一種保持種子活力的玉米單粒胚乳dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】的玉米單粒胚乳DNA的提取方法。本發(fā)明先將種子浸泡，然后切去部分胚乳，再加入浸提緩沖液，在55℃水浴后將胚乳研磨；向胚乳中加入CTAB抽提液進(jìn)行抽提，再加入蛋白酶K和醋酸鈉，最后加入飽和酚和氯仿/異戊醇，離心；向上清液中加入異丙醇，離心，用70％乙醇沖洗沉淀，干燥，加入TE中溶解。本發(fā)明方法不破壞種子本身的生活力，切除部分胚乳后仍可育苗移栽，利于進(jìn)行大規(guī)模分子標(biāo)記輔助選擇；其次，本發(fā)明方法提取的DNA濃度高、純度高；此外，本發(fā)明方法可在室內(nèi)對育種后代進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，工作效率高，節(jié)約人力、物力和財力；最后，本發(fā)明被切割種子被感染發(fā)霉的概率低，育苗成功率高。
【專利說明】—種保持種子活力的玉米單粒胚乳DNA的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種保持種子活力的玉米單粒胚乳DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]分子標(biāo)記輔助選擇由于不受環(huán)境條件和基因互作影響、無組織和器官特異性，以及不受基因顯隱性影響，可以直接對基因進(jìn)行早代選擇和多基因選擇，具有育種進(jìn)程快、育種時間短和育種效率高等優(yōu)點(diǎn)，因而受到廣泛的關(guān)注。但是要將分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用于育種實(shí)踐面臨的首要問題是在保證不破壞植株后代生長發(fā)育的情況下提取單株DNA，傳統(tǒng)的提取單株DNA的方法一般是先將玉米材料在室內(nèi)或田間培養(yǎng)至幼苗，然后采集玉米幼苗的部分葉片提取DNA，這種方法操作程序復(fù)雜、耗時長、取樣麻煩、工作量大，并且需要較大的空間培養(yǎng)幼苗，占地多，大大加大了篩選成本，使大規(guī)模檢測和篩選分子輔助選擇標(biāo)記受到限制。
[0003]如果在不破壞籽粒生活力的情況下切取籽粒部分胚乳用于提取DNA，在室內(nèi)對與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行快速、高效的鑒定和篩選，將大量不含目的基因的后代籽粒淘汰，而將被選籽粒直接種植，無疑將大大提高工作效率，減少人力、物力和財力的浪費(fèi)。高玉峰等(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，16(6)32-36)和郭景倫(農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2005, 25(5) 113-114，118)等公開了利用堿煮法快速提取玉米籽粒胚乳DNA的方法，將切下來的玉米胚乳放在NaOH溶液中，然后放在沸水浴中加熱，離心，最后得到胚乳DNA ;但是從高玉峰公開的方法中提供的電泳圖上基本看不見DNA的條帶，說明所提取的DNA濃度較低；而郭景倫公開的方法中DNA電泳圖上存在雜質(zhì)較多，DNA有降解且純度較低的問題。魏國燕等(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36 (22):9408-9409)公開了采用高溫法提取玉米籽粒胚乳DNA，但是由于在切割籽粒之前沒有浸泡籽粒，這樣在切籽粒時容易傷害到玉米胚，且切完后的干籽粒種下后所需的發(fā)芽時間較長，增加了被感染的幾率和后期的育苗困難。因此，上述這些方法均不適合提取高質(zhì)量的玉米單粒胚乳DNA，其在分子標(biāo)記輔助選擇方面的應(yīng)用受到很大的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種保持種子活力的玉米單粒胚乳DNA的提取方法。利用本發(fā)明方法提取的DNA濃度高，純度高，而且被切除部分胚乳的籽粒可育苗后移栽，獲得正常植株。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]本發(fā)明一種保持種子活力的玉米單粒胚乳DNA的提取方法，按照如下步驟進(jìn)行: [0007](I)、將干玉米種子(以下簡稱種子)放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，然后向培養(yǎng)皿中加入去離子水，使種子完全浸沒在水中；再置于光照培養(yǎng)箱里，在25°C、光照12h/天的條件下浸泡種子24~48h ；[0008](2)、將步驟(1)中浸泡過的種子取出，用吸水紙吸干種子上的水分，然后用消毒后的手術(shù)刀切取種子的胚乳部分，并且對種子的胚不能造成損傷，將切取的胚乳放在EP(規(guī)格為2ml)管里；其中所切去的胚乳占浸泡后種子總重的1/4~1/3 ；
[0009](3)、向步驟⑵的EP管中加入浸提緩沖液300~500ul，然后在55 °C下水浴60min，每隔30min輕搖一次；其中所述的浸提緩沖液的組成成分及其比例為:200mMTris-HCKpH = 8.0), 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS，超純水 IL ；
[0010](4)、將步驟(3)的EP管中的所有胚乳和浸提緩沖液倒入研缽中，研磨成勻漿，然后向研缽中加入CTAB抽提液300~500ul，搖動研缽，使研缽壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后將液體倒回到原EP管中；
[0011](5)、向步驟(4)的EP管中加入蛋白酶1(1.0~4.0111，在651:水浴401^11，每隔IOmin輕搖一次；其中所述的蛋白酶K的濃度為20mg/ml ；
[0012](6)、向步驟(5)的EP管中加入ρΗ5.2、3Μ醋酸鈉100~300ul，然后在-20°C冰箱中靜置lOmin，再向EP管加入65°C預(yù)熱的飽和酚350~450ul和室溫下的體積比為24:1的氯仿/異戍醇溶液350~450ul,混勻 ，靜置5min ;接著在4°C、12000rpm條件下離心10min,吸取上清液700~900ul至新的EP管(規(guī)格為1.5ml，下同)中；然后向EP管加入2/3體積的_2(TC預(yù)冷的異丙醇,室溫下靜置IOmin,每隔2min輕搖一次；再在4?、12000rpm條件下離心10min,倒掉上清液；
[0013](7)、向步驟(6)的EP管中加入70%乙醇800~lOOOul，搖動EP管，用食指輕彈EP管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起來，再在4°C、12000rpm條件下離心2min，倒掉上清液；此步驟用70%乙醇重復(fù)沖洗1-3次；
[0014](8)、將步驟(7)中的EP管倒扣在鋪有濾紙的桌面上，靜置lmin，然后將EP管放在瞬時離心機(jī)上離心20s，使管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，再用移液槍將管底的乙醇吸干，接著放在通風(fēng)櫥中干燥2~5min ;干燥后，向EP管中加入30~IOOul TE使DNA溶解。
[0015]上述提取方法步驟(1)中所述的培養(yǎng)皿的直徑為9cm ;所述的加入去離子水的量為 20 ~50ml ο
[0016]上述提取方法步驟(2)中所述的消毒是指用75%酒精消毒。
[0017]上述提取方法步驟(4)中所述的CTAB抽提液的組成成分比例為:2% CTAB, IOOmMTris-HCKpH = 8.0), 20mM EDTA (pH = 8.0)，1.4Μ NaCl, 1% PVP 和超純水 1L。
[0018]本發(fā)明中所述的種子和籽粒為同一概念。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:(I)、本發(fā)明方法不破壞種子的生活力，提取胚乳DNA后的玉米籽粒仍可育苗移栽，獲得正常植株，這樣既能保證獲得高質(zhì)量DNA，又兼顧到優(yōu)良/目的種質(zhì)的保種問題，對于分子標(biāo)記輔助選擇具有重要的意義。
(2)、利用本發(fā)明方法提取的DNA濃度高、純度高，該DNA樣品不僅可以用于PCR檢測，還可用于各類分子生物學(xué)研究。(3)、本發(fā)明方法可用于玉米種植前的早期檢測，工作效率高，節(jié)約人力、物力和財力，并使大規(guī)模進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇成為可能。(4)、本發(fā)明方法中先將玉米籽粒浸泡，不僅便于胚乳的切割，以及切割時不易傷害玉米胚，而且大大縮短籽粒的發(fā)芽時間，從而降低籽粒種下后被感染發(fā)霉的概率，育苗的成功率高。(5)、本發(fā)明方法將切下的胚乳直接加入浸提緩沖液水浴加熱，避免液氮研磨籽粒，因?yàn)榧尤胍旱蟮呐呷楹髸兊卯惓杂?，很難研磨，如果提取的樣品很多，一個人很難完成，而且對于操作不熟練的人很容易被液氮凍傷；另外，浸提緩沖液中含有的SDS在較高溫度(55~65°C )條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析、蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，浸提緩沖液中含有的EDTA中有Mg2+、Ca2+等金屬離子，這些金屬離子會抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基)，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。(6)、本發(fā)明方法中加入蛋白酶K可以將胚乳中的蛋白質(zhì)分解，并且含有的SDS可以增加蛋白酶K的活性，從而增加DNA提取的純度(從A26Q/A28Q比值看，1.8~2.0表示DNA純度好)。(7)、本發(fā)明方法中加入的醋酸鈉與DNA形成鹽，增加了 DNA的溶解度，使DNA更多的溶解在上清液中，進(jìn)而使提取的DNA濃度高，本發(fā)明方法中提取的DNA濃度大于200ng/ul以上，有的雜交種的DNA濃度甚至達(dá)到3000ng/ul以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.本發(fā)明方法提取的玉米胚乳DNA的電泳圖譜；其中M為maker，1-6分別為鄭58的不同籽粒。
[0021]圖2.CTAB法提取的玉米胚乳DNA的電泳圖譜；其中M為maker，1-6分別為鄭58的不同籽粒。
[0022]圖3.本發(fā)明方法提取的不同玉米雜交種和自交系的胚乳DNA的電泳圖譜；其中M為maker，I為農(nóng)大108，2為鄭單958，3為萃州158，4為農(nóng)華101，5為青農(nóng)8號，6為NS39，7為鄭58，8為黃478，9為青農(nóng)105，10為昌7_2。
[0023]圖4.被切除部分胚乳的種子發(fā)芽照片。
[0024]圖5.被切除部 分胚乳的種子根部和胚部照片。
[0025]圖6.以本發(fā)明方法提取的胚乳DNA為模版擴(kuò)增SSIIb和HMG基因的PCR產(chǎn)物電泳圖譜。其中M為maker ;1、3、5、7分別為鄭單958、農(nóng)大108、昌7-2、鄭58的SSIIb基因的擴(kuò)增產(chǎn)物；2、4、6、8分別為鄭單958、農(nóng)大108、昌7_2、鄭58的HMG基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1玉米自交系鄭58單粒胚乳DNA提取
[0027]按照如下方法進(jìn)行:
[0028](I)、浸泡種子。取6粒鄭58 (鄭58是目前生產(chǎn)上最常用的玉米自交系，6粒種子按照1-6順序編號)的干種子(下面簡稱種子或籽粒)用天平稱量每個單粒的重量(見表I)，并在種子的一面(非胚面)寫上序號，將稱量好的種子放進(jìn)鋪有濾紙的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，加入去離子水50ml，使種子完全浸沒在水中，然后置于光照培養(yǎng)箱中，在25°C、光照12h/天條件下培養(yǎng)48小時。
[0029](2)、將步驟(1)中浸泡過的種子從光照培養(yǎng)箱里取出，用吸水紙吸干種子上的水分，然后用75%酒精消毒后的手術(shù)刀切取種子的胚乳部分(注意:不要切到玉米籽粒的胚，不然會影響以后發(fā)芽、育苗)，所切去的胚乳約占浸泡后種子總重的1/4~1/3，將切取的胚乳放在EP管(規(guī)格2ml，下同)里；計算出切下胚乳干重以及切下干重占總干重的百分比如(見表1)。
[0030]表1:鄭58種子干重、濕重、切下的胚乳濕重、干重及所占干重的百分比測定結(jié)果
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種保持種子活力的玉米單粒胚乳DNA的提取方法，其特征在于按照如下步驟進(jìn)行:(1)、將干玉米種子放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，然后向培養(yǎng)皿中加入去離子水，使種子完全浸沒在水中；再置于光照培養(yǎng)箱里，在25°C、光照12h/天的條件下浸泡種子24~48h ； (2)、將步驟(1)中浸泡過的種子取出，用吸水紙吸干種子上的水分，然后用消毒后的手術(shù)刀切取種子的胚乳部分，并且對種子的胚不能造成損傷，將切取的胚乳放在規(guī)格為2ml的EP管里；其中所切去的胚乳占浸泡后種子總重的1/4~1/3 ； (3)、向步驟(2)的EP管中加入浸提緩沖液300~500ul，然后在55°C下水浴60min，每隔30min輕搖一次；其中所述的浸提緩沖液的組成成分及其比例為:200mM Tris-HCl (pH =8.0), 250mM NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS，超純水 IL ； (4)、將步驟(3)的EP管中的所有胚乳和浸提緩沖液倒入研缽中，研磨成勻漿，然后向研缽中加入CTAB抽提液300~500ul，搖動研缽，使研缽壁上的胚乳也溶解到CTAB抽提液里，最后將液體倒回到原EP管中； (5)、向步驟(4)的EP管中加入蛋白酶Kl.0~4.0ul，在65°C水浴40min，每隔IOmin輕搖一次；其中所述的蛋白酶K的濃度為20mg/ml ； (6)、向步驟(5)的EP管中加入ρΗ5.2、3Μ醋酸鈉100~300ul，然后在-20°C冰箱中靜置lOmin，再向EP管加入65°C預(yù)熱的飽和酚350~450ul和室溫下的體積比為24:1的氯仿/異戍醇溶液350~450ul,混勻，靜置5min ;接著在4°C、12000rpm條件下離心10min,吸取上清液700~900ul至新規(guī)格為1.5ml的EP管中；然后向EP管加入2/3體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇，室溫下靜置lOmin，每隔2min輕搖一次；再在4°C、12000rpm條件下離心10min，倒掉上清液； ⑵、向步驟(6)的EP管中加入70%乙醇800~1000ul，搖動EP管，用食指輕彈EP管的底部，使管底的DNA沉淀漂浮起來，再在4°C、12000rpm條件下離心2min，倒掉上清液；此步驟用70%乙醇重復(fù)沖洗1-3次； (8)、將步驟(7)中的EP管倒扣在鋪有濾紙的桌面上，靜置lmin，然后將EP管放在瞬時離心機(jī)上離心20s，使管壁的乙醇都聚集到EP管的底部，再用移液槍將管底的乙醇吸干，接著放在通風(fēng)櫥中干燥2~5min ;干燥后，向EP管中加入30~IOOul TE使DNA溶解。
2.按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于其步驟(1)中所述的培養(yǎng)皿的直徑為9cm ;所述的加入去離子水的量為20~50ml。
3.按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于其步驟(2)中所述的消毒是指用75%酒精消毒。
4.按照權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于其步驟(4)中所述的CTAB抽提液的組成成分比例為:2% CTAB, IOOmM Tris-HCl (pH = 8.0), 20mM EDTA(pH = 8.0)，1.4Μ NaCl,1% PVP和超純水1L。
【文檔編號】C12N15/10GK104004746SQ201410223634
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】郭新梅, 宋希云, 徐瑞斌, 裴玉賀, 趙美愛, 張恩盈 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)