用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物、探針和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及引物和探針技術(shù)，旨在提供一種用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物、探針和方法。本發(fā)明中用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物具體包括：上游引物MPF，其序列如SEQ?NO.1所示；下游引物MPR，其序列如SEQ?NO.2所示。本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，說(shuō)明其靈敏度良好。引物和探針對(duì)不含沙眼衣原體的樣本沒(méi)有檢測(cè)信號(hào)，說(shuō)明其特異性強(qiáng)，避免假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。通過(guò)利用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行熒光PCR處理，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、檢出率高，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率。能對(duì)多種臨床樣本進(jìn)行高效可靠的篩查，對(duì)臨床病情進(jìn)行監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)合理用藥。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物、探針和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及引物和探針技術(shù)，特別涉及用于檢測(cè)沙眼衣原體核苷酸序列的特異性引物、探針和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, CT)是一類在細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性微生物，大小約250-450nm。原體呈球形或類球形，胞漿膜外有剛性細(xì)胞壁，壁外有平滑表層。始體的體積較大，形狀不甚規(guī)則，其包膜富有韌性，無(wú)剛性的細(xì)胞壁，原體和始體內(nèi)皆含有DNA與RNA。有較復(fù)雜的、能進(jìn)行一定代謝活動(dòng)的酶系統(tǒng)，但不能合成帶高能鍵的化合物，須利用宿主細(xì)胞的三磷酸鹽和中間代謝產(chǎn)物作為能量來(lái)源，必須在活細(xì)胞內(nèi)生存。具有獨(dú)特的發(fā)育周期，并以二等分裂方式繁殖，形成包涵體。
[0003]沙眼衣原體具有特殊的染色性狀，不同的發(fā)育階段其染色有所不同。成熟的原體以Giemsa染色為紫色，與藍(lán)色的宿主細(xì)胞漿呈鮮明對(duì)比。始體以Giemsa染色呈藍(lán)色。沙眼衣原體對(duì)革蘭氏染色雖然一般反應(yīng)為陰性，但變化不恒定。沙眼包涵體在上皮細(xì)胞漿內(nèi)，很致密，如以Giemsa染色，則呈深紫色，由密集的顆粒組成。其基質(zhì)內(nèi)含有糖原，以Lugol液染色呈棕褐色斑塊。
[0004]人類是沙眼衣原體的自然宿主。它主要寄生于機(jī)體粘膜上皮細(xì)胞。猴和猩猩的眼及泌尿系可實(shí)驗(yàn)感染各型沙眼衣原體(包括LGV在內(nèi))。靈長(zhǎng)類外的動(dòng)物，對(duì)LGV之外的其他沙眼衣原體均無(wú)致病 性。雞胚只對(duì)大多數(shù)沙眼衣原體敏感，但禽類則對(duì)各型沙眼衣原均不敏感。小白鼠對(duì)LGV衣原體是敏感的，尤其是腦內(nèi)感染，病死率可達(dá)30%。此外，大白鼠、豚鼠和家兔對(duì)LGV衣原體的敏感性幼齡高于成年。所有沙眼衣原體都能在雞胚卵黃囊內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，并致死雞胚。將沙眼衣原體懸液接種6~8天胚齡卵黃囊內(nèi)，置35°C溫箱，一般于6~8天后死亡。剖檢時(shí)胚體及卵黃囊膜充血。卵黃囊膜涂片可散在衣原體，病理切片則可見(jiàn)卵黃囊膜細(xì)胞內(nèi)包涵體。
[0005]沙眼衣原體可以引起多種疾病，如沙眼，還與人類泌尿生殖道疾病相關(guān)，如非淋菌性尿道炎、陰道炎、宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎等；CT還可以通過(guò)母嬰傳播新生兒眼結(jié)膜炎、肺炎，并可導(dǎo)致胎膜早破、早產(chǎn)、新生」L死亡等。
[0006]目前臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷沙眼衣原體的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法和細(xì)胞培養(yǎng)法等。酶聯(lián)免疫法和細(xì)胞培養(yǎng)法靈敏度較低，而且耗時(shí)耗力，不利于及時(shí)指導(dǎo)用藥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物、探針和方法。
[0008]為解決技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的解決方案是:
[0009]提供一種用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物，該引物具體包括:
[0010]上游引物MPF，其序列為 SEQ N0.1:5’ CCTCTGAAACGACTTTTC3’ ；[0011]下游引物MPR，其序列為 SEQ N0.2:5’ CTGGATTTATCGGAAACC3’。
[0012]本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性探針，該探針的兩端分別是標(biāo)記熒光
[0013]報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸；其序列為:
[0014]SEQ N0.3:5’ FAM TCTCTTGACCACAGCGAATCTT BHQ13’。
[0015]本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測(cè)沙眼衣原體的方法，是利用前述的引物和探針，采用熒光PCR技術(shù)對(duì)沙眼衣原體的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增；通過(guò)PCR擴(kuò)增在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入特異性的突光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)突光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)突光淬滅基團(tuán)；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收；擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)，探針與靶核酸結(jié)合；經(jīng)PCR擴(kuò)增后，Taq酶的5，端一3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能夠接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而可以通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在；具體的判斷依據(jù)為:
[0016]如果待檢樣本中含有沙眼衣原體，則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，如果待檢樣本中沒(méi)有沙眼衣原體，則顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。這一結(jié)果也提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0018]1、本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，說(shuō)明其靈敏度良好。
[0019]2、本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)不含沙眼衣原體的樣本沒(méi)有檢測(cè)信號(hào)，說(shuō)明其特異性強(qiáng)。
[0020]3、由于本發(fā)明進(jìn)行了程序和體系優(yōu)化，避免了假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。
[0021]4、通過(guò)利用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行熒光PCR處理，操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)迅速、檢出率高，與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率。可對(duì)多種臨床樣本進(jìn)行高效可靠的篩查，以及對(duì)臨床病情進(jìn)行監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)合理用藥。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為利用引物對(duì)MPF/MPR和探針檢測(cè)沙眼衣原體陽(yáng)性樣本的熒光PCR擴(kuò)增圖。
[0023]圖中曲線I為沙眼衣原體陽(yáng)性樣本擴(kuò)曲線；曲線2為內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0024]熒光PCR技術(shù)原理是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。
[0025] 本發(fā)明利用特異性的引物，采用熒光PCR技術(shù)對(duì)沙眼衣原體的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增；通過(guò)PCR擴(kuò)增在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收；擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)，探針與靶核酸結(jié)合；經(jīng)PCR擴(kuò)增后，Ta,酶的5’端一 3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能夠接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而可以通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。
[0026]具體實(shí)施例子如下:
[0027]1.引物和探針的設(shè)計(jì):通過(guò)分別對(duì)已知的沙眼衣原體的核酸序列進(jìn)行比較分析，設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20堿基左右。最優(yōu)引物探針序列組合如下:
[0028]上游引物MPF:5’ CCTCTGAAACGACTTTTC3’ (SEQ N0.1)
[0029]下游引物MPR: 5 ’ CTGGATTTATCGGAAACC3 ’ (SEQ N0.2)
[0030]探針:5’FAM TCTCTTGACCACAGCGAATCTT BHQl3’ (SEQ N0.3)。
[0031]2.反應(yīng)體系的優(yōu)化:利用臨床分離的沙眼衣原體滅活液作為待檢樣品，用磁珠裂解法抽提沙眼衣原體核酸，分裝后貯存于一 80°C。
[0032]2.1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將沙眼衣原體引物濃度分別從0.1 μ mol/L至1.6 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.2ymol/L。
[0033]2.2探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將沙眼衣原體檢測(cè)用探針濃度分別從0.1 μ mol/L至0.5 μ mol/L作倍比連續(xù)稀釋，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針濃度是0.1 6 μ mol/L。
[0034]利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的沙眼衣原體實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25 μ L0按照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)液的配置。
[0035]3.儀器檢測(cè)通道的選擇
[0036]選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。
[0037]4.PCR反應(yīng)條件如下
[0038]500C 2min 進(jìn)行 UNG 酶反應(yīng)；95°C 3min, I 個(gè)循環(huán)；94°C 10s，62°C 40s,40 個(gè)循環(huán)，在62°C 40s階段收集熒光。
[0039]5.檢測(cè)結(jié)果分析
[0040]如果待檢樣本中含有沙眼衣原體，則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，如果待檢樣本中沒(méi)有沙眼衣原體，則顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì)和探針具有良好的特異性和靈敏度。
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性引物，其特征在于，該引物具體包括: 上游引物 MPF，其序列為 SEQ N0.1:5’ CCTCTGAAACGACTTTTC3’ ； 下游引物 MPR，其序列為 SEQ N0.2:5’ CTGGATTTATCGGAAACC3’。
2.用于檢測(cè)沙眼衣原體的特異性探針，其特征在于，該探針的兩端分別是標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸；其序列為:
SEQ N0.3:5’ FAM TCTCTTGACCACAGCGAATCTT BHQ13’。
3.—種檢測(cè)沙眼衣原體的方法，其特征在于，是利用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所述的探針，采用熒光PCR技術(shù)對(duì)沙眼衣原體的核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增；通過(guò)擴(kuò)增在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入特異性的突光探針；該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)突光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收；擴(kuò)增開(kāi)始時(shí)，探針與靶核酸結(jié)合；經(jīng)PCR擴(kuò)增后，Taq酶的5’端一 3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而在熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)能夠接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，從而能通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在；具體的判斷依據(jù)為: 如果待檢樣本中含有沙眼衣原體，則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/mL，如果待檢樣本中沒(méi)有沙眼衣原體，則顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993085SQ201410223590
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月25日
【發(fā)明者】陳寧清, 喬佳, 葉朝付, 李原, 汪維成 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)療器械研究所