美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物、試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物、試劑盒及應(yīng)用，其引物由外引物和內(nèi)引物組成，外引物由SEQ?ID?NO.1所示的外引物上游引物和SEQ?ID?NO.2所示的外引物下游引物組成；內(nèi)引物由SEQ?ID?NO.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ?ID?NO.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)美人魚發(fā)光桿菌周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問題，檢測(cè)快速有序，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作規(guī)范，不易出錯(cuò)。擴(kuò)增引物具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。采用內(nèi)置染料的方法，反應(yīng)結(jié)束后不用打開反應(yīng)管，取出后直接肉眼觀察結(jié)果，避免了被擴(kuò)增產(chǎn)物污染后續(xù)待檢樣品，提高了該試劑盒的應(yīng)用可靠性。
【專利說明】美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物、試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，具體是一種采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)養(yǎng)殖魚類致病菌進(jìn)行快速檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于水產(chǎn)病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(PhotobacteriumdamseIae subsp.piscicida)為一種具溶血性的革蘭氏陰性短桿菌，有莢膜，曾被稱為殺魚巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)、美人魚弧菌(Vibrio damsela),寄生感染宿主不具特異性,對(duì)多種養(yǎng)殖魚類均有高致病性，可引起美洲狼自盧、斑點(diǎn)叉尾鮰、日本五條螄、軍曹魚、黃尾螄、金頭鯛等發(fā)病，在國(guó)內(nèi)，已從發(fā)病的大黃魚、半滑舌鰨、卵形鯧鰺、東星斑、龍膽石斑魚等分離到該菌，是養(yǎng)殖魚類的重要致病菌之一，具有很強(qiáng)的傳染性，一旦發(fā)病，可造成很高的死亡率。由于水產(chǎn)動(dòng)物特定的生活環(huán)境和生理特性，病害一旦發(fā)生，很難控制，往往造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物疾病，病原的早期檢測(cè)與及時(shí)有效的預(yù)防治療尤為重要。目前對(duì)于魚類美人魚發(fā)光桿菌的檢測(cè)，主要采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定，血清學(xué)反應(yīng)及PCR檢測(cè)技術(shù)尚未建立，細(xì)菌分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng)，成 本高，多以殺死水產(chǎn)動(dòng)物為前提，操作復(fù)雜，需要專業(yè)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，養(yǎng)殖生產(chǎn)中急需一種能夠應(yīng)用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的、快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的美人魚發(fā)光桿菌檢測(cè)技術(shù)及其產(chǎn)品。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是2000年建立的一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其特征是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，在等溫條件(60~65°C )放置30~60min即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)液中加入核酸染料SYBR Green I或鈣黃綠素，若有核酸擴(kuò)增即可顯示顏色反應(yīng)，即時(shí)得到檢測(cè)結(jié)果。LAMP的核心技術(shù)為特異性基因片段的選取及其引物的設(shè)計(jì)，弓丨物不同，所建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)在反應(yīng)準(zhǔn)確性、特異性、靈敏性方面也有所不同。目前尚未有關(guān)于美人魚發(fā)光桿菌LAMP檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒。
[0006]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)過程能夠快速有序進(jìn)行，2h內(nèi)即可完成所有檢測(cè)操作，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作規(guī)范，對(duì)魚體損傷小的、操作簡(jiǎn)便的不易出錯(cuò)的一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0008]一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物，是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0009]一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒，包括:
[0010](I)樣品預(yù)處理液，其組成為 pH = 8.0 的 20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA，體積濃度為1.2% Triton X-100，溶劑是蒸餾水；
[0011]⑵DEPC 水；
[0012](3) LAMP反應(yīng)液，24 μ I LAMP反應(yīng)液的組成為:2.5 μ IlOX反應(yīng)緩沖液；3μ I濃度為2.5mmol/L的dNTP ; I μ I濃度為8U/ μ I的Bst DNA聚合酶；I μ I濃度為5 μ mol/L的由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，1μ I濃度為5 μ mol/L的由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，1μ I濃度為40 μ mol/L的由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物；4 μ 11.6mol/L的甜菜堿；1 μ I鈣黃綠素與錳離子形成的配合物、8.5μ I DEPC水；
[0013](4)陽(yáng)性對(duì)照液，所述陽(yáng)性對(duì)照液為I μ g/ml的美人魚發(fā)光桿菌基因組DNA ;
[0014](5)無(wú)菌封裝的FTA膜片、研磨棒若干。
[0015]上述一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0016](I)取待檢樣品組織加入100 μ I樣品預(yù)處理液,研磨棒研磨,煮沸后靜置IOmin,得到上清液；
[0017](2)將FTA膜片在步驟(1)獲得的上清液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥；另取兩片F(xiàn)TA膜片分別在DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，作為陰性對(duì)照膜片和陽(yáng)性對(duì)照膜片;
[0018](3)將步驟⑵獲得的膜片分別加入100 μ I DEPC /K，震蕩洗滌3~5min ;從洗滌液中取出膜片，分別放入盛有24 μ I LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中，置于60-65°C條件下保溫40~60min，得到陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)液；
[0019](4)陰性對(duì)照呈橙色，陽(yáng)性對(duì)照呈綠色，根據(jù)檢測(cè)液顏色判斷是否含有美人魚發(fā)光桿菌。
[0020]待檢樣品為魚血液、魚脾、魚腎組織或細(xì)菌。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0022](I)本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)美人魚發(fā)光桿菌周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問題，使檢測(cè)過程能夠快速有序進(jìn)行，2h內(nèi)即可完成所有檢測(cè)操作，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)過程的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，操作規(guī)范，不易出錯(cuò)。
[0023] (2)本發(fā)明依據(jù)優(yōu)選的美人魚發(fā)光桿菌IGS2 (AJ535849.1)基因所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物能有效檢測(cè)美人魚發(fā)光桿菌，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。
[0024](3)采用內(nèi)置染料的方法，反應(yīng)結(jié)束后不用打開反應(yīng)管，取出后直接肉眼觀察結(jié)果，避免了被擴(kuò)增產(chǎn)物污染后續(xù)待檢樣品，提高了該試劑盒的應(yīng)用可靠性。
[0025](4)基于對(duì)取樣方法的改進(jìn)，不經(jīng)過細(xì)菌培養(yǎng)，僅需取少量魚類血液等樣品即可進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了微創(chuàng)取樣，尤其適用于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的魚類。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0027]圖2為美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果圖。[0028]圖3為美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果圖。
[0029]圖4為美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒靈敏性檢測(cè)結(jié)果圖。
[0030]圖5為美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒特異性檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，下面的實(shí)施例并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0032]本發(fā)明所用儀器及試劑:
[0033]電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自北京三二八科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自SIGMA公司；Bst DNA聚合酶、IOX反應(yīng)緩沖液、dNTP購(gòu)自NEB公司；引物SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4均由上海生工生物工程有限公司合成；DEPC水、Tris,Triton X-100購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；甜菜堿、鈣黃綠素購(gòu)自SIGMA公司；FTA膜片購(gòu)自通用電氣醫(yī)療公司(GE healthcare) ;EDTA、 硫酸錳為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0034]鈣黃綠素與錳離子形成的配合物配比為0.05mmol/L鈣黃綠素和0.6mmol/L錳離子。
[0035]美人魚發(fā)光桿菌基因組DNA采用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒(天根的快速DNA提取檢測(cè)試劑盒KG203)從純培養(yǎng)的美人魚發(fā)光桿菌菌液中提取。(美人魚發(fā)光桿菌是從患病豹紋鰓棘鱸脾臟、腎臟中提取，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化特性分析及以16S rDNA為遺傳標(biāo)記的系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為美人魚發(fā)光桿菌)
[0036]本發(fā)明可用于檢測(cè)魚血液、魚脾、魚腎組織是否感染美人魚發(fā)光桿菌，也可用于檢測(cè)水體中是否含有美人魚發(fā)光桿菌或某菌液是否為美人魚發(fā)光桿菌。
[0037]實(shí)施例1
[0038]一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物，是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0039]實(shí)施例2
[0040]一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒，(以檢測(cè)8個(gè)樣品的包裝為例)包括:
[0041](1)8個(gè)盛有樣品預(yù)處理液的采樣管，每管內(nèi)有100 μ I樣品預(yù)處理液，樣品預(yù)處理液的組成為 pH = 8.0 的 20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA,體積濃度為 1.2% TritonX-100，溶劑是蒸餾水；
[0042](2)洗滌管10個(gè)，每管內(nèi)含100 μ I DEPC水
[0043](3)反應(yīng)管10個(gè)，每管含24 μ I LAMP反應(yīng)液，其組成為:2.5 μ IlOX反應(yīng)緩沖液、3 μ I濃度為2.5mmol/L的dNTP、I μ I濃度為8U/ μ I的Bst DNA聚合酶；I μ I濃度為5 μ mol/L的由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，I μ I濃度為5 μ mol/L的由SEQ IDN0.2所示的外引物下游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物；4μ 11.6mol/L的甜菜堿；1 μ I鈣黃綠素與錳離子形成的配合物、8.5 μ I DEPC水；
[0044](4)陽(yáng)性對(duì)照管I個(gè)，內(nèi)含10 μ I濃度為I μ g/ml的美人魚發(fā)光桿菌基因組DNA的陽(yáng)性對(duì)照液；
[0045](5)無(wú)菌封裝的FTA膜片、研磨棒若干。
[0046]實(shí)施例3
[0047]美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法的建立(使用實(shí)施例2的試劑盒)
[0048](I)模板制備:采用DNA提取試劑盒(天根的快速DNA提取檢測(cè)試劑盒KG203)提取的純培養(yǎng)的美人魚發(fā)光桿菌基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照液，以純培養(yǎng)的美人魚發(fā)光桿菌菌液，作為檢測(cè)樣品，測(cè)試所建立檢測(cè)方法的可行性。
[0049]⑵引物設(shè)計(jì)合成
[0050]采用BLAST軟件分析美人魚發(fā)光桿菌基因序列，篩選出美人魚發(fā)光桿菌Photobacterium damseIae subsp.piscicida IGS2 (AJ535849.1)基因的核酸序列，根據(jù)LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)該片段設(shè)計(jì)出LAMP引物并合成，所用引物如下:[0051]SEQ ID N0.1:5’ ACTCTTTCTTAGGATAAGAAAGGT3’
[0052]SEQ ID N0.2:5’ ACCACTTTTTAATAACTCTCAGAG3’
[0053]SEQ ID N0.3:5’ GATCGAACCGCTGACCTCTTCttttAATTTGGGGCTATAGCTCAG3’
[0054]SEQ ID N0.4:5’ ATTTTCTGCACGGATTCGCAggatccTCGACAAAGCGATTCAACG3’
[0055](3)檢測(cè)過程
[0056]①將FTA膜片在步驟(1)所述的純培養(yǎng)的美人魚發(fā)光桿菌菌液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥；另取兩片F(xiàn)TA膜片分別在DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，作為陰性對(duì)照膜片和陽(yáng)性對(duì)照膜片；
[0057]②將步驟①獲得的膜片分別加入盛有100μ I DEPC水的洗滌管中，震蕩洗滌4min ;從洗滌液中取出膜片，分別放入盛有24 μ I LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中，置于65°C條件下保溫50min，得到陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)液；
[0058]③觀察反應(yīng)管中液體的顏色，陰性對(duì)照呈橙色，陽(yáng)性對(duì)照呈綠色，根據(jù)檢測(cè)液顏色判斷是否含有美人魚發(fā)光桿菌。結(jié)果見圖1(圖1中I為美人魚發(fā)光桿菌菌液檢測(cè)結(jié)果，反應(yīng)液呈明顯的綠色；2為陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)液呈明顯的綠色；3為陰性對(duì)照，反應(yīng)液呈橙色)。
[0059](4) LAMP反應(yīng)條件及優(yōu)化
[0060]設(shè)定反應(yīng)管中弓丨物混合液外弓丨物與內(nèi)弓丨物濃度比分別為1: 1、1: 2、1: 4、1: 6、1: 8、1:10、1:12，反應(yīng)時(shí)間從 20min、25min、30min、40min、50min、60min，反應(yīng)溫度為 54°C、57°C、60°C、63°C、65°C、68°C，選擇最佳反應(yīng)參數(shù)建立完善的LAMP檢測(cè)技術(shù)。最終確定的反應(yīng)參數(shù)如下:
[0061]外引物與內(nèi)引物的濃度比為1:8，即外引物SEQ ID N0.1、SEQ ID N02濃度為5ymol/L，內(nèi)引物 SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4 引物濃度為 40 μ mol/L，將反應(yīng)管置于60_65°C保溫40-60min，得到檢測(cè)液，直接觀察檢測(cè)液顏色，判定反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性或者陰性。
[0062]實(shí)施例4.美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0063](I)提取待檢樣品DNA
[0064]在無(wú)菌條件下抽取待檢魚血液100 μ 1，加入100 μ I樣品預(yù)處理液，煮沸后靜置IOmin,得到上清液；
[0065](2)將FTA膜片在步驟⑴獲得的上清液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，另取兩片F(xiàn)TA膜片，分別在DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，作為陰性對(duì)照膜片和陽(yáng)性對(duì)照膜片;
[0066](3)將步驟⑵獲得的膜片分別加入100 μ I DEPC /K，震蕩洗滌4min ;從洗滌液中取出膜片，分別放入盛有24 μ I LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中，置于63°C條件下保溫50min，得到陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)液；
[0067](4)取出反應(yīng)管，直接觀察反應(yīng)管內(nèi)液體顏色呈綠色，判斷是含有美人魚發(fā)光桿菌。
[0068]實(shí)施例5.美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0069](I)提取待檢樣品DNA
[0070]在無(wú)菌條件下，取一個(gè)健康魚脾lOOmg，一個(gè)人工感染美人魚發(fā)光桿菌后發(fā)病的魚脾lOOmg，一個(gè)健康魚腎lOOmg，一個(gè)人工感染美人魚發(fā)光桿菌后發(fā)病的魚腎lOOmg，分別用研磨棒研磨，煮沸后靜置lOmin，得到上清液；
[0071](2)將4個(gè)FTA膜片分別在步驟(1)獲得的上清液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥；另取兩片F(xiàn)TA膜片分別在DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，作為陰性對(duì)照膜片和陽(yáng)性對(duì)照膜片； [0072](3)將步驟(2)獲得的膜片分別加入100 μ I DEPC水，震蕩洗滌3min ;從洗滌液中取出膜片，分別放入盛有24 μ I LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中，置于65°C條件下保溫40min，得到陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)液；
[0073](4)取出反應(yīng)管，直接觀察反應(yīng)管內(nèi)液體顏色，健康魚脾和魚腎的反應(yīng)管呈橙色，人工感染美人魚發(fā)光桿菌后發(fā)病的魚脾和魚腎的反應(yīng)管呈綠色，判斷后兩者是含有美人魚發(fā)光桿菌。(結(jié)果見圖2。I為陰性對(duì)照，呈橙色；2為陽(yáng)性對(duì)照，呈綠色；3為人工感染美人魚發(fā)光桿菌發(fā)病后的魚腎臟研磨液檢測(cè)結(jié)果，呈綠色；4為健康東星斑腎臟研磨液檢測(cè)結(jié)果，呈橙色；5為健康魚脾臟研磨液檢測(cè)結(jié)果，呈橙色；6為人工感染美人魚發(fā)光桿菌發(fā)病后的魚脾臟研磨液檢測(cè)結(jié)果，呈綠色。
[0074]實(shí)施例6.美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用
[0075](I)提取待檢樣品DNA
[0076]取純培養(yǎng)的菌液，煮沸后靜置lOmin，得到上清液；
[0077](2)將FTA膜片在步驟(1)獲得的上清液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥；另取兩片F(xiàn)TA膜片分別在DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，作為陰性對(duì)照膜片和陽(yáng)性對(duì)照膜片;
[0078](3)將步驟⑵獲得的膜片加入100 μ I DEPC /K，震蕩洗滌5min ;從洗滌液中取出膜片，分別放入盛有24μ I LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中，置于60°C條件下保溫60min，得到陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)液；
[0079](4)取出反應(yīng)管，直接觀察反應(yīng)管內(nèi)液體顏色呈綠色，判斷所檢樣品是含有美人魚發(fā)光桿菌。結(jié)果見3。I為陽(yáng)性對(duì)照，呈綠色；2為純培養(yǎng)的菌液，呈綠色；3為陰性對(duì)照，呈橙色。
[0080]實(shí)施例7美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度測(cè)定
[0081]將純培養(yǎng)的美人魚發(fā)光桿菌接入TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，以無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，調(diào)整菌液濃度為3X 108cfu/ml，10倍比梯度稀釋，取稀釋好的菌液按照實(shí)施例6所述方法，檢測(cè)梯度稀釋的美人魚發(fā)光桿菌菌液。結(jié)果如圖4所示，樣品I為陰性對(duì)照(呈橙色)，2-9作為模板的美人魚發(fā)光桿菌菌液濃度分別為3X lOkfu/ml (呈橙色)、3X102cfu/ml(呈綠色)、3X103cfu/ml(呈綠色)、3X 104cfu/ml (呈綠色)、3X IO5Cfu/ml (呈綠色)、3X 106cfu/ml (呈綠色)、3X 107cfu/ml (呈綠色)、3X 108cfu/ml (呈綠色)。結(jié)果顯示3X102cfu/ml以上濃度的菌液，均呈現(xiàn)綠色，表明該試劑盒對(duì)美人魚發(fā)光桿菌的最低檢測(cè)濃度為3X102cfu/ml。
[0082]實(shí)施例8.美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)特異性測(cè)試
[0083]分別取純培養(yǎng)并鑒定后的海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、維氏氣單胞菌、諾卡氏菌、美人魚發(fā)光桿菌菌液，按照實(shí)施例6所述方法檢測(cè)以上樣品。檢測(cè)結(jié)果見圖5，樣品1-8分別為陰性對(duì)照(呈橙色)、海豚鏈球菌(呈橙色)、柱狀黃桿菌(呈橙色)、哈維氏弧菌(呈橙色)、維氏氣單胞菌(呈橙色)、諾卡氏菌(呈橙色)、美人魚發(fā)光桿菌(呈綠色)、陽(yáng)性對(duì)照(呈綠色)。樣品7美人魚發(fā)光桿菌及樣品8陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，陰性對(duì)照及其它菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性，證實(shí)該試劑盒具有較好的檢測(cè)特異性。
[0084] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)引物，其特征是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
2.一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒，其特征是包括: (1)樣品預(yù)處理液，其組成為pH= 8.0的20mmol/L Tris-HCl, 2mmol/L EDTA,體積濃度為1.2% Triton X-100，溶劑是蒸餾水；
(2)DEPC 水； (3)LAMP反應(yīng)液，24 μ I LAMP反應(yīng)液的組成為:2.5 μ IlOX反應(yīng)緩沖液；3μ I濃度為2.5mmol/L 的 dNTP ; I μ I 濃度為 8U/ μ I 的 Bst DNA 聚合酶；I μ I 濃度為 5 μ mo I/L 的由 SEQID N0.1所示的外引物上游引物，1μ I濃度為5 μ mol/L的由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，1μ I濃度為40ymol/L的由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物；4 μ 11.6mol/L的甜菜堿；1μ I鈣黃綠素與錳離子形成的配合物、8.5μ I DEPC水； (4)陽(yáng)性對(duì)照液，所述陽(yáng)性對(duì)照液為1μ g/ml的美人魚發(fā)光桿菌基因組DNA ； (5)無(wú)菌封裝的FTA膜片、研磨棒若干。
3.權(quán)利要求2的一種美人魚發(fā)光桿菌快速檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟: (1)取待檢樣品組織加入100μ I樣品預(yù)處理液，研磨棒研磨，煮沸后靜置lOmin，得到上清液； (2)將FTA膜片在步驟(1)獲得的上清液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥；另取兩片F(xiàn)TA膜片分別在DEPC水、陽(yáng)性對(duì)照液中充分潤(rùn)濕后室溫干燥，作為陰性對(duì)照膜片和陽(yáng)性對(duì)照膜片； (3)將步驟(2)獲得的膜片分別加入100μ I DEPC水，震蕩洗滌3~5min ;從洗滌液中取出膜片，分別放入盛有24 μ I LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中，置于60-65°C條件下保溫40~60min,得到陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和檢測(cè)液； (4)陰性對(duì)照呈橙色，陽(yáng)性對(duì)照呈綠色，根據(jù)檢測(cè)液顏色判斷是否含有美人魚發(fā)光桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述待檢樣品為魚血液、魚脾、魚腎組織或細(xì)菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103981270SQ201410225271
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】徐曉麗, 姚學(xué)良, 邵蓬, 張勤, 張振奎 申請(qǐng)人:天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站