的PCR檢測引物組。
[0015]進一步的，該試劑盒還含有至少I條上述所述的檢測探針。
[0016]進一步的，該試劑盒還包含內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針，其核苷酸序列分別為:
內(nèi)控引物組的核苷酸序列為:
SEQ ID NO:17:CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG,
SEQ ID NO: 18:GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG,
SEQ ID NO: 19:CCACACTGTGCCCATCTACGA,
SEQ ID NO:20:GCGCTCGGTGAGGATCTT C ；
或者為該些序列的核苷酸互補序列；
內(nèi)控探針序列的核苷酸序列為:
SEQ ID N0:21:ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT ;或者為其核苷酸互補序列。
[0017]內(nèi)控探針序列所標記的熒光基團可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于前面所述探針的熒光基團。
[0018]進一步的，該試劑盒還含有:DNA濃縮液和裂解液；內(nèi)標；PCR反應液'Taq酶和UNG酶；強陽性對照品、臨界陽性對照品及陰性對照品；陽性定量參考品。
[0019]進一步的，所述的PCR 反應液含有 15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KC1，
2.5~5mM (NH4) SO4, 2~5mM MgCl2,0.5~2mM dNTP/UTP Mix, 200~600nM引物組，100~300nM 探針，20(T600nM內(nèi)控引物，100-300ηΜ內(nèi)控探針。
[0020]一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測方法，包括以下步驟:
1)DNA提取:
取樣本、陰性質控品、臨界陽性質控品、強陽性質控品、陽性定量參考品各200ul，分別加入HBV內(nèi)標0.5ul和DNA濃縮液200ul，震蕩混勻10s, 12000rpm，離心10min，棄上清，加入DNA裂解液20ul，震蕩混勻30s，100±5°C，孵育lOmin，12000rpm離心5min，取上清即為模板DNA ；
2)PCR反應體系:
PCR反應液 43.2 μ I 5U/ul 酶 0.8 μ I lU/ul UNG 酶 0.06 μ I DNA 模板 6 μ I ;
3)PCR反應程 序:
以ΑΒΙ7500為例，第一步:37°C 5分鐘；第二步:95 V 10分鐘；第三步:95 V 15秒，62~68 V 15秒，72°C 20秒，5~15個循環(huán)；第四步:95°C 15秒，60°C I分鐘，40個循環(huán)；60°C時采集熒光；
4)結果分析:
根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，點擊Analyze進行分析,使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數(shù)值介于-1.0--0.98，然后到Plate窗口下記錄定量結果；
實驗結果需同時滿足以下質量控制，否則，本次實驗無效，需重新進行:
①HBV陰性質控品:無CT值顯示；HBV內(nèi)標檢測為陽性，且CT值<28 ；
②HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于IX IO2~I X 103IU/ml ；
③HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于IX IO5~I X 106IU/ml ；
④5個HBV定量參考品均為陽性，且線性相關系數(shù)0.98≤r≤I。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:
1)本發(fā)明的高敏感PCR檢測試劑盒可以檢測出單拷貝HBVDNA,在血清標本中定量檢測限可達2 IU/mL,比進口試劑羅氏的COBAS更敏感；
2)本發(fā)明的檢測方法可以檢測出世界范圍內(nèi)各種不同亞型的乙型肝炎病原體；
3)本發(fā)明的檢測方法加入內(nèi)控系統(tǒng)，可有效防止假陰性；
4)本發(fā)明的檢測方法加入UN G酶體系，可有效避免污染；
5)本發(fā)明技術開發(fā)的高敏感PCR檢測試劑盒及其檢測方法由于高敏感等特性,其臨床應用廣泛，可用于:①抗乙型肝炎治療成效和復發(fā)的評估；②指導抗乙型肝炎藥物治療
乙型肝炎潛伏感染診斷；④乙型肝炎病情進展包括疾病復發(fā)的評估；⑤早期乙型肝炎的診斷；⑥乙型肝炎輔助診斷；⑦抗乙型肝炎新藥研發(fā)篩選的評價；⑧新的治療乙型肝炎方法、手段的再評價。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為HBV DNA及內(nèi)控(HBV-1C)擴增圖；
圖2為實施例5的特異性實驗圖；
圖3為實施例5的靈敏度實驗圖；
圖4為線性檢測范圍內(nèi)的PCR擴增圖；
圖5為線性回歸標準曲線圖(R2=0.997)；
圖6為檢測HBV DNA陽性血漿標本(n=400例)及陰性血漿標本(n=100例)結果比較圖:左圖為羅氏COBSA HBV DNA檢測與我們開發(fā)的高敏HBV DNA檢測試劑盒定量相關性圖；右圖為不同HBV拷貝數(shù)濃度下(包括陰性標本)COBAS與高敏HBV DNA檢測試劑盒檢測陽性結果
數(shù)量；
圖7為預測抗HBV治療再停藥后復發(fā)的閾值(cut-off)為2.24 IU/ml，靈敏度和特異性分別為0.553和0.84 (R0C曲線)；
圖8為Kaplan-Meier分析圖，在HBV DNA≤2.24 IU/ml時停藥的病人復發(fā)幾率遠高于HBV DNA<2.24 IU/ml 時停藥的病人(P〈0.0001)。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此 實施例1:檢測乙型肝炎病毒的PCR引物組
本發(fā)明前期通過多種計算機程序及引物設計原則并結合我們實際經(jīng)驗情況，設計出大量檢測乙型肝炎病毒的PCR引物約80條，然后通過大量實驗研究篩選出高靈敏和高特異性的引物序列和檢測探針，最終選取檢測乙型肝炎病毒效果最佳的PCR引物組，其中包括2組，其核苷酸序列分別如下所示:
引物組1:
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:3:TGACGCAACCCCCACTG,
SEQ ID NO:4:GCTGCGAGCAAAACAAG,
SEQ ID NO:5:GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO:6:GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC,
或者為該些序列的核苷酸互補序列；
引物組2:
SEQ ID NO:7:GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG,
SEQ ID NO:8:GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT,
SEQ ID NO:9:GCTGACGCAACCCCCAC,
SEQ ID NO: 10:CGGCTGCGAGCAAAACA,
SEQ ID NO: 11:CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO: 12:CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC,
或者為該些序列的核苷酸互補序列。
[0024]實施例2:檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒 檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒包括以下成份:
1)含有實施例1中所述的引物組中的至少一組引物組；
2)檢測探針:檢測探針選自以下探針序列中的至少一種:
SEQ ID NO: 13:CCGATCCATACTGCGGAACT
SEQ ID NO: 14:CCGATCCATACTGCGGAAC
SEQ ID NO: 15:GCCGATCCATACTGCGGAACT
SEQ ID NO: 16:GCCGATCCATACTGCGGAAC ；
或者為該些序列的核苷酸互補序列；
探針序列5’端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中任意一種，探針序列3’端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中任意一種。
[0025]3)內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針，其序列分別為:
內(nèi)控引物組序列為:
SEQ ID NO:17:CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO: 18:GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO: 19:CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:20:GCGCTCGGTGAGGATCTT C ；
或者為該些序列的核苷酸互補序列；
內(nèi)控探針序列為:
SEQ ID NO: 21:ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT，或者為其核苷酸互補序列；
內(nèi)控探針序列所標記的熒光基團可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于2)中所述探針的標記熒光基團。[0026]4) PCR 反應液:含有 15~25mM Tris-HCl (ρΗ8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4) SO4,2~5mM MgCl2,0.5~2mM dNTP/UTP Mix, 200~600nM 引物組，100~300nM 探針，200~600nM 內(nèi)控引物，10(T300nM內(nèi)控探針。
[0027]5)DNA濃縮液及裂解液；內(nèi)控(為防止假陰性，內(nèi)控為陽性并保證在一定Ct值范圍內(nèi)，才表示該標本及操作過程無問題)-,Taq酶和UNG酶；強陽性對照品、臨界陽性對照品及陰性對照品；陽性定量參考品；其中，陰性對照為質粒保存液；強陽性對照品、臨界陽性及陽性定量參考品為含HBV基因序列的質粒，強陽性對照品和臨界陽性對照品的濃度分別為2E5和200 IU/ml,陽性定量參考品的濃度梯度分別為E7、E6、E5、E4JP E3 IU/ml。
[0028]實施例3:檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測方法
利用實施例2建立的檢測試劑盒，對待檢測樣品進行檢測，步驟如下:
1)DNA提取:
取待測樣本、陰性質控品、臨界陽性質控品、強陽性質控品、陽性定量參考品各200ul，分別加入內(nèi)標0.5ul和DNA濃縮液200ul，震蕩混勻1 0s，12000rpm，離心10min。棄上清，加入DNA裂解液20ul，震蕩混勻30s，100±5°C，孵育lOmin。12000rpm，離心5min ;分別取上清，獲得各樣品的模板DNA ；
2)PCR反應體系:
PCR反應液 43.2 μ I 5U/ul 酶 0.8 μ I lU/ul UNG 酶 0.06 μ I DNA 模板 6 μ I。
[0029]3) PCR反應程序為(以ΑΒΙ7500為例):
第一步:37°C 5分鐘；第二步:95 V 10分鐘；第三步:95 V 15秒，62~68 V 15秒，720C 20秒，5~15個循環(huán)；第四步:95°C 15秒，60°C I分鐘，40個循環(huán)；60 °C時采集熒光；
4)結果分析:
根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，點擊Analyze進行分析,使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數(shù)值介于-1.0--0.98。然后到Plate窗口下記錄定量結果。
[0030]質量控制
(I)HBV陰性質控品:無CT值顯示；HBV內(nèi)標檢測為陽性，且CT值< 28。
[0031](2) HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于IX IO2~IX 103IU/ml。
[0032](3) HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于I X IO5~I X 106IU/ml。
[0033](4) 5個HBV定量參考品均為陽性，且線性相關系數(shù)0.98≤r≤I。
[0034]以上要求需要在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
[0035]實施例4:
一、檢測乙型肝炎病毒的PCR試劑盒(優(yōu)先用于檢測HBV B/C亞型DNA)的建立
I)合成乙型肝炎病毒高敏感PCR檢測的引物組，其核苷酸序列分別如下所示:
引物組1:
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT,SEQ ID NO:3:TGACGCAACCCCCACTG,
SEQ ID NO:4:GCTGCGAGCAAAACAAG,
SEQ ID NO:5:GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO:6:GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC,
2)合成檢測探針,其序列為:
SEQ ID NO: 13:FAM-CCGATCCATACTGCGGAACT-MGB
3)內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針，其序列分別為:
內(nèi)控引物組
SEQ ID NO:17:CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO: 18:GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO: 19:CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:20:GCGCTCGGTGAGGATCTT C
內(nèi)控探針序列
SEQ ID NO:21:VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT-TAMRA
4)PCR 反應液:PCR 反應液含有 25mM Tris-HCl (ρΗ8.0)，25mM KCl，2.5mM (NH4) SO4, 2mMMgCl2,0.5mM dNTP/UTP Mix,引物組I中的6條引物濃度均為200nM, IOOnM探針，內(nèi)控引物中的4條引物均為200nM，IOOnM內(nèi)控探針；
5)DNA濃縮液及裂解液；內(nèi)控；酶和UNG酶；強陽性對照品、臨界陽性對照品及陰性對照品；陽性定量參考品；其中，陰性對照為質粒保存液；強陽性對照品、臨界陽性及陽性定量參考品為含HBV基因序列的質粒，強陽性對照品和臨界陽性對照品的濃度分別為2E5和200 IU/ml,陽性定量參考品的濃度梯度分別為E7、E6、E5、E4、和E3 IU/ml。
[0036]二、檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測方法(優(yōu)選為用于檢測HBV B/C亞型DNA)
利用“一”中建立的檢測試劑盒，對待檢測樣品進行檢測，步驟如下:
1)DNA提取:取待檢測的樣本，按實施例3所述的DNA提取方法進行模板DNA的提取；
2)PCR反應體系:
PCR反應液 43.2 μ I 5U/ul 酶 0.8 μ I lU/ul UNG 酶 0.06 μ I DNA 模板 6 μ I。
[0037]3) PCR反應程序為:第一步:37°C 5分鐘；第二步:95 V 10分鐘；第三步:95 V15秒，64 V 15秒，72°C 20秒，10個循環(huán)；第四步:95°C 15秒，60°C I分鐘，40個循環(huán)；60V時設置FAM和VIC熒光通道采集熒光；
4)結果分析:
根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，點擊Analyze進行 分析,使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數(shù)值介于-1.0--0.98。然后到Plate窗口下記錄定量結果。
[0038]質量控制
(I)HBV陰性質控品:無CT值顯示；HBV內(nèi)標檢測為陽性，且CT值< 28。
[0039](2) HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于I X IO2~I X 103IU/ml。[0040](3) HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于I X IO5~I X 106IU/ml。
[0041](4) 5個HBV定量參考品均為陽性，且線性相關系數(shù)0.98≤r≤I。
[0042]以上要求需要在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
[0043]本實施例中所述的檢測試劑盒和檢測方法優(yōu)選為用于檢測HBV B/C亞型DNA。
[0044]實施例5:
一、檢測乙型肝炎病毒PCR檢測試劑盒(檢測所有HBV亞型DNA)的建立
1)合成乙型肝炎病毒高敏感PCR檢測的引物組，其核苷酸序列分別如下所示:
引物組2:
SEQ ID NO:7:GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG,
SEQ ID NO:8:GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT,
SEQ ID NO:9:GCTGACGCAACCCCCAC,
SEQ ID NO: 10:CGGCTGCGAGCAAAACA,
SEQ ID NO: 11:CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO: 12:CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC,
2)合成檢測探針,其序列為:
SEQ ID NO: 13:FAM-CCGATCCATACTGCGGAACT-MGB
3)內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針，其序列分別為:
內(nèi)控引物組
SEQ ID NO:17:CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO: 18:GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG
SEQ ID NO: 19:CCACACTGTGCCCATCTACGA
SEQ ID NO:20:GCGCTCGGTGAGGATCTT C
內(nèi)控探針序列
SEQ ID NO:21:VIC-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT-TAMRA
4)PCR 反應液:含有 25mM Tris-HCl (ρΗ8.0)，25mM KCl，2.5mM (NH4) SO4, 2mM MgCl2,0.5mM dNTP/UTP Mix，引物組2中的6條引物濃度均為200nM, IOOnM探針，內(nèi)控引物中的4條引物均為200nM，IOOnM內(nèi)控探針；
5)DNA濃縮液及裂解液；內(nèi)控-,Taq酶和UNG酶；強陽性對照品、臨界陽性對照品及陰性對照品；陽性定量參考品；其中，陰性對照為質粒保存液；強陽性對照品、臨界陽性及陽性定量參考品為含HBV基因序列的質粒，強陽性對照品和臨界陽性對照品的濃度分別為2E5和200 IU/ml,陽性定量參考品的濃度梯度分別為E7、E6、E5、E4、和E3 IU/ml。
[0045]二、檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測方法(檢測所有HBV亞型DNA)
利用“一”中建立的檢測試劑盒，對待檢測樣品進行檢測，步驟如下:
1)DNA提取:取待檢測的樣本，按實施例3所述的DNA提取方法進行模板DNA的提取；
2)PCR反應體系:(請補充)
PCR反應液 43.2 μ I 5U/ul 酶 0.8 μ I lU/ul UNG 酶 0.06 μ I DNA 模板 6 μ I。[0046]3) PCR反應程序為:第一步:37°C 5分鐘；第二步:95 V 10分鐘；第三步:95 V15秒，63 - 69 V 15秒，72°C 20秒，10個循環(huán)；第四步:95°C 15秒，60°C I分鐘，40個循環(huán)；60 °C時設置FAM和VIC熒光通道采集熒光；
4)結果分析:同實施例4。
[0047]下面對本發(fā)明的PCR檢測試劑盒作進一步的效果檢測。
[0048]首先按照實施例2和3所述的試劑盒和檢測方法對HBV陽性對照品和內(nèi)控(HBV-1C)進行檢測，確認本發(fā)明的可行性，檢測結果如圖1所示，從中可以看出本發(fā)明可以對HBV的陽性對照品和定量參考品進行準確的檢測，并含有內(nèi)控(HBV 1C)，可應用于HBV的檢測。
[0049]一)特異性實驗
利用HBV不同亞型(包括A、B、C、D、E、F、G、H 8個HBV亞型)的臨床標本提取DNA，按照實施例5所述的檢測試劑盒及檢測方法對不同亞型的HBV進行檢測(每種亞型各15例，每例重復測試5次)，結果均為陽性(陽性率100%)(如圖2所示)。
[0050]同時對103例HBV臨床陰性標本進行檢測，陰性標本分別為I型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、EB病毒、細胞巨化病毒、6型單純皰疹病毒、HIV、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病病毒、人類T細胞白血病病毒I型和2型、柯薩奇病毒B3、登革熱病毒1-4以及大腸桿菌提取的核酸進行檢測，結果顯示為陰性(100%)(如圖2所示)。以上結果證明本發(fā)明方法具有很好的特異性。
[0051]另外，我們對HBV定量國家標準品中的8份陰性參考品及9份陽性參考品進行檢測。8份陰性參考品檢測符合率為8/8，9份陽性參考品符合率為9/9，即陰陽性參考品符合率為 100% (17/17)。
[0052]二)靈敏度實驗
(I)乙型肝炎病毒高敏感PCR檢測試劑盒靈敏度分析
將HBV定量國家標準品用陰性血清稀釋成系列梯度濃度(廣100 IU/ml)，采用實施例5的試劑盒及檢測方法對HBV DNA進行檢測，檢測結果如圖3所示，從中可以看出，本發(fā)明的最低檢出限可達2 IU/ml，通過多次重復檢測，在2 IU/ml濃度檢出率為96.2%。
[0053](2)檢測乙型肝炎病毒PCR檢測試劑盒的線性范圍
采用已用國家參考品標定的HBV定量標準品進行稀釋檢測，稀釋濃度由1.2X IO8IU/ml進行梯度稀釋，稀釋后的濃度分別為:1.2X108IU/ml、l.2X 107IU/ml、l.2X106IU/ml、
1.2X105IU/ml、l.2X 104IU/ml、l.2X 103IU/ml、l.2X 102IU/ml、2IU/ml ;取其檢測值及均值進行結果計算和判斷。進行數(shù)據(jù)經(jīng)可用性檢查和多項回歸分析，并經(jīng)精密度檢驗后，確定在檢測范圍內(nèi)，本試劑結果為線性。最終結果顯示線性覆蓋范圍為2~1.2X 107IU/ml (如圖4所示)，線性回歸曲線圖如圖5所示R2=0.997。
[0054](3)本發(fā)明檢測試劑盒與上市產(chǎn)品的比較(準確度及靈敏度)
利用實施例 5所述的檢測試劑盒和檢測方法監(jiān)測HBV患者(分為接受抗病毒治療、不接受抗病毒治療或中止抗病毒治療)的病毒載量。在250例HBV DNA病毒載量為2(Tl X IO7IU/ml的臨床樣本中，用實施例5的檢測方法與羅氏COBAS HBV DNA檢測系統(tǒng)進行平行檢測并對比，兩者定量結果具有良好的相關性(斜率為0.976，95% Cl為0.92 — 1.01)(圖6左)。然而，在150例接受治療后病毒載量〈20 IU/ml的患者樣本，本發(fā)明的HBV DNA PCR檢測方法檢測出134例陽性，而羅氏COBAS HBV DNA檢測僅檢測出38例陽性(圖6右)，說明本發(fā)明具有更好的靈敏度，更能確保臨床的檢出率。對100例陰性血漿標本進行本發(fā)明的HBV DNA檢測和羅氏COBAS檢測，二者均未有檢出，都具有高特異性(圖6右)。
[0055] 三)臨床應用
本發(fā)明檢測方法在評估抗病毒治療效果臨床應用的初步研究通過和中山大學第三附屬醫(yī)院合作，用本發(fā)明的HBV DNA檢測試劑，研究在停止抗病毒藥物治療時，乙型肝炎病毒感染者復發(fā)和血漿中低水平的HBV DNA載量之間的關系。在停止治療后，乙肝病毒DNA殘留量顯示復發(fā)病人組(η = 41)和不再復發(fā)病人組(η = 31)之間有顯著差異(130.4±420.90 IU/ml vs 44.6±155.16 IU/ml, P = 0.001)。分別通過 ROC 曲線方法評估顯示，停止抗病毒藥物治療時，乙型肝炎病毒DNA為2.24 IU/ml時(臨界值)，預測病人復發(fā)的敏感性為0.553，特異性為0.840 (圖7)。Kaplan-Meier分析顯示，停藥時HBVDNA≥2.24 IU/ml的病人復發(fā)幾率遠高于停藥時HBV DNA<2.24 IU/ml的病人(P〈0.0001)(圖8)。這些初步數(shù)據(jù)表明了本發(fā)明的高敏PCR在抗病毒藥物療效評估上應用可行性。這些結果提出臨床研究方案進一步研究高敏感HBV DNA檢測在抗病毒藥物療效和治愈評估上應用可行性。
【權利要求】
1.檢測乙型肝炎病毒的PCR引物，其引物序列為SEQID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ IDNO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12 ;或者為該些序列的核苷酸互補序列； 上述引物的核苷酸序列分別如下所示:
SEQ ID NO:1 GGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:2 GGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGT,
SEQ ID NO:3:TGACGCAACCCCCACTG,
SEQ ID NO:4:GCTGCGAGCAAAACAAG,
SEQ ID NO:5:GCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO:6:GTCCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGC,
SEQ ID NO:7:GCCGACAGTATCTGAACCTTTACCCCGTTG,
SEQ ID NO:8:GCAACGGTCAGGTCTGTGCCAAGTGTTT,
SEQ ID NO:9:GCTGACGCAACCCCCAC,
SEQ ID NO: 10:CGGCTGCGAGCAAAACA,
SEQ ID NO: 11:CCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCACA,
SEQ ID NO: 12:CCCGCGCAGGATCCAGTTGGCAGCAC?
2.檢測乙型肝炎病毒的PCR引物組，引物組為引物組I或引物組2，其中， 引物組 I 由引物序列 SEQ ID NO: USEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6組成；或者由該些序列的核苷酸互補序列組成； 引物組 2 由引物序列 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ IDNO: 11和SEQ ID NO: 12組成；或者由該些序列的核苷酸互補序列組成。
3.檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測探針，其序列如下所示:
SEQ ID NO: 13:CCGATCCATACTGCGGAACT,
SEQ ID NO: 14:CCGATCCATACTGCGGAAC，
SEQ ID NO: 15:GCCGATCCATACTGCGGAACT,
SEQ ID NO: 16:GCCGATCCATACTGCGGAAC ； 或者為該些序列的核苷酸互補序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測探針，其特征在于:探針序列5’端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種，探針序列3’端標記的淬滅基團為TAMRA, MGB, BHQ 中一種。
5.一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒含有權利要求2所述的PCR檢測引物組。
6.根據(jù)權利要求5所述的一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒還含有至少I條權利要求3所述的檢測探針。
7.根據(jù)權利要求5所述的一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒還包含內(nèi)控引物組和內(nèi)控探針，其核苷酸序列分別為: 內(nèi)控引物組的核苷酸序列為:
SEQ ID NO:17:CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG,
SEQ ID NO: 18:GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG,SEQ ID NO: 19:CCACACTGTGCCCATCTACGA,
SEQ ID NO:20:GCGCTCGGTGAGGATCTT C ； 或者為該些序列的核苷酸互補序列； 內(nèi)控探針序列的核苷酸序列為: SEQ ID NO:21:ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT ;或者為其核苷酸互補序列； 內(nèi)控探針序列所標記的熒光基團可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于權利要求3所述探針的熒光基團。
8.根據(jù)權利要求5所述的一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于:該試劑盒還含有=DNA濃縮液和裂解液；內(nèi)標；PCR反應液'Taq酶和UNG酶；強陽性對照品、臨界陽性對照品及陰性對照品；陽性定量參考品。
9.根據(jù)權利要求8所述的一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述的 PCR 反應液含有 15~25mM Tris-HCl (ρΗ8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4) S04，2~5mMMgCl2,0.5 ~2mM dNTP/UTP Mix，200~600nM 引物組，100~300nM 探針，200~600nM 內(nèi)控引物，10(T300nM內(nèi)控探針。
10.一種檢測乙型肝炎病毒的PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)DNA提取: 取樣本、陰性質控品、臨界陽性質控品、強陽性質控品、陽性定量參考品各200ul，分別加入HBV內(nèi)標0.5ul和DNA濃縮液200ul，震蕩混勻10s, 12000rpm，離心10min，棄上清，加入DNA裂解液20ul，震蕩混勻30s，100±5°C，孵育lOmin，12000rpm離心5min，取上清即為模板DNA ； 2)PCR反應體系: PCR反應液 43.2 μ I 5U/ul 酶 0.8 μ I lU/ul UNG 酶 0.06 μ I DNA 模板 6 μ I ; 3)PCR反應程序: 以ΑΒΙ7500為例，第一步:37°C 5分鐘；第二步:95 V 10分鐘；第三步:95 V 15秒，63~69 V 15秒，72°C 20秒，5~15個循環(huán)；第四步:95°C 15秒，60°C I分鐘，40個循環(huán)；60°C時采集熒光； 4)結果分析: 根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，點擊Analyze進行分析,使Std curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即correlation數(shù)值介于-l.0'0.98，然后到Plate窗口下記錄定量結果； 實驗結果需同時滿足以下質量控制，否則，本次實驗無效，需重新進行: ①HBV陰性質控品:無CT值顯示；HBV內(nèi)標檢測為陽性，且CT值<28 ； ②HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于IX IO2~I X 103IU/ml ； ③HBV臨界陽性質控品:檢測濃度值介于IX IO5~I X 106IU/ml ； ④5個HBV定量參考品均為陽性，且線性相關系數(shù)0.98≤r≤I。
【文檔編號】C12Q1/68GK104004856SQ201410223058
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權日:2014年5月20日
【發(fā)明者】朱托夫 申請人:廣州海力特生物科技有限公司