長鏈非編碼rna crnde的應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長鏈非編碼RNA(long?no-coding?RNA,LncRNA)CRNDE的應(yīng)用方法，即用于制備膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，特別是制備出實時熒光定量分析法預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的試劑盒。通過研究證實LncRNA?CRNDE在膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)，高表達LncRNA?CRNDE的膠質(zhì)瘤患者比低表達LncRNA?CRNDE的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差，因此，將Lnc?RNA?CRNDE的表達用于膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后預(yù)測，可以為預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后提供強有力的分子生物學(xué)依據(jù)，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【專利說明】長鏈非編碼RNA CRNDE的應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及LncRNA CRNDE在制備膠質(zhì)瘤患者預(yù)后試劑中的應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)瘤約占神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40.49%，是最常見的腫瘤之一，目前采用的治療手段包括手術(shù)治療聯(lián)合化療和放療，尤為手術(shù)切出效果明顯。但是膠質(zhì)瘤病人的生存期仍無明顯延長。據(jù)相關(guān)報道，膠質(zhì)瘤病人的5年生存率低于25%。目前，對膠質(zhì)瘤的預(yù)后判定沒有金標準，也沒有特異性指標，遠遠不能適應(yīng)對膠質(zhì)瘤進行預(yù)后判定的需求。因此，對人膠質(zhì)瘤進行預(yù)后判定，以便選擇最佳治療方案，顯著提高患者生存率，成為神經(jīng)外科領(lǐng)域亟待解決的重要課題。 [0003]IncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200bp的非編碼RNA，具有相對較長的核苷酸鏈，其分子內(nèi)部具有特定的二級空間結(jié)構(gòu)，能提供與蛋白質(zhì)結(jié)合的多個位點，或與DNA、RNA之間通過堿基互補配對原則發(fā)生特異性、動態(tài)性相互作用。近年來，IncRNA作為一類重要的調(diào)控分子及其在臨床診斷、化療敏感性和預(yù)后評價等方面的應(yīng)用價值，已經(jīng)逐漸得到研究者的重視。有研究表明HOTAIR在原發(fā)乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中的表達都會增加，原發(fā)腫瘤中HOTAIR的表達水平可以用來有效預(yù)測癌轉(zhuǎn)移和死亡。IncRNA PCA3在前列腺癌中高度過表達，這種IncRNA是在尿液中發(fā)現(xiàn)的，相當便于臨床檢測。由此可見，IncRNA作為診斷、預(yù)后和治療的分子標志物具有巨大潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種LncRNA CRNDE的應(yīng)用方法，即LncRNACRNDE(colorectal neoplasia differentially expressed)定位于染色體 16ql2.2,GeneBank登錄號:NR_110452能作為膠質(zhì)瘤預(yù)后的判斷標準,用于制備膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，更進一步能夠提供一種性價比高，易于推廣應(yīng)用的膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測試劑盒。
[0005]長鏈非編碼RNA CRNDE的應(yīng)用方法，所述的長鏈非編碼RNA CRNDE用于制備膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，該長鏈非編碼RNA CRNDE的序列見SEQ NO:1。
[0006]所述的用于制備膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
[0007]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物:
[0008]LncRNA CRNDE 正向引物:5，-CTGCGTGACAACTGAGGA-3，，
[0009]LncRNA CRNDE 反向引物 5’ -GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。
[0010]所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒，
[0011]該試劑盒包括:(I)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA CRNDE逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及LncRNA CRNDE所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNACRNDE實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；
[0012]LncRNA CRNDE實時熒光定量PCR特異性引物
[0013]LncRNA CRNDE 正向引物 5’ -CTGCGTGACAACTGAGGA-3’，
[0014]LncRNA CRNDE 反向引物 5’ -GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。
[0015]U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物:
[0016]正向引物為5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，
[0017]反向引物為5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
[0018]在前期研究工作中， 申請人:通過DIANA-LncBase軟件分析與miR-101競爭性結(jié)合MRE序列的LncRNA時，發(fā)現(xiàn)了 LncRNA CRNDE。 申請人:在膠質(zhì)瘤組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR分析LncRNA CRNDE的表達，發(fā)現(xiàn):LncRNA CRNDE在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，與正常人腦組織中的表達差異顯著。且LncRNA CRNDE表達水平不同的膠質(zhì)瘤患者中預(yù)后存在明顯差異，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE高表達的膠質(zhì)瘤患者生存率明顯低于低表達的患者；多因素Cox比例風(fēng)險模型的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE的相對危險度>1，表明LncRNA CRNDE高表達的患者預(yù)后較低表達的患者預(yù)后差，所以LncRNA CRNDE的高表達是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后風(fēng)險預(yù)測的獨立危險因素。據(jù)此， 申請人:提出利用LncRNA CRNDE制備用于膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的制劑。。
[0019]將LncRNA CRNDE用于膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的檢測方法:(I)收集待測個體術(shù)后切除的膠質(zhì)瘤組織，抽提總RNA ； (2)以總RNA為模板將CRNDE逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (3)用CRNDE特異性引物進行實時熒光定量PCR擴增，獲得相對表達量2Δ Δετ，當2Δ Δετ>0.61342時提示CRNDE為高表達。
[0020]利用本發(fā)明的檢測制劑可以檢測LncRNA CRNDE在膠質(zhì)瘤患者中的表達水平，為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后預(yù)測提供了強有力的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠的臨床意義和推廣性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為實時熒光定量PCR分析LncRNA CRNDE在膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的表達差異;
[0022]
[0023]圖2為LncRNA CRNDE與37例膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。
【具體實施方式】
[0024]在前期研究工作中， 申請人:通過DIANA-LncBase軟件分析與miR-101競爭性結(jié)合MRE序列的LncRNA時，發(fā)現(xiàn)了 LncRNA CRNDE0 申請人:在膠質(zhì)瘤組織中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行實時熒光定量PCR分析LncRNA CRNDE的表達，發(fā)現(xiàn)=LncRNA CRNDE在膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)，與正常 人腦組織中的表達差異顯著(P = 0.017)(圖1)。且LncRNA CRNDE表達水平不同的膠質(zhì)瘤患者中預(yù)后存在明顯差異，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE高表達的膠質(zhì)瘤患者生存率明顯低于低表達的患者(P = 0.014)(圖2)，多因素Cox比例風(fēng)險模型的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)LncRNA CRNDE的相對危險度>1 (RR = 1.245)，表明LncRNA CRNDE高表達的患者預(yù)后較低表達的患者預(yù)后差，LncRNA CRNDE的高表達是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后風(fēng)險預(yù)測的獨立危險因素。
[0025]實施例1制備LncRNA CRNDE用于膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的試劑盒(50次反應(yīng))
[0026]1.RNA 穩(wěn)定溶液 50ml
[0027]2.異丙醇 100mL
[0028]3.三氯甲烷 100mL
[0029]4.Trizol50ml
[0030]5.無酶水 IOml
[0031]6.1 μ M隨機逆轉(zhuǎn)錄引物50ul
[0032]7.5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液200ml
[0033]8.1OmM三磷酸堿基脫氧核苷酸IOOul
[0034]9.40U/ μ I RNA 酶抑制劑 500ul
[0035]10.200U/ μ I MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 50ul [0036]11.Premix Ex Taq50ul
[0037]12.10 μ M Lnc RNA CRNDE 特異性引物 30ul
[0038]正向引物5，-CTGCGTGACAACTGAGGA-3’
[0039]反向引物5’ -GTAGGATGCCACTGGAAAT-3’
[0040]13.10 μ M U6SnRNA 特異性引物 3Oul
[0041 ]正向引物為 5’ -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’
[0042]反向引物為5’ -GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。
[0043]實施例2膠質(zhì)瘤組織中Lnc RNA CRNDE的檢測
[0044]1、膠質(zhì)瘤組織的保存:收集待測膠質(zhì)瘤組織存放于盛有RNA穩(wěn)定溶液的凍存管中，放至-80 0C冰箱備用。
[0045]2、組織中RNA的抽提:取適量標本于經(jīng)180°C烘烤6_8h后的研缽中加入液氮研磨標本，研磨至粉末狀后于研缽中加入1ml Trizol研缽標本,研磨成液體狀后用移至tube管，加氯仿200μ 1/mlTrizol于Tube中，用手震蕩15_30s，冰上放置5min，4°C 12000g離心15min ;小心取上層水相入新tube中，加入預(yù)冷的異丙醇0.5ml/mlTrizol混勻,_20°C冰箱靜置20min，4°C 12000g離心10min ;棄上清，加入75% DEPC水稀釋的乙醇l_2ml混勻，40C 7500g離心5min，盡量棄上清，室溫干燥5_10min，加入DEPC水10-20 μ I溶解RNA。分光光度計測RNA的濃度及質(zhì)量，0D260/280比值在1.8-2.0之間，_80°C保存。
[0046]3>LncRNA CRNDE逆轉(zhuǎn)錄:使用Thermo公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。20 μ L逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系如下:
[0047]
【權(quán)利要求】
1.長鏈非編碼RNACRNDE的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的長鏈非編碼RNA CRNDE用于制備膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑，該長鏈非編碼RNA CRNDE的序列見SEQ NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長鏈非編碼RNACRNDE的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的用于制備膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后制劑包括實時熒光定量PCR檢測試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長鏈非編碼RNACRNDE的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑包括進行實時熒光定量PCR的特異性引物: LncRNA CRNDE 正向引物:5’ -CTGCGTGACAACTGAGGA-3’， LncRNA CRNDE 反向引物 5’ -GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長鏈非編碼RNACRNDE的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的實時熒光定量PCR檢測試劑為試劑盒， 該試劑盒包括:(I)從膠質(zhì)瘤組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩(wěn)定溶液、Trizol試劑、三氯甲烷、異丙醇、無酶水；(2)以總RNA為模板將LncRNA CRNDE逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及LncRNA CRNDE所用隨機引物；(3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括LncRNACRNDE實時熒光定量PCR特異性引物、U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物、實時熒光定量SYBR染料、無酶水；LncRNA CRNDE實時熒光定量PCR特異性引物: LncRNA CRNDE 正向引物 5’ -CTGCGTGACAACTGAGGA-3’， LncRNA CRNDE 反向引 物 5’ -GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。 U6snRNA內(nèi)參特異性PCR引物: 正向引物為 5' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'， 反向引物為 5' -GGAACGCTTCACGAATT TG-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK103966339SQ201410225220
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】武明花, 劉長紅, 余志斌, 徐剛, 李桂源 申請人:中南大學(xué)