黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化方法。以黃瓜(Cucumis?sativum)無菌子葉分離的葉綠體為材料，建立了在適宜體積和葉綠體濃度與表達載體比例下的黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化體系。轉(zhuǎn)化后葉綠體經(jīng)短時孵育、離心、DNase?I消化后進行裂解，以提取的轉(zhuǎn)化葉綠體DNA和RNA為模板進行PCR和RT-PCT鑒定，結(jié)果證明，葉綠體表達載體不僅能高效轉(zhuǎn)入離體葉綠體中，而且在轉(zhuǎn)錄水平能檢測到外源基因的表達。本發(fā)明克服了高等植物細胞內(nèi)葉綠體轉(zhuǎn)化周期長、技術(shù)難和成本高等難題，為高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建和關(guān)鍵元件的功能鑒定以及葉綠體基因表達調(diào)控和細胞工程等基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究提供了有效的新途徑。
【專利說明】黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】:
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及以黃瓜為代表的高等植物離體葉綠體電轉(zhuǎn)化、孵育及檢測等方法。
【【背景技術(shù)】】:
[0002]葉綠體是母系遺傳的植物特有細胞器，在細胞中不僅具有相對獨立的環(huán)境，而且拷貝數(shù)很高，葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化可實現(xiàn)外源基因的定點整合、以原核方式進行基因表達、利于同時轉(zhuǎn)化多個基因和外源基因可穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點，是目前克服核轉(zhuǎn)基因引發(fā)的基因逃逸、生態(tài)環(huán)境污染和食品安全恐慌等科學(xué)瓶頸問題的一種重要途徑。
[0003]在高等植物細胞中有多拷貝，通常使用基因槍才能將外源表達載體打入細胞內(nèi)的部分葉綠體中，若獲得細胞內(nèi)所有葉綠體共同轉(zhuǎn)化狀態(tài)，還需要在篩選壓力逐漸淘汰未轉(zhuǎn)化的葉綠體，經(jīng)過多世代過程最終達到葉綠體同質(zhì)化。由于葉綠體轉(zhuǎn)化存在技術(shù)難、周期長、耗材與儀器昂貴 的問題，極大地限制了這項極具前途技術(shù)的研究與應(yīng)用速度。
[0004]電轉(zhuǎn)化雖然是一種普遍用于單細胞原核生物和真核生物核基因組轉(zhuǎn)化的常用方法，但高等植物離體葉綠體電轉(zhuǎn)化還沒有查閱到可借鑒的成熟技術(shù)及文獻。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】:
[0005]本發(fā)明目的是解決現(xiàn)有組織和細胞水平葉綠體轉(zhuǎn)化操作難、周期長和成功率低的問題，以黃瓜(Cucumis sativum)為材料,提供一種在無菌條件下的黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化、孵育與轉(zhuǎn)化效果鑒定的成套操作方法與試劑配制體系。
[0006]本發(fā)明涉及完整葉綠體分離與轉(zhuǎn)化前后處理、適宜條件與檢測方法的一系列操作實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。離體葉綠體轉(zhuǎn)化最大的優(yōu)勢是效率高和時間短，可以通過轉(zhuǎn)化后瞬時轉(zhuǎn)錄物分析進行多種相關(guān)研究。此方法可普遍用于其他高等植物。
[0007]本發(fā)明提供的黃瓜(Cucumis sativum)離體葉綠體電轉(zhuǎn)化、孵育和轉(zhuǎn)化效果鑒定方法具體步驟包括:
[0008]第1、黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化與孵育:
[0009]第1.1、4°C和無菌條件下，將新鮮提取的黃瓜葉綠體進行離心(1000g/8~IOmin)，用0.3M~0.33M山梨醇溶液重懸葉綠體沉淀后再次離心，重復(fù)這樣的洗滌3~4次。
[0010]第1.2、最后用0.3M~0.33M山梨醇溶液重懸葉綠體，并控制葉綠體懸液濃度為5 ~6X106/mL，冰浴。
[0011]第1.3、取150ul葉綠體溶液至1.5ml離心管中，加入約Iug轉(zhuǎn)化質(zhì)粒(葉綠體表達載體)，混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，以13kV/cm電壓電擊；電擊后迅速向電轉(zhuǎn)化杯中加入葉綠體孵育液，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，以150rpm/min和25°C下避光孵育20分鐘左右，轉(zhuǎn)4°C避光過夜。
[0012]第2、黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化后PCR鑒定:[0013]第2.1、4°C下以1000g/8~IOmin離心收集經(jīng)電轉(zhuǎn)化和孵育的葉綠體，用Iml葉綠
體孵育液重懸葉綠體，然后再離心，重復(fù)2次這樣的洗滌；
[0014]第2.2、取84ul孵育液重懸葉綠體，加入6ul DNaseI和IOul Buffer，25°C消化2h ;加入0.5M EDTA4ul至終濃度為20mM，65°C水浴20min，終止DNase I反應(yīng)；
[0015]第2.3、4°C下1000g/8~IOmin離心收集葉綠體，用0.33M山梨醇洗葉綠體沉淀2~3次，取部分上清作為模板進行PCR，檢測葉綠體外是否殘留轉(zhuǎn)化質(zhì)粒；
[0016]第2.4、向葉綠體沉淀中加入400ul裂解液，65 V水浴20min ；加入200ul5MKAc(pH7.0)，冰浴 25 ~30min ;4°C下 12000rpm離心，取上清并加入 200ul Tris-酚和 200ul氯仿/異戊醇(24:1)，振蕩后12000rpm離心，取上清；加入1/10V3M NaAc和2.5V無水乙醇，-20°C冰箱過夜沉淀核酸；次日12000rpm離心15min，棄上清。70%乙醇洗沉淀2次，37°C溫箱烘干后用含RNase的ddH20溶解葉綠體DNA沉淀。
[0017]第2.5、以提取的葉綠體DNA為模板，依據(jù)第I步中葉綠體表達載體上的外源基因序列設(shè)計引物，以20 μ L總體系和35個循環(huán)進行PCR。
[0018]第3、黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化后RT-PCR鑒定:
[0019]第3.1、在4°C下，以1000g/8~IOmin離心收集經(jīng)電轉(zhuǎn)化和孵育的葉綠體，用Iml葉綠體孵育液重懸葉綠體，然后再離心，重復(fù)2次這樣的洗滌；取150ul孵育液重懸葉綠體，加入等體積葉綠體裂解液混合均勻，65°C處理5min ;加入2M的KC140 μ 1，混合均勻后置于冰上 10-20min ；
[0020]第3.2、4°C下12000rpm離心10min,取上清于新管中，加入等體積苯酹/氯仿/異戍醇(25:24:1)混勻混勻，冰浴30min ;4°C下12000rpm離心10min,取上清于新管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)的混合液，冰浴30min ;4°C下12000rpm離心10min，取上清于新管中，加入1/3體積的8mol/L的LiCl，4°C過夜。
[0021]第3.3、4°C下12000rpml0min,棄上清，室溫下干燥15min ;在冰上分別加入40 μ I DEPC-ddH20、4y 13mol/L NaAC (pH6.0),和 110 μ I 的無水乙醇，混勻后，_20°C 過夜。40C 12000rpml0min,棄上清，室溫下干燥15min ;用DEPC_ddH20溶解RNA沉淀；
[0022]第3.4、取 71 μ I RNA 溶液，加入 0.5 μ I DNase 1-RNase free,8 μ I DNase Ibuffer和0.5μ I RNase抑制劑，37 °C水浴中溫育40min ;向體系中加入120 μ I ddH20、100 μ I氯仿:異戊醇為24:1的混合液和100 μ I水飽和酹,混勻后在4°C下12000rpm下離心IOmin ;將離心后分層的液體中上層清夜取出至另一 EP管，加入1/10體積的3M NaAc和
2.5倍體積的無水乙醇，混勻后，在_20°C下靜置超過4h ；
[0023]第3.5、在4°C和12000rpm下離心15min后棄去上清,加入1111170%乙醇輕輕清洗沉淀，然后在4?和12000rpm下離心10min ;棄上清,風(fēng)干后溶解于20 μ I ddH20中。
[0024]第3.6、以上述第3.5步提取的葉綠體RNA為模板，使用大連寶生物(TAKARA)工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA Synthesis Kit (M-MLV version)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以該cDNA為模板、以轉(zhuǎn)化載體上外源序列為引物用Taq酶進行PCR。為了檢測經(jīng)DNase I消化后RNA中是否殘留了轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，以上述轉(zhuǎn)化組葉綠體RNA為模板，以轉(zhuǎn)化載體上外源序列為引物用Taq酶同時進行PCR，以此作為負對照。 [0025]其中，第I步所述的黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化后孵育液組成包括:
[0026]
【權(quán)利要求】
1.黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化方法，其特征在于該方法的具體步驟包括: 第1、黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化與孵育: 第1.l、4°c和無菌條件下,將新鮮提取的黃瓜葉綠體進行離心1000g/8~IOmin,用.0.3M~0.33M山梨醇溶液重懸葉綠體沉淀后再次離心，重復(fù)這樣的洗滌3~4次； 第1.2、最后用0.3M~0.33M山梨醇溶液重懸葉綠體，并控制葉綠體懸液濃度為5~.6XlOfVmLjKS ; 第1.3、取150ul葉綠體溶液至離心管中，加入Iug轉(zhuǎn)化質(zhì)粒即葉綠體表達載體，混勻后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，以13kV/cm電壓電擊；電擊后迅速向電轉(zhuǎn)化杯中加入葉綠體孵育液，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移到離心管中，以150rpm/min和25°C下避光孵育20分鐘，轉(zhuǎn)4°C避光過夜； 第2、黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化后PCR鑒定: 第2.1、4°C下以1000g/8~IOmin離心收集經(jīng)電轉(zhuǎn)化和孵育的葉綠體,用Iml葉綠體孵育液重懸葉綠體，然后再離心，重復(fù)2次這樣的洗滌； 第2.2、取84ul孵育液重懸葉綠體，加入6ul DNaseI和IOul Buffer，25°C消化2h ;加入0.5M EDTA4ul至終濃度為20mM，65°C水浴20min，終止DNase I反應(yīng)； 第2.3、4°C下1000g/8~IOmin離心收集葉綠體,用0.3M~0.33M山梨醇洗葉綠體沉淀2~3次，取部分上清作為模板進行PCR，檢測葉綠體外是否殘留轉(zhuǎn)化質(zhì)粒； 第2.4、向葉綠體沉淀中加入400ul裂解液，65°C水浴20min ;加入200ul5M KAc，pH7.0，冰浴25~30min ;4°C下12000rpm離心，取上清并加入200ul Tris-酹和200ul氯仿/異戊醇為24:1的混合液，振蕩后12000rpm離心，取上清；加入1/10V3M NaAc和2.5V無水乙醇，_20°C冰箱過夜沉淀核酸；次日12000rpm離心15min，棄上清；70%乙醇洗沉淀2次，.37°C溫箱烘干后用含RNase的ddH20溶解葉綠體DNA沉淀； 第2.5、以提取的葉綠體DNA為模板，依據(jù)第I步中葉綠體表達載體上的外源基因序列設(shè)計引物，以20 μ L總體系和35個循環(huán)進行PCR ； 第3、黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化后RT-PCR鑒定: 第3.1、在4°C下，以1000g/8~IOmin離心收集經(jīng)電轉(zhuǎn)化和孵育的葉綠體，用Iml葉綠體孵育液重懸葉綠體，然后再離心，重復(fù)2次這樣的洗滌；取150ul孵育液重懸葉綠體，加入等體積葉綠體裂解液混合均勻，65°C處理5min ;加入2M的KC140 μ 1，混合均勻后置于冰上.10_20min ； 第3.2、4°C下12000rpm離心10min，取上清于新管中，加入等體積苯酚:氯仿:異戊醇為25:24:1的混合液混勻，冰浴30min ;4°C下12000rpm離心10min,取上清于新管中，加入等體積氯仿:異戊醇為24:1的混合液，冰浴30min ;4°C下12000rpm離心10min，取上清于新管中，加入1/3體積的8mol/L的LiCl，4°C過夜； 第3.3、4°C下12000rpml0min，棄上清，室溫下干燥15min ;在冰上分別加入40 μ IDEPC-ddH20、4y 13mol/L NaAC, pH6.0，和 110 μ I 的無水乙醇，混勻后，-20 °C 過夜；.4°C 12000rpml0min,棄上清，室溫下干燥15min ;用DEPC_ddH20溶解RNA沉淀；
第 3.4、取 71 μ I RNA 溶液，加入 0.5 μ I DNase 1-RNase free>8 μ I DNase I buffer和0.5μ I RNase抑制劑，37°C水浴中溫育40min ;向體系中加入120 μ I ddH20U00y I氯仿:異戍醇為24:1的混合液和100 μ I水飽和酹,混勻后在4°C下12000rpm下離心10min ；將離心后分層的液體中上層清夜取出至另一 EP管，加入1/10體積的3M NaAc和2.5倍體積的無水乙醇，混勻后，在-20 0C下靜置超過4h ； 第3.5、在4°C和12000rpm下離心15min后棄去上清，加入lml70%乙醇輕輕清洗沉淀，然后在4°C和12000rpm下離心10min ;棄上清,風(fēng)干后溶解于20 μ I ddH20中； 第3.6、以上述第3.5步提取的葉綠體RNA為模板，使用大連寶生物工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA Synthesis Kit M-MLV version轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以該cDNA為模板、以轉(zhuǎn)化載體上外源序列為引物用Taq酶進行PCR ;為了檢測經(jīng)DNase I消化后RNA中是否殘留了轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA，以轉(zhuǎn)化組葉綠體RNA為模板，以轉(zhuǎn)化載體上外源序列為引物用Taq酶進行PCR,以此作為負對照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第I步所述的黃瓜離體葉綠體電轉(zhuǎn)化后的孵育液組成包括:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，第2步和第3步所述的黃瓜離體葉綠體裂解液組成包括:
【文檔編號】C12N15/82GK103966255SQ201410227461
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】白艷玲, 劉盛海, 路瑤, 王宏剛, 徐海津, 王勇, 張秀明, 喬明強 申請人:南開大學(xué)