利用dna納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，將生物素分子通過折紙的過程嵌入到DNA納米結(jié)構(gòu)上，所制備的產(chǎn)物為含有多生物素活性位點的DNA納米結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可作為信號放大探針應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域中，從而實現(xiàn)抗原、抗體、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測。
【專利說明】利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于DNA納米技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種將生物素分子通過折紙方式嵌入到DNA納米結(jié)構(gòu)上從而制備出信號放大探針，通過此探針與親和素、鏈霉親和素、或鏈霉親和素標記的辣根過氧化酶的連接從而將此信號放大探針應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域中，從而實現(xiàn)抗原、抗體、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測的分析方法。

【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是導致人類死亡的主要疾病之一，我國的癌癥發(fā)病率成逐年快速上升趨勢。而多數(shù)腫瘤如果早期發(fā)現(xiàn)即有手術(shù)根治機會，因此提高腫瘤的早期檢測水平是改善癌癥臨床療效的關(guān)鍵之一，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療成為當前癌癥臨床治療的重要目標。在癌癥初始階段實現(xiàn)相關(guān)靶蛋白的痕量檢測對于控制癌癥惡化和有針對性治療癌癥無疑具有極為重要的意義。目前癌癥的早期檢測和篩查主要基于高特異性腫瘤標志物的血清學檢測。然而，現(xiàn)有的血清學檢測技術(shù)在靈敏度上存在明顯的不足。因此，如何建立一種高靈敏度又具較好特異性的生物檢測系統(tǒng)是目前分子診斷及癌癥治療等領(lǐng)域亟待解決的生命科學問題。
[0003]新型的納米材料以及結(jié)構(gòu)的制備與應(yīng)用不僅給納米技術(shù)注入了新的活力，也給腫瘤早期診斷的研究及發(fā)展起了巨大的推動作用。目前利用納米顆?；蚣{米結(jié)構(gòu)作為信號放大探針進行生物分子的高靈敏檢測的研究已相當成熟，但尚未充分滿足目前對于腫瘤早期診斷的檢測限要求；近幾年國際上基于DNA分子進行設(shè)計的納米生物復(fù)合結(jié)構(gòu)，因其結(jié)構(gòu)可控、且高效負載等優(yōu)點而有望成為新一代的信號放大探針。在充分利用和發(fā)展納米技術(shù)特有的優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，有望基于DNA納米折紙結(jié)構(gòu)制備聞效及多功能的納米生物復(fù)合結(jié)構(gòu)作為信號放大探針從而大大提升目前的腫瘤早期診斷水平，為抗腫瘤研究工作累計理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法。
[0005]一種利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，將生物素分子通過折紙的過程嵌入到DNA納米結(jié)構(gòu)上，所制備的產(chǎn)物為含有多生物素活性位點的DNA納米結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可作為信號放大探針應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域中，從而實現(xiàn)抗原、抗體、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測。
[0006]所述的DNA納米結(jié)構(gòu)由DNA通過自組裝、延伸、折疊等技術(shù)構(gòu)成的一類納米結(jié)構(gòu)，組成此結(jié)構(gòu)的單鏈DNA，可經(jīng)過如巰基、或生物素、或氨基修飾。
[0007]包括以下幾個步驟:
(1)長鏈DNA溶液中，加入訂書釘鏈DNA，混合均勻后由高溫緩慢降至室溫；
(2)向(I)步驟所得產(chǎn)物中，加入連接分子，混合均勻后水浴中連接；
(3)構(gòu)建基于特定生物分子的檢測系統(tǒng)； (4)將(2)步驟所得產(chǎn)物應(yīng)用到(3)步驟中的檢測系統(tǒng)中；或通過納米載體應(yīng)用到(3)步驟中的檢測系統(tǒng)中。
[0008]所述長鏈DNA為合成的長鏈DNA、或噬菌體M13、或經(jīng)過滾環(huán)擴增技術(shù)所得的長單鏈DNA ;所述訂書釘鏈DNA，為多條能與長鏈DNA互補雜交的單鏈DNA，其中一條或多條為生物素修飾。
[0009]步驟(I)所述高溫為95°C，室溫為25°C，降溫時間為12小時以上。
[0010]所述連接分子為親和素、或鏈霉親和素、或鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶。
[0011]所述與連接分子作用條件為25?37°C，水浴30分鐘以上。
[0012]所述特定生物分子為蛋白、抗原、腫瘤標志物、一段DNA，或RNA序列、多肽或腫瘤細胞。
[0013]所述檢測系統(tǒng)為蛋白質(zhì)微陣列芯片、或基因芯片、或微流控蛋白質(zhì)芯片、或酶聯(lián)免疫吸附試驗，方式為三明治法、或間接法、或競爭法。
[0014]所述納米載體為納米金、或納米銀、或磁性納米粒子。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1 DNA納米折紙結(jié)構(gòu)負載鏈霉未和素原子力顯微鏡下成像結(jié)果；aftf頭處為DNA納米折紙結(jié)構(gòu)；b箭頭處為鏈霉親和素。

【具體實施方式】
[0016]實施例1:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA0取回收所得產(chǎn)物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25。C。產(chǎn)物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2μ LlOmM鏈霉親和素，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入10yLMill1-Q水。取5 μ L滴到平整清潔云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流沖洗，原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0017]實施例2:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物40μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA0取回收所得產(chǎn)物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產(chǎn)物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2μ LlOmM鏈霉親和素-量子點，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0018]利用點樣儀將1yL lyg/mL AFP抗原固定在醛基化玻片表面，4° C環(huán)境下過夜后PBST洗滌三次，加入20 μ L 100 μ g/mL生物素標記的AFP抗體37° C孵育Ih后，PBST洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，PBST洗滌后，熒光顯微鏡下檢測。
[0019]實施例3:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA0取回收所得產(chǎn)物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產(chǎn)物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0020]將lyg/mL AFP抗原固定96孔板表面，4° C環(huán)境下過夜后PBST洗滌三次，加入50 μ L 100 μ g/mL生物素標記的AFP抗體37° C孵育Ih后，洗滌并加入50 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，PBST洗滌后，加入10yL TMB溶液(四甲基聯(lián)苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
[0021]實施例4:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA0取回收所得產(chǎn)物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5 ’ -CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產(chǎn)物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0022]將20 μ L 100 μ g/mL AFP抗體加入到20 μ L lmg/mL的醛基化磁珠中37° C孵育lh, PBST洗滌三次后，加入1yL I μ g/mL AFP抗原，37° C反應(yīng)lh，洗滌后加入生物素化的AFP抗體，連接后洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，洗滌后，力口入10uL TMB溶液(四甲基聯(lián)苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
[0023]實施例5:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA0取回收所得產(chǎn)物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產(chǎn)物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0024]將20 μ L lmg/mL AFP抗體加入到ImL 3nM的納米金中37° C孵育lh，離心洗滌三次后，加入1yL I μ g/mL AFP抗原，37° C反應(yīng)lh，洗滌后加入20 μ L lmg/mL生物素化的AFP抗體，連接后離心洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，洗滌后，加入10uL TMB溶液(四甲基聯(lián)苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
[0025]實施例6:
16 μ L 弓丨物 DNA (I μ Μ，序列為 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3’ )中依次加入 12 μ L 環(huán) DNA(2μΜ，序列為:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L, 10 mM), RCA buffer (4μ L,10X), phi29 polymerase 4 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 40 μ L。然后 30° C 水浴中擴增30 min。所得產(chǎn)物40 μ L經(jīng)過10%PAGE電泳，后割膠回收，去除小片段DNA及多余的環(huán)DNA及引物DNA0取回收所得產(chǎn)物3 μ L，加入mi I IiQ水12 μ L，加入訂書鏈1_3( 100 μ Μ，序列依次為:
5，-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3，
5’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’ -生物素(b1tin)標記 5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 緩沖液(10 X，125mMMg2+)，總體積為20 μ L，溶液充分混合均勻后置入高溫95° C后梯度降溫至25° C。產(chǎn)物稀釋到80 μ LMill1-Q水中，加入2 μ LlOmM鏈霉親和素-HRP，37° Clh后，8000rpm離心5min后，去上清，加入20 μ LMill1-Q水。
[0026]將20 μ L lmg/mL CEA抗體加入到ImL 3nM的納米金中37° C孵育lh，離心洗滌三次后，加入1yL I μ g/mL CEA抗原，37° C反應(yīng)lh，洗滌后加入20 μ L lmg/mL生物素化的CEA抗體，連接后離心洗滌并加入20 μ L上述制備的信號放大載體，37° C孵育lh，洗滌后，加入10uL TMB溶液(四甲基聯(lián)苯胺)，充分顯色后，利用酶標儀檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，將生物素分子通過折紙的過程嵌入到DNA納米結(jié)構(gòu)上，所制備的產(chǎn)物為含有多生物素活性位點的DNA納米結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可作為信號放大探針應(yīng)用于生物檢測領(lǐng)域中，從而實現(xiàn)抗原、抗體、蛋白質(zhì)、DNA、RNA、多肽、細胞等目標物的高靈敏度檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述的DNA納米結(jié)構(gòu)由DNA通過自組裝、延伸、折疊等技術(shù)構(gòu)成的一類納米結(jié)構(gòu)，組成此結(jié)構(gòu)的單鏈DNA，可經(jīng)過如巰基、或生物素、或氨基修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，包括以下幾個步驟: (1)長鏈DNA溶液中，加入訂書釘鏈DNA，混合均勻后由高溫緩慢降至室溫； (2)向(I)步驟所得產(chǎn)物中，加入連接分子，混合均勻后水浴中連接； (3)構(gòu)建基于特定生物分子的檢測系統(tǒng)； (4)將(2)步驟所得產(chǎn)物應(yīng)用到(3)步驟中的檢測系統(tǒng)中；或通過納米載體應(yīng)用到(3)步驟中的檢測系統(tǒng)中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述長鏈DNA為合成的長鏈DNA、或噬菌體M13、或經(jīng)過滾環(huán)擴增技術(shù)所得的長單鏈DNA ;所述訂書釘鏈DNA，為多條能與長鏈DNA互補雜交的單鏈DNA，其中一條或多條為生物素修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，步驟(I)所述高溫為95°C，室溫為25°C，降溫時間為12小時以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述連接分子為親和素、或鏈霉親和素、或鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述與連接分子作用條件為25?37°C，水浴30分鐘以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述特定生物分子為蛋白、抗原、腫瘤標志物、一段DNA，或RNA序列、多肽或腫瘤細胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述檢測系統(tǒng)為蛋白質(zhì)微陣列芯片、或基因芯片、或微流控蛋白質(zhì)芯片、或酶聯(lián)免疫吸附試驗，方式為三明治法、或間接法、或競爭法。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述根據(jù)權(quán)利要求3所述利用DNA納米折紙結(jié)構(gòu)作為信號放大探針的檢測分析方法，其特征在于，所述納米載體為納米金、或納米銀、或磁性納米粒子。
【文檔編號】C12Q1/68GK104133053SQ201410229096
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】何丹農(nóng), 顏娟, 宋世平, 樊春海 申請人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國家工程研究中心有限公司