一株草甸山岡單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株草甸山岡單胞菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的草甸山崗單胞菌(Collimonas?pratensis)，其菌株號為JZB120004，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC?No.9193。草甸山崗單胞菌(Collimonas?pratensis)JZB120004為革蘭氏陰性桿菌，好氧菌；適宜生長溫度為20-28℃，25℃生長最好，4℃下能緩慢生長，37℃以上不能生長，僅對桃褐腐病褐有抑制作用。草甸山崗單胞菌(Collimonas?pratensis)JZB120004繁殖速度快，能夠人工培養(yǎng)，可用于用于防治桃褐腐病，還可生產(chǎn)低溫蛋白酶。
【專利說明】—株草甸山岡單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】中一種微生物及其應(yīng)用，特別涉及一株作為桃褐腐病生防菌的草甸山岡單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]由鏈核盤菌(Moni I inia spp.)引起的褐腐病是桃生產(chǎn)中最重要的病害之一，也是世界范圍內(nèi)核果類最重要的采后病害(Sisquella M, Casals C，VifiasI, et al.Combination of peracetic acid and hot water treatment to controlpostharvest brown rot on peaches and nectarines ；Postharvest Biology andTechnology, 2013, 83:1-8 ；Giobbe S, Marceddu S,Scherm B, et al.The strange case of abiofilm-forming strain of Pichia fermentans, which controls Monilinia brown rot onapple but is pathogenic on peach fruit ；FEMS Yeast Res., 2007, 7 (8): 1389-1398.Hou DY, Yan C Q, Liu H X, et al.Berberine as a natural compound inhibits the development ofbrown rot fungus Monilinia fructicola.Crop Protection, 2010, 29:979-984)。在歐洲地中海地區(qū)，褐腐病由核果鏈核盤菌(M.1axa)和果生鏈核盤菌(M.fructigena)引起，在澳大利亞、南非和美洲的病原為美澳型核果鏈核盤菌(M.fructicola),后者在歐洲被列為檢疫對象(Larena I, Torres R, De Cal A, et al.Biological control of postharvest brownrot (Moni I inia spp.) of peaches by field applications of Epicoccum nigrum.BiologicalControl, 2005, 32:305-310)。此病在采前、采后及貯藏運輸期均可造成大量減產(chǎn)，采后尤為嚴(yán)重，在歐美損失高達(dá)59% -90%。我國桃產(chǎn)量在1000萬噸以上，為僅次于蘋果的第二大水果，桃褐腐病在16個省(區(qū))有記載發(fā)生，是桃的重要病害之一，如素有“中國桃鄉(xiāng)”之稱的北京市平谷區(qū)近年褐腐病已成為桃外銷產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大障礙。調(diào)查表明，北京地區(qū)此病的主要病原是美澳型核果鏈核盤菌，可致貯藏庫果實年損失近1/4，出庫后爛果率高達(dá)84.6%- 100%。
[0003]迄今化學(xué)防治仍是控制褐腐病的主要手段，近年桃褐腐病菌已對生產(chǎn)上常用的苯并咪唑類(Bzl S)、二甲酞亞胺類(DCFs)及甾醇脫甲基化酶抑制劑類(DMIs)殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性(Holb I J, Schnabel S.Differential effect of triazoles on mycelial growth anddisease measurements of Monilinia fructicola isolates with reduced sensitivity toDMI fungicides.Crop Prot.，2007，26(5): 753-759)，使此病害的防治受到了極大的威脅；此外，由于化學(xué)殺菌劑存在環(huán)境污染、食品安全等諸多問題，在歐洲桃主產(chǎn)區(qū)采后病害的防治早已嚴(yán)禁使用任何類型的化學(xué)農(nóng)藥；我國近年也提出了綠色防控的植保理念和示范區(qū)建設(shè)規(guī)劃，并在全國建立了北京平谷等24個果樹綠色防控示范區(qū)。開發(fā)安全、環(huán)保的替代產(chǎn)品已成為全球的熱點。微生物制劑具有靶標(biāo)特異性強(qiáng)、對人畜安全、環(huán)境兼容性好等優(yōu)勢，是一類理想的替代產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供對桃褐腐病菌有特異性抑制作用且能夠產(chǎn)生低溫蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸酯酶和嗜鐵素的山崗單胞菌。
[0005]本發(fā)明所提供的山崗單胞菌是草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis),其菌株號為JZB120004，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.9193。
[0006]本發(fā)明所提供的草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的16SrDNA序列如SEQ ID N0.3所示，為革蘭氏陰性桿菌，好氧菌；產(chǎn)蛋白酶、氧化酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸酯酶和嗜鐵素，未檢測到纖維素酶；適宜生長溫度為20-28°C，25°C生長最好，4°C下能緩慢生長，37°C以上不能生長。將草甸山崗單胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004與該屬模式菌株C.fungivorans CCUG48868T、C.arenae CCUG54727T、C.pratensisCCUG54728T的碳源代謝比較結(jié)果顯示:草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和上述三株模式菌株對環(huán)糊精、糊精、淀粉、N-乙?；?D-半乳糖胺、側(cè)金盞花醇、a -D-乳糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、麥芽糖、赤藻糖醇、D-蜜二糖、D-棉子糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖醛酸、丁二胺、L-棉子糖、Y -羥基丁酸、P-羥基苯乙酸、衣康酸、葡糖醛酰胺、丙二酸、α -酮戊酸、癸二酸、松二糖、甘氨酰-L-天門冬氨酸、D-丙氨酸、羥基-L-脯氨酸、L-組氨酸、胸腺嘧啶核苷、D-絲氨酸、L-亮氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、D，L-肉堿、苯乙胺、2-氨基乙醇、2，3-丁二醇和1-磷酸葡萄糖的利用均為陰性；均為陽性的是吐溫40、吐溫80、Ν-乙?；?D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-半乳糖、a -D-葡萄糖、m-肌醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖酸內(nèi)酯、D-葡萄糖酸、β -羥基丁酸、α -酮戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、琥珀酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸胺、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、肌苷、尿苷和丙三醇；對甲酸、D, L-乳酸、溴丁二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸和L-焦谷氨酸的利用均為弱陽性。而草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004對L-阿拉伯糖等21種碳源的利用情況與上述三株模式菌株不同(表 I)。草 甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 與 Collimonaspratensis CCUG547281有最高基因組相似性，為83.99± 1.83 %，高于DNA-DNA種的雜交水平的臨界值 70%，而與 C.fungivorans CCUG48868T 和 C.arenae CCUG54727T 基因組相似性分別僅為45.32±1.89%和32.52±2.30%，均低于DNA-DNA種的雜交水平的臨界值，草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 與 C.pratensis CCUG547281"對乳果糖、D-海藻糖、甲基丙酮酸、乙酸、L-蘇氨酸、順-烏頭酸、檸檬酸、奎尼酸、Y -氨基丁酸、尿刊酸、D，L- α -磷酸甘油和6-磷酸葡萄糖的利用是不同的，結(jié)合菌落形態(tài)(KB培養(yǎng)基)和16SrDNA序列的差異,說明草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004是草甸山崗單胞菌的一個新菌株。
[0007]本發(fā)明所提供的草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004作為生防菌的關(guān)鍵性生防指標(biāo)是具有產(chǎn)低溫蛋白酶的能力，另外還可以產(chǎn)氧化酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸酯酶、嗜鐵素，而不產(chǎn)生纖維素酶。
[0008]草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的下述任一種用途也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0009]I)植物褐腐病菌抑制劑，它的活性成分是所述的草甸山崗單胞菌和/或所述的草甸山崗單胞菌的代謝物；[0010]2)植物褐腐病抑制劑，它的活性成分是所述的草甸山崗單胞菌和/或所述的草甸山崗單胞菌的代謝物；
[0011]3)所述的草甸山崗單胞菌和/或所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在制備植物褐腐病菌抑制劑中的應(yīng)用；
[0012]4)所述的草甸山崗單胞菌和/或所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在抑制植物褐腐病菌中的應(yīng)用；
[0013]5)所述的草甸山崗單胞菌和/或所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在制備植物褐腐病抑制劑中的應(yīng)用；
[0014]6)所述的草甸山崗單胞菌和/或所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在抑制植物褐腐病中的應(yīng)用；
[0015]7)所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用；
[0016]8)所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用； [0017]9)所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)淀粉酶中的應(yīng)用；
[0018]10)所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)氧化酶中的應(yīng)用；
[0019]11)所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)嗜鐵素中的應(yīng)用。
[0020]其中，上述植物褐腐病菌可為桃褐腐病菌(如美澳型核果鏈核盤菌(Moniliniafructicola(ffint.) Honey))。
[0021]上述草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的代謝物可從所述草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的發(fā)酵液中獲得。所述草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的代謝物具體可按照如下方法制備,在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004,除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的所述草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004即得到所述山崗單胞菌的代謝物。
[0022]實驗證明，草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004對植物病原菌的抑制活性具有很強(qiáng)的?；?，在所供試的病原真菌、細(xì)菌和酵母菌中，僅對桃褐腐病菌有較強(qiáng)的抑制作用，而對其它病原菌均無抑制作用。草甸山崗單胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004對桃褐腐病菌的抑菌能力為1-7天，最大抑菌帶寬為8mm，抑菌率達(dá)64.29%，草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004室內(nèi)離體防效檢測結(jié)果表明草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004代謝物能夠明顯抑制桃褐腐病病斑的擴(kuò)展，對桃褐腐病病斑的防治效果高達(dá)86.4%。本發(fā)明的草甸山崗單胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004分離自西藏色季拉山海拔4530m的高山草甸土壤，所棲息的高寒荒漠環(huán)境年均溫O°C，最暖月均溫6°C，(TC以上的天數(shù)120d，高于0°C的年積溫1000°C。對高寒生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)使草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004具備了耐低溫的特性，其生長溫度范圍為4-30°C，最適生長溫度為25°C，在30°C以上的溫度下不生長，依據(jù)Morita對嗜冷菌和耐冷菌的定義，該菌株屬于耐冷菌。酶學(xué)性質(zhì)試驗表明，草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004產(chǎn)生的胞外蛋白酶Capro最適溫度為30°C,在300C _40°C范圍內(nèi)酶活力較高，40°C以上酶活力急驟下降，而在10°C時仍保持在70%以上。草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004繁殖速度快,能夠人工培養(yǎng),可用于生產(chǎn)低溫蛋白酶，還可用于防治桃褐腐病。[0023]牛物材料保藏說明
[0024]生物材料的分類命名:草甸山崗單胞菌(Collimonaspratensis)
[0025]生物材料的菌株編號JZB120004
[0026]生物材料的保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0027]生物材料的保藏單位簡稱:CGMCC
[0028]生物材料的保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101
[0029]生物材料的保藏日期:2014年5月23日
[0030]生物材料的保藏中心登記入冊編號=CGMCC N0.9193
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的菌落形態(tài)(KB平板上)及革蘭氏染色后的菌體形態(tài)；A-B為培養(yǎng)96h后的菌落形態(tài)；C為400 X光學(xué)顯微鏡下觀察到的菌體形態(tài)。
[0032]圖2為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004對桃褐腐病菌的抑菌活性檢測；A:對峙培養(yǎng)7天結(jié)果；B:對峙培養(yǎng)14天結(jié)果；C:無菌發(fā)酵上清液的抑菌活性檢測結(jié)果，C中左側(cè)孔為對照，右側(cè)孔為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004活性物質(zhì)。
[0033]圖3為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004對桃褐腐病室內(nèi)離體防效測定結(jié)果；A:處理A ；B:處理B ；C:處理C ；D:處理D。
[0034]圖4為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004生防相關(guān)性狀測定結(jié)果；A:磷酸酯酶檢測；B:幾丁質(zhì)酶檢測；C:蛋白酶檢測；D:嗜鐵素檢測。
[0035]圖5為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004在蛋白酶活性檢測平板上的透明圈。
[0036]圖6為草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 基因組 DNA BamH I 酶切圖譜；1:15000bp DNA Ladder Marker ；2:基因組DNA酶切Omin ；3:基因組DNA酶切60min。
[0037]圖7為蛋白酶基因陽性克隆子的篩選；A:蛋白酶基因陽性轉(zhuǎn)化子初篩結(jié)果；B:蛋白酶基因陽性轉(zhuǎn)化子復(fù)篩結(jié)果中1:重組大腸桿菌DH5ci /pUCllS ；B中2:重組大腸桿菌DH5a /pUC118_capro。
[0038]圖8 為pUC118_capro質(zhì)粒酶切檢測結(jié)果；1:5000bp DNA Ladder Marker ；2:pUC118的BamH I酶切片段；3:pUC118-capro的BamH I酶切片段。
[0039]圖9為重組大腸桿菌代謝物活性檢測；1:重組大腸桿菌DH5 a /pUC118-capro非誘導(dǎo)培養(yǎng)48h總蛋白溶液；2:重組大腸桿菌DH5a/pUC118的誘導(dǎo)培養(yǎng)48h總蛋白溶液；3、重組大腸桿菌DH5 a /pUC118-capro的誘導(dǎo)培養(yǎng)24h總蛋白溶液；4、重組大腸桿菌DH5 α /pUC118-capro 的誘導(dǎo)培養(yǎng)48h總蛋白溶液。
[0040]圖10為目的蛋白SDS-PAGE檢測圖譜；M:蛋白Marker ； 1、重組大腸桿菌DH5 α /pUC118-capro的誘導(dǎo)培養(yǎng)24h總蛋白溶液；2、重組大腸桿菌DH5 a /pUC118-capro的誘導(dǎo)培養(yǎng)48h總蛋白溶液；3、重組大腸桿菌DH5 a /pUC118的誘導(dǎo)培養(yǎng)48h總蛋白溶液。
[0041]圖11為溫度和pH對蛋白酶capro活性的影響；A為溫度蛋白酶活性的影響，B為pH對蛋白酶活性的影響；E.coli表示DH5 a /pUC118_capro，JZB120004表示草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]幾丁質(zhì)粉為美國Sigma化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；BamH I酶、pUC118、Hind III內(nèi)切酶、PMD18-T載體為TAKARA公司產(chǎn)品；大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞購于原平皓生物技術(shù)有限公司。實施例中所用的培養(yǎng)基如下:
[0044](I) PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，用蒸餾水定容至1000mL。
[0045](2)LB培養(yǎng)基:酵母提取物5g,胰蛋白胨10g,NaCllOg,瓊脂15g,用蒸懼水定容至1000mL, ρΗ7.0-7.2。
[0046](3)KB 固體培養(yǎng)基:蛋白胨 20g，MgS04*7H201.5g，K2HP041.5g，甘油 10ml，瓊脂 20g， 用蒸懼水定容至1000mL, pH6.8,121°C滅菌30min。
[0047]KB液體培養(yǎng)基(KB培養(yǎng)基中不加瓊脂，即:蛋白胨20g，MgSO4 *7H2015g, K2HP0415g,甘油10ml,用蒸懼水定容至1000ml, pH6.8,121°C滅菌30min。
[0048](4)磷酸酯酶檢測培養(yǎng)基:酵母浸粉0.5g，葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，Ca3 (PO4) 25g，MgCl20.lg, KC10.2g，F(xiàn)eSO40.lmg，MnSO4.H2O0.lmg，瓊脂 15g，用蒸餾水定容至lOOOmL，ρΗ7.0。
[0049](5)嗜鐵素(CAS)檢測培養(yǎng)基:由4種溶液組成(溶液1_3及casamino acid)。
[0050]溶液I (CAS/HDTMA溶液):鉻天青(CAS)溶液:60.5mg CAS溶解在50ml水中；鐵溶液:lmmol/L FeCl3.6H20溶解于10mmol/L HCI中，ρΗ2.0 ;十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)溶液:72.9mg HDTMA溶解于40ml水中。取IOml鐵溶液與CAS溶液混合后加入到HDTMA溶液中，混均后溶液呈藍(lán)黑色，121°C滅菌15min，該液體即CAS/HDTMA溶液。
[0051]溶液2 (Salts/Buffer 溶液):鹽(Salts)溶液:將 30.24g Pipes 溶解于750mLSalts 溶液(KH2PO40.3g, NaCl0.5g, NH4Cll.0g)中，以 50% (W/V) KOH 調(diào)節(jié) pH 至 6.8，加入15g瓊脂定容至800ml, 121°C滅菌15min。
[0052]溶液3:甘露醇 2g,葡萄糖 2g, MgSO4.7H20493mg, H3BO3L 4mg, CaCl2Ilmg,MnSO4.2H201.17mg, ZnSO4.7H201.2mg, Na2MoO4.2H201mg, CuS0440 μ g,蒸餾水定容至 750ml，121。。滅菌 15min。
[0053]將溶液2與冷卻至45_50°C左右溶液3混合后再與30ml已用微孔濾膜過濾除菌過的10% (ff/V) casamimo acid混合,最后加入溶液1，緩慢混均(避免產(chǎn)生泡沫)，倒平板。
[0054](6)纖維素水解培養(yǎng)基:蛋白胨10g，KH2PO4Ig,酵母浸粉10g，NaC15g，羧甲基纖維素鈉10g，用蒸餾水定容至lOOOmL，121°C滅菌20min，ρΗ7.2。
[0055](7)蛋白酶檢測培養(yǎng)基:進(jìn)口脫脂奶粉10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1000ml，121。。滅菌 15min。
[0056](8)幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基:酵母提取物0.05g,膠體幾丁質(zhì)2g, KH2PO4Ig, NaC15g,瓊脂粉15g，用蒸餾水定容至lOOOmL，pH6.5-7.0,121°C滅菌25min。[0057](9) 1.5%水瓊脂培養(yǎng)基:瓊脂粉15g，用蒸餾水定容至lOOOmL，pH6.5-7.0,121°C滅菌25min。
[0058](10) TSA培養(yǎng)基:胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨10g，NaC15g，瓊脂15g，蒸餾水lOOOmL, pH7.3。
[0059](11)BUG+B培養(yǎng)基:BUG瓊脂培養(yǎng)基57g，蒸餾水950mL，煮沸溶解，ρΗ7.3±0.1，121°C滅菌15min，將50mL新鮮的脫纖羊血加入到已溶解冷卻至45_50°C BUG瓊脂培養(yǎng)基中，混均，倒平板。
[0060](12)膠體幾丁質(zhì)的制備:取IOg幾丁質(zhì)粉溶于170mL4°C過夜預(yù)冷的濃鹽酸中，磁力攪拌器攪拌混勻后，置于4°C冰箱過夜，用蒸餾水反復(fù)洗至中性，定容到1000mL，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0061](13)蛋白酶檢測(重組子篩選)培養(yǎng)基:進(jìn)口脫脂奶粉10g，瓊脂15g，去離子水1000ml, 121°C 滅菌 15min。
[0062]實施例1、本發(fā)明草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004的分離及鑒
定
[0063]1、草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 的分離
[0064]以漠河永凍層、 西藏雪域高原、海洋紅樹林等特殊生境采集的樣品為對象，以傳統(tǒng)的活性篩選方法結(jié)合分子生物學(xué)和生理生化等技術(shù)，篩選果蔬作物重要真菌病害新的或稀有生防因子。結(jié)果從西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分離得到一編號為JZB120004 的菌株，即草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004。
[0065]2、草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 的鑒定
[0066]草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004在KB固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生紫色可溶性色素，菌落扁平、光滑，直徑為3-7_ ;革蘭氏陰性，菌體呈短桿狀，直或近直(圖1)。草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 的 16S rDNA 序列如 SEQ ID N0.3 所不，與山崗單胞菌屬全部3個種的模式菌株CCUG54728T、CCUG54727T和CCUG48868T (Gene Bank:AY281137，AY281146和AJ310394)的16S rDNA序列相似性最高，均為99%。草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004為革蘭氏陰性桿菌,好氧菌；產(chǎn)氧化酶、淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、磷酸酯酶和嗜鐵素，未檢測到纖維素酶；適宜生長溫度為20-28°C，25°C生長最好，4°C下能緩慢生長，37°C以上不能生長。草甸山崗單胞菌(Collimonaspratensis)JZB120004與該屬模式菌株C.fungivorans CCUG48868T、C.arenae CCUG54727T、C.pratensisCCUG54728T的碳源代謝比較結(jié)果顯示:草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和三株模式菌株對環(huán)糊精、糊精、淀粉、N-乙?；?D-半乳糖胺、側(cè)金盞花醇、α-D-乳糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、麥芽糖、赤藻糖醇、D-蜜二糖、D-棉子糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖醛酸、丁二胺、L-棉子糖、Y -羥基丁酸、P-羥基苯乙酸、衣康酸、葡糖醛酰胺、丙二酸、a -酮戊酸、癸二酸、松二糖、甘氨酰-L-天門冬氨酸、D-丙氨酸、羥基-L-脯氨酸、L-組氨酸、胸腺嘧啶核苷、D-絲氨酸、L-亮氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、D, L-肉堿、苯乙胺、2-氨基乙醇、2，3-丁二醇和1-磷酸葡萄糖的利用均為陰性；均為陽性的是吐溫40、吐溫80、N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-半乳糖、a -D-葡萄糖、m-肌醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖酸內(nèi)酯、D-葡萄糖酸、β -羥基丁酸、a -酮戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、琥珀酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸胺、L-天門冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、肌苷、尿苷和丙三醇；對甲酸、D, L-乳酸、溴丁二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺酸和L-焦谷氨酸的利用均為弱陽性。而草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004對L-阿拉伯糖等21種碳源的利用情況與上述三株模式菌株不同(表 I)。草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 與 Collimonaspratensis CCUG547281有最高基因組相似性，為83.99± 1.83%，高于DNA-DNA種的雜交水平的臨界值 70%，而與 C.fungivorans CCUG48868T 和 C.arenae CCUG54727T 基因組相似性分別僅為45.32±1.89%和32.52±2.30% (表2)，均低于DNA-DNA種的雜交水平的臨界值，草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 與 C.pratensis CCUG54728T 對乳果糖、D-海藻糖、甲基丙酮酸、乙酸、L-蘇氨酸、順-烏頭酸、檸檬酸、奎尼酸、Y -氨基丁酸、尿刊酸、D, L-α-磷酸甘油和6-磷酸葡萄糖的利用是不同的，結(jié)合菌落形態(tài)(KB固體培養(yǎng)基)和16S rDNA序列的差異，說明草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004是草甸山崗單胞菌的一個新菌株。草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004已于2014年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9193,本申請中簡稱草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004。
[0067]表1、草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004 與 C.fungivoransCCUG48868T、C.arenae CCUG54727T 和 C.pratensis CCUG54728T 對 21 種碳源代謝的差異
[0068]
【權(quán)利要求】
1.草甸山崗單胞菌(Collimonaspratensis),其菌株號為JZB120004，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC N0.9193。
2.植物褐腐病菌抑制劑，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求I所述的草甸山崗單胞菌的代謝物。
3.植物褐腐病抑制劑，它的活性成分是權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求I所述的草甸山崗單胞菌的代謝物。
4.權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌的代謝物的下述任一應(yīng)用: A)權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在制備植物褐腐病菌抑制劑中的應(yīng)用； B)權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在抑制植物褐腐病菌中的應(yīng)用； C)權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在制備植物褐腐病抑制劑中的應(yīng)用； D)權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌和/或權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌的代謝物在抑制植物褐腐病中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述 的植物褐腐病菌抑制劑、權(quán)利要求3所述的植物褐腐病抑制劑，或權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物褐腐病菌為桃褐腐病菌；所述植物褐腐病為桃褐腐病。
6.權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)生產(chǎn)蛋白酶中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)淀粉酶中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)氧化酶中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的草甸山崗單胞菌在生產(chǎn)嗜鐵素中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/01GK104004680SQ201410223062
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】劉偉成, 盧彩鴿, 劉德文, 張殿朋, 吳慧玲, 劉霆, 董丹, 李潔瓊 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院