一種棉花抗黃萎病est-ssr分子標記及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，其創(chuàng)新點在于：棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記包括抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191、抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197和抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235三個分子標記。利用本發(fā)明的這套EST-SSR引物對一套黃褐棉導入系進行基因型鑒定，同時調(diào)查抗黃萎病性狀，結果檢測到三個分子標記NTU191、NTU197、NTU235與棉花抗黃萎病性相關；本發(fā)明還可以對棉花材料進行黃萎病抗性檢測，從而區(qū)分抗黃萎病和感黃萎病的兩類不同棉花。
【專利說明】—種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種棉花抗黃萎病分子標記,尤其涉及一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，本發(fā)明還涉及這種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記的制備方法，屬于分子標記領域。

【背景技術】
[0002]棉屬{Gossypium L.)包含四個栽培種，即草棉{G.herbaceum),亞洲棉{G.arboreum),陸地棉{G.hirsutum)和海島棉{G.barbadense),是世界上最重要的紡織纖維的來源，而其中絕大多數(shù)棉花產(chǎn)量來自陸地棉栽培種。經(jīng)過長期的人類選育改良，現(xiàn)代陸地棉栽培種具備高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)等諸多適合人類需要的優(yōu)良特性；然而，人類選擇這些優(yōu)良性狀的同時也導致了棉花遺傳多樣性的喪失。有研究表明，現(xiàn)代陸地棉基因庫已經(jīng)十分有限，陸地棉品種的開發(fā)面臨著嚴重的遺傳多樣性的瓶頸。遺傳多樣性狹窄提高了棉花基因庫對生物和非生物脅迫的遺傳脆弱性(genetic vulnerability),即降低了其耐害能力。
[0003]棉花黃萎病(K<9_riici77iw? dahliae kleb.)是棉花生長過程中最具破壞力的病害之一。隨著我國80年代棉花枯萎病得到有效控制，棉花黃萎病危害顯得尤為突出。自1993年以來,黃萎病危害逐年加重,發(fā)病面積占全國植棉面積的一半，每年損失皮棉
7.5-10萬t，現(xiàn)已成為棉花高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙。防治棉花黃萎病最為經(jīng)濟、安全、有效的方法就是選育和種植抗病品種。目前我國高抗黃萎病的抗源材料缺乏，抗性遺傳方式迄今尚有爭議。棉屬有45個二倍體種，5個異源四倍體種，形成一個單系群，這些野生棉提供了改良陸地棉的巨大資源。棉花育種家做了大量的嘗試并取得了許多進展，例如龐朝友等收集了 155份棉屬種間雜交漸滲系，對主要農(nóng)藝性狀的鑒定結果表明，不同野生種在陸地棉優(yōu)質(zhì)纖維、抗病、抗逆和抗蟲種質(zhì)改良上發(fā)揮了不同的作用，比如，斯特提棉、蓬蓬棉具有耐黃萎病的基因資源；他們還利用分子標記高效篩選了 18份優(yōu)質(zhì)纖維特異種質(zhì)和4份耐枯黃萎病特異種質(zhì)。前人研究表明，野生棉、半野生棉、海島棉及棉屬近緣植物，含有較豐富的抗黃萎病基因。利用遠緣雜交將野生棉、半野生棉種系中的抗黃萎病種質(zhì)轉育到陸地棉中，可以創(chuàng)造出豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的棉花種質(zhì)供育種利用。如何將這些基因轉育到陸地棉，創(chuàng)造高抗黃萎病的抗源是抗黃萎病育種的重要內(nèi)容。
[0004]然而，棉花抗黃萎病常規(guī)育種進展緩慢，不能滿足生產(chǎn)的需求。棉花的許多重要性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，這些微效多基因在染色體上的位置稱為數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)。數(shù)量性狀表現(xiàn)為連續(xù)變異,其遺傳研究如數(shù)量性狀的基因數(shù)目、染色體位置及效應，很難從性狀本身的表型分布來確定。傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學只能借助數(shù)理統(tǒng)計方法，將復雜的多基因系統(tǒng)作為一個整體，用平均值和方差來表示數(shù)量性狀的遺傳特征，但無法區(qū)別單個QTL的效應、位置及相互作用，從而限制了數(shù)量性狀的遺傳操作和應用。
[0005]隨著分子生物學技術的深入發(fā)展，利用DNA分子標記構建遺傳圖譜并開展QTL定位有了飛躍的發(fā)展。QTL定位即通過分析整個染色體組的DNA標記和數(shù)量性狀表型值的關系，從而將QTL逐一定位到染色體的相應位置，并估計其遺傳效應。隨著分子標記的不斷開發(fā)，棉花的遺傳圖譜日益飽和，棉花的QTL定位也在不斷深入發(fā)展，在QTL定位的基礎上標記輔助選擇(Marker-assisted Select1n, MAS)隨之開展,這是DNA標記最重要的運用之一，可以為育種實踐提供許多便利。
[0006]近十余年來基因組研究迅速發(fā)展，現(xiàn)有的棉花SSR標記是基于基因組序列或隨機的EST序列開發(fā)而來，即來自基因組中隨機選擇的多態(tài)性位點，在QTL定位中具有較大的隨機性。近年來，越來越多的不同棉種大規(guī)模的EST測序和公開釋放，包括陸地棉{G.hirsu turn),雷蒙德氏棉{G.raimondii),亞洲棉(P.arboreum),海島棉{G.arbadense),草棉{G.herbaceum)。與此同時,也開展了大量的基于EST的SSR引物開發(fā)；然而未見專門針對抗病EST的引物開發(fā)。雖然棉花的EST釋放越來越多，但功能基因鑒定相對滯后。
[0007]因此迫切需要開發(fā)棉花抗病EST-SSR分子標記，提高分子標記輔助選擇的效率，以發(fā)現(xiàn)更多的育種有利等位基因，并將這些有利的等位基因聚合在一起，從而實現(xiàn)更高效的育種。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，以解決目前迫切需要開發(fā)棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，提高分子標記輔助選擇的效率，以發(fā)現(xiàn)更多的育種有利等位基因，并將這些有利的等位基因聚合在一起，從而實現(xiàn)更高效的育種。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供這種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記的制備方法。
[0010]本發(fā)明采用的技術方案為:一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，其創(chuàng)新點在于:所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記包括抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191、抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197和抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235三個分子標記。
[0011]進一步的，所述抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191的引物核苷酸序列如下:
正向引物:5’ -CAGGTAITTGATGGCAGATG-3’，
反向引物:5 ’ -CCCTGCTTCTCAATTTCTTG-3，。
[0012]進一步的，所述抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197的引物核苷酸序列如下:
正向引物:5 ’ -TCACCATTGTCGTATTCAGC-3，，
反向引物:5 ’ -CGTACCCATTAATTTCCCTG-3 ’。
[0013]進一步的，所述抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235的引物核苷酸序列如下:
正向引物:5 ’ -TGGTTATGCAGAGTTCAACG-3，，
反向引物:5 ’ -CCTCCACCTATGGTTCTTTG-3，。
[0014]本發(fā)明提供的這種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記制備方法，具體包括以下步驟:
(1)在擬南芥基因組中發(fā)掘抗病基因序列，調(diào)取相應擬南芥基因序列；
(2)將獲取的擬南芥基因序列與棉花EST庫進行比對，找到對應的棉花轉錄組拼接序列；
(3)使用MISA和primerf開發(fā)目標引物，搜索標準為SSR長度不小于18bp，引物長度為18?25bp，產(chǎn)物大小為100?500bp，TM值為55?59°C ； (4)將目標引物與已開發(fā)的棉花SSR引物序列進行比對，然后提取相關信息，開發(fā)抗黃萎病EST-SSR引物。
[0015]優(yōu)選的，所述步驟(3)中的引物長度為20bp。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟(3)中的TM值為57°C。
[0017]本發(fā)明的有益效果:利用本發(fā)明的這套EST-SSR引物對一套黃褐棉導入系進行基因型鑒定，同時調(diào)查抗黃萎病性狀，結果檢測到三個分子標記NTU191、NTU197、NTU235與棉花抗黃萎病性相關；本發(fā)明還可以對棉花材料進行黃萎病抗性檢測，從而區(qū)分抗黃萎病和感黃萎病的兩類不同棉花。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步的說明。
[0019]圖1為分子標記NTU191、NTU197、NTU235對6份已知抗黃萎病水平材料的鑒定。

【具體實施方式】
[0020]下面的實施列可以使本專業(yè)技術人員更全面的理解本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
[0021]實施例1
一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，包括抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191、抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197和抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235三個分子標記；
抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191的引物核苷酸序列如下:
正向引物:5’ -CAGGTAITTGATGGCAGATG-3’，
反向引物:5 ’ -CCCTGCTTCTCAATTTCTTG-3，。
[0022]抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197的引物核苷酸序列如下:
正向引物:5 ’ -TCACCATTGTCGTATTCAGC-3，，
反向引物:5 ’ -CGTACCCATTAATTTCCCTG-3 ’。
[0023]抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235的引物核苷酸序列如下:
正向引物:5 ’ -TGGTTATGCAGAGTTCAACG-3，，
反向引物:5 ’ -CCTCCACCTATGGTTCTTTG-3，。
[0024]本實施例抗黃萎病EST-SSR分子標記的制備方法:
(I)在擬南芥信息資源網(wǎng)站(The Arabidopsis Informat1n Resource, TAIR,網(wǎng)址為http://www.arabidopsis.0rg/)發(fā)掘抗病基因序列,調(diào)取相應序列。
[0025](2)將獲取的擬南芥基因序列與棉花EST庫(網(wǎng)址為http://www.agcol.arizona.edu/cg1-bin/pave/Cotton/index, cgi)進行比對,找到對應的棉花轉錄組拼接序列(Contigs)0
[0026](3)使用 MISA (網(wǎng)址為 http://pgrc.1pk-gatersleben.de/misa/)和primer3 (網(wǎng)址為http://frod0.w1.mit.edu/)開發(fā)引物，搜索標準為SSR長度不小于18bp,引物長度為18?25bp，產(chǎn)物大小為100?500bp，TM值為55?59°C。
[0027](4)利用BLAST與棉花分子標記數(shù)據(jù)庫(Cotton marker database, CMD,網(wǎng)址為http://www.cottonmarker.0rg/)的已開發(fā)的棉花SSR引物序列比對,然后提取相關信息以去冗余，進而開發(fā)了抗病EST-SSR引物。
[0028]利用這套EST-SSR引物對一套黃褐棉導入系進行基因型鑒定，同時調(diào)查抗黃萎病性狀，結果檢測到三個分子標記NTU191、NTU197、NTU235與棉花抗黃萎病性相關，因此可以用于區(qū)分抗黃萎病及感黃萎病棉花材料。
[0029]如圖1所示:選取6份已知抗黃萎病水平的棉花材料(每個標記擴增的6份材料從左到右分別指感黃萎病棉花材料“蘇22”，“TM-1”，“TO94042”，以及抗黃萎病棉花材料“山東小光絮”，“完紫中棉”，“雷蒙德氏棉”，通過基于本實施例的最左側分子標記NTU191、中間部分NTU197、最右側NTU235進行檢測，可以將這6份材料抗黃萎病和感黃萎病兩類棉花進行區(qū)分。
[0030]序列表
<HO >南通大學
<120 > 一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記
<160 > 6
<210 > I
<211 > 20
<212 > DNA
<213 >棉花
<400 > caggtatttg atggcagatg
<210 > 2
< 211 > 20
<212 > DNA
<213 >棉花
<400 > ccctgcttct caatttcttg
<210 > 3
<211 > 20
<212 > DNA
<213 >棉花
<400 > tcaccattgt cgtattcagc
<210 > 4
<211 > 20
<212 > DNA
<213 >棉花
<400 > cgtacccatt aatttccctg
<210 > 5
<211 > 20
<212 > DNA
<213 >棉花
<400 > tggttatgca gagttcaacg
<210 > 6<211 > 20
<212 > DNA
<213 >棉花
<400 > cctccaccta tggttctttg。
【權利要求】
1.一種棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記，其特征在于:所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記包括抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191、抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197和抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235三個分子標記。
2.根據(jù)權利要求1所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記引物，其特征在于:所述抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU191的引物核苷酸序列如下: 正向引物:5’ -CAGGTAITTGATGGCAGATG-3’， 反向引物:5’ -CCCTGCTTCTCAATTTCTTG-3’。
3.根據(jù)權利要求1所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記引物，其特征在于:所述抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU197的引物核苷酸序列如下: 正向引物:5’ -TCACCATTGTCGTATTCAGC-3’， 反向引物:5’ -CGTACCCATTAATTTCCCTG-3’。
4.根據(jù)權利要求1所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記引物，其特征在于:所述抗黃萎病EST-SSR分子標記NTU235的引物核苷酸序列如下: 正向引物:5 ’ -TGGTTATGCAGAGTTCAACG-3，， 反向引物:5 ’ -CCTCCACCTATGGTTCTTTG-3，。
5.一種權利要求1所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記引物的制備方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)在擬南芥基因組中發(fā)掘抗病基因序列，調(diào)取相應擬南芥基因序列； (2)將獲取的擬南芥基因序列與棉花EST庫進行比對，找到對應的棉花轉錄組拼接序列； (3)使用MISA和primerf開發(fā)目標引物，搜索標準為SSR長度不小于18bp，引物長度為18?25bp，產(chǎn)物大小為100?500bp，TM值為55?59°C ； (4)將目標引物與已開發(fā)的棉花SSR引物序列進行比對，然后提取相關信息去除冗余，開發(fā)抗黃萎病EST-SSR引物。
6.根據(jù)權利要求5所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中的引物長度為20bp。
7.根據(jù)權利要求5所述的棉花抗黃萎病EST-SSR分子標記的制備方法，其特征在于:所述步驟(3 )中的TM值為57 °C。
【文檔編號】C12N15/10GK104404035SQ201410230026
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權日:2014年5月28日
【發(fā)明者】汪保華, 李平, 榮平, 張咪, 王長彪, 蔡茜茜, 付蓉 申請人:南通大學