解脂亞羅酵母、在葡萄采后病害防治中的應(yīng)用及使用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及解脂亞羅酵母、在葡萄采后病害防治中的應(yīng)用及使用方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株分離自江蘇鎮(zhèn)江的葡萄園中，經(jīng)鑒定為解脂亞羅酵母（Yarrowialipolytica），命名為解脂亞羅酵母WSL-01并將其保存于保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)：CGMCCNO.8492，保藏日期為2013年11月21日。使用時(shí)將解脂亞羅酵母活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體，菌體用無(wú)菌水稀釋制備成1.0×108個(gè)/ml的菌懸液。用噴壺噴射至葡萄外表皮，再風(fēng)干，放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。該菌既能防治葡萄采后病害，又能夠高效降解葡萄上的OTA，對(duì)食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】解脂亞羅酵母、在葡萄采后病害防治中的應(yīng)用及使用方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種解脂亞羅酵母菌種iYarrowia)以及該菌種對(duì)葡萄采后病害防治和降解赭曲霉毒素A的應(yīng)用及使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]葡萄是世界范圍內(nèi)最重要的水果之一。但葡萄的采后腐爛損失嚴(yán)重，因處理不足和缺乏適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)防止腐爛和衰老，每年在貯藏過(guò)程中都會(huì)損失掉將近30%-40%的葡萄。葡萄采后腐爛主要由致病菌引起，由真菌例如灰霉、青霉、曲霉等引起的采后腐爛嚴(yán)重影響了葡萄的品質(zhì)，安全性，貨架期和市場(chǎng)價(jià)值。即使在冷庫(kù)(0°C )貯藏過(guò)程中，由青霉屬、曲霉屬、鏈格孢屬、灰葡萄孢屬、根霉屬、鏈格孢霉屬等微生物引起的腐爛導(dǎo)致的葡萄采后損失約占產(chǎn)量的39%和價(jià)值的30%。
[0003]致病真菌除了引起水果采后腐爛以外，部分真菌還能產(chǎn)生真菌毒素，嚴(yán)重影響食用者的身體健康。赭曲霉素(Ochratoxins)是曲霉屬和青霉屬的某些種產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B和赭曲霉毒素C等7種結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物。其中赭曲霉毒素A分布較廣且毒性較強(qiáng)，有致畸、致突變、致癌的能力，且具有免疫毒性。2004年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將其劃分為可能的人類(lèi)致癌物，即2B類(lèi)物質(zhì)。自從1996年葡萄汁里檢出該毒素開(kāi)始，赭曲霉毒素陸續(xù)從其他各種葡萄制品中檢出。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，葡萄制品中赫曲霉毒素殘留量一般在0.01~3.4 μ g/kg之間，甜酒中赫曲霉毒素的殘留量在I~3.9 μ g/kg，葡萄汁中赭曲霉毒素的殘留量較高，在1.16~2.32 μ g/kg之間，葡萄干中赭曲霉毒素的殘留量更高，一般超過(guò)40 μ g/kg。
[0004]赭曲霉毒素A(OTA)主要是由某些曲霉屬dpergiJJiAs)和青霉屬產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。OTA是苯丙氨酸與異香豆素結(jié)合體衍生物，分子式為C2tlH18O6ClN,分子量為403.8，為白色針狀晶體，在熒光燈下呈明亮綠色熒光。微溶于水，易溶于極性有機(jī)溶劑。OTA是半抗原，需與大分子物質(zhì)結(jié)合后才具有免疫原性。其具有耐熱性，焙烤只能使其毒性減少20%，蒸煮對(duì)其毒性不具有破壞作用。
[0005]OTA具有多種毒性，尤其具有腎毒性，且有一定致畸、致癌、致突變性，被認(rèn)為是巴爾干地方性腎病的主要因素之一，因此對(duì)動(dòng)物和人體健康會(huì)造成很大的潛在危害。短期試驗(yàn)結(jié)果顯示，OTA對(duì)所有單胃哺乳類(lèi)動(dòng)物的腎臟均有毒性，可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎萎縮或腫大、顏色變灰白、皮質(zhì)表面不平、斷面可見(jiàn)皮質(zhì)纖維性變化；顯微鏡下可見(jiàn)腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化、腎小球透明變性、腎小管壞死等，并伴有尿量減少、血尿素氮升高、對(duì)氨基馬尿酸清除率降低、尿頻、尿蛋白和尿糖增加等腎功能受損導(dǎo)致的生化指標(biāo)的改變，而尿蛋白和尿糖增加表明近曲小管對(duì)蛋白和糖的重吸收功能降低。母親經(jīng)膳食攝入的OTA可分泌至乳汁中，通過(guò)母乳暴露OTA對(duì)嬰兒健康的影響也應(yīng)引起重視。2004年國(guó)際癌癥研究(IARC)將其劃分為人類(lèi)可能致癌物質(zhì)(2B類(lèi))。我國(guó)規(guī)定谷物及其制品中的OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 yg/ kg。
[0006]葡萄及其制品中的赭曲霉毒素主要來(lái)自于水果在貯藏期污染某些能產(chǎn)生赭曲霉毒素的致病霉菌。因此要控制葡萄及制品中的赭曲霉毒素殘留情況，首先要控制葡萄在貯藏期霉菌的污染，減少赭曲霉毒素產(chǎn)生的機(jī)會(huì)；其次要采取措施，去除或降解已經(jīng)產(chǎn)生的赭曲霉毒素。
[0007]由于傳統(tǒng)方法是從控制葡萄在貯藏期霉菌的污染從而防止OTA的產(chǎn)生、去除或降解已經(jīng)產(chǎn)生的OTA兩方面來(lái)控制葡萄及制品中的OTA殘留的，以下從這兩方面來(lái)闡述傳統(tǒng)控制方法存在的問(wèn)題。
[0008]( I)控制葡萄在貯藏期霉菌污染的傳統(tǒng)方法存在的問(wèn)題
低溫貯藏、氣調(diào)貯藏是抑制水果采后病害的有效方法，但兩者都需要相應(yīng)的設(shè)備，在廣大的發(fā)展中國(guó)家，已有的設(shè)備往往不能滿(mǎn)足大多數(shù)水果的需要。另外，有些致病霉菌(包括碳黑曲霉)比較耐低溫，在冷藏情況下仍能夠在水果上生長(zhǎng)，并造成葡萄腐爛，甚至產(chǎn)生霉菌毒素。長(zhǎng)期以來(lái)，控制葡萄采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用殺菌劑，而葡萄在采前經(jīng)常使用灑咯菌腈(flud1xonil)和喃菌環(huán)胺(cyprodinil)進(jìn)行噴灑,在采后忙藏及加工過(guò)程中經(jīng)常使用二氧化硫(SO2)處理[29，3°]。殺菌劑的長(zhǎng)期和大量使用，嚴(yán)重污染環(huán)境，有損于人類(lèi)健康。過(guò)去十多年，公眾和科學(xué)界對(duì)于食品和環(huán)境中農(nóng)藥(尤其殺菌劑)殘毒問(wèn)題的關(guān)注日益增加。美國(guó)國(guó)家科學(xué)院(NAS)的報(bào)道(1987)指出，殺菌劑的應(yīng)用對(duì)人類(lèi)健康造成了危害。全美9種致瘤化合物的銷(xiāo)售量中，殺菌劑占90%左右，在用于食物的全部農(nóng)藥中，殺菌劑構(gòu)成60%的致瘤危險(xiǎn)。這一報(bào)道導(dǎo)致了幾種殺菌劑如克菌丹(captan)和苯菌靈(benomyl)等被美國(guó)環(huán)保機(jī)構(gòu)所禁用，并部分或全部地自動(dòng)退出采后應(yīng)用市場(chǎng)。對(duì)葡萄在采前最常使用的殺菌劑灑咯菌腈(fIud1xonil)和喃菌環(huán)胺(cyprodinil)而言,在澳大利亞等發(fā)達(dá)國(guó)家，它們已被明令禁止在葡萄采收之前60天內(nèi)使用[31]。對(duì)葡萄在采后貯藏及加工過(guò)程中經(jīng)常使用的SO2而言，SO2除了能引起葡萄顏色漂白、產(chǎn)生不良風(fēng)味以外，還能造成食用者的過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)食用者的健康造成傷害[32]。在美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，SO2已被禁止在有機(jī)葡萄上使用[33]。
[0009](2)去除葡萄制品中OTA殘留的傳統(tǒng)方法存在的問(wèn)題
現(xiàn)有葡萄及其制品中OTA的去除方法，如清洗和揀選原料、吸附處理、澄清處理等，使OTA或進(jìn)入清洗用水中或進(jìn)一步富集到吸附材料及澄清后的固態(tài)沉淀中，對(duì)環(huán)境構(gòu)成了潛在威脅；最主要的是這些方法的效果都很有限，很難將葡萄及制品中的OTA殘留量降低到安全限度內(nèi)。另一方面，現(xiàn)有OTA降解方法如輻照、臭氧氧化及添加化學(xué)物質(zhì)處理等，或由于成本昂貴或由于安全性尚未明確，多停留在試驗(yàn)階段，生產(chǎn)中尚未見(jiàn)有實(shí)際應(yīng)用。
[0010]總之，上述方法在葡萄及葡萄制品中赭曲霉毒素的控制中存在著安全性、經(jīng)濟(jì)性、高效性和實(shí)用性低等問(wèn)題。鑒于以上控制葡萄及制品中OTA殘留的傳統(tǒng)方法存在的問(wèn)題，研發(fā)環(huán)保、安全、經(jīng)濟(jì)、高效、實(shí)用，既具有水果病害防治效果、又具有控制OTA殘留的生物技術(shù)，具有重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0011]本發(fā)明中的解脂亞羅酵母WSL-01被認(rèn)為是最安全的酵母之一，研究證明，其能顯著降低葡萄采后病害的發(fā)生，并能夠顯著地降解0ΤΑ。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一株分離自葡萄園的能夠控制葡萄采后病害、并能高效降解OTA的酵母菌株，因其具有的高安全性，利用該菌株可實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄及葡萄制品中OTA的控制。
[0013]本發(fā)明所提供的降解OTA的菌株是從江蘇省鎮(zhèn)江市句容的葡萄園中分離到的，這是一株具有極高活力，對(duì)OTA降解能力很強(qiáng)的菌株，其培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，生長(zhǎng)速度較快，不易變異，安全性高。將其編號(hào)為WSL-01，已將其保藏于位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年11月21日，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.8492。該菌株的5.8SrDNA-1TS基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)該序列與解脂亞羅酵母(/arroffialipolytica )菌基因序列高度同源。
[0014]本發(fā)明同時(shí)提供了一種利用解脂亞羅酵母進(jìn)行葡萄采后病害防治及貯藏保鮮方法；步驟如下:將解脂亞羅酵母)活化、發(fā)酵培養(yǎng),離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成1.0XlO8 CFU/mL的菌懸液；用噴壺噴灑至葡萄外表皮，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫下存放。
[0015]本發(fā)明的解脂亞羅酵母WSL-Ol菌株采用常規(guī)的菌種斜面保藏方法，采用培養(yǎng)基首選為NYDA培養(yǎng)基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，瓊脂2%)，也可以使用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂15~20克，自來(lái)水1000毫升)。在pH
7.(T9.0,26°C~28°C，培養(yǎng)36 h。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可將斜面菌種直接接種至發(fā)酵培養(yǎng)基NYDB(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%)或者PM培養(yǎng)基(酵母浸膏5g，蔗糖10g，蛋白胨5g，麥芽糖2g，蒸餾水100mL)中，pH 7.0~9.0，溫度26°C~28°C，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)4(T48 h。一般在40 h左右可以達(dá)到最大生物量。
[0016]本發(fā)明的解脂亞羅酵母lipolytica) WSL-01,可以明顯的抑制葡萄產(chǎn)生腐爛腐敗的病原菌，防止葡萄采后發(fā)生腐爛，并且具有不產(chǎn)生毒素、可以和化學(xué)殺菌劑共同使用等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛的用于葡萄采后病害的生物防治過(guò)程中，減少采后病害造成的損失。
[0017]本發(fā)明提供的解脂亞羅酵母能夠降解赭曲霉毒素A。
[0018]通過(guò)借助以下實(shí)施實(shí)例將更加詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施實(shí)例的限制。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明解脂亞羅酵母WSL-Ol的5.8S rDNA -1TS區(qū)序列進(jìn)化關(guān)系圖。
[0020]圖2不同濃度的耶羅維亞酵母對(duì)OTA的降解。
[0021]

【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明菌株通過(guò)以下方法得到，從鎮(zhèn)江市句容葡萄園中分離得到。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征試驗(yàn)和ITS堿基序列分析，鑒定為解脂亞羅酵母WSL-01 iYarrowialipolytica WSL-01)。已將其保藏于位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2013年11月21日，保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8492。
[0023] 本發(fā)明的菌株解脂亞羅酵母WSL-Ol菌株(菌株編號(hào)=CGMCC N0.8492)微生物學(xué)特性如下:1.形態(tài)學(xué)特征
(I)在YEro固體培養(yǎng)基平板(酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1000mL,瓊脂20 g，115°C濕熱滅菌20 min)上28°C培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形、邊緣粗糙呈絨毛狀、較濕潤(rùn)、易挑起。細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)橢圓形，單個(gè)分散。
[0024](2)在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，不形成醭，菌液渾濁，有沉淀，鏡檢酵母細(xì)胞呈橢圓形，芽殖。
[0025]生理特性
本發(fā)明菌株碳源能夠同化甘油、甘露醇，不能同化淀粉、麥芽糖、蔗糖、乳糖等。氮源能夠同化硝酸鹽，37°C可以生長(zhǎng)。其生理特性結(jié)果具體見(jiàn)下表1和表2。
[0026]分子生物學(xué)鑒定
對(duì)篩選菌株解脂亞羅酵母WSL-Ol的5.8S rDNA-1TS區(qū)序列分析，在GenBank上檢索，確定為解脂亞羅酵母WSL-01(Zarroffia lipolytica WSL-01)。根據(jù)檢索到的同源菌株，應(yīng)用DNAStar軟件的Mege5.1程序，構(gòu)建生物進(jìn)化關(guān)系樹(shù)如圖1。
[0027]表1解脂亞羅酵母WSL-Ol碳源氮源同化結(jié)果

【權(quán)利要求】
1.解脂亞羅酵母(Jarrowialipolytica) WSL-OI, CGMCC N0.8492。
2.權(quán)利要求1所述的解脂亞羅酵母菌株的用途，其特征在于可以用其對(duì)葡萄進(jìn)行采后病害防治及貯藏保鮮。
3.權(quán)利要求1所述的解脂亞羅酵母進(jìn)行葡萄采后病害防治及貯藏保鮮方法，按照下述步驟進(jìn)行:將解脂亞羅酵母活化、發(fā)酵培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無(wú)菌水稀釋制備成18CFU/mL的菌懸液；用噴壺噴灑至葡萄外表皮，再風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫下存放。
4.權(quán)利要求 書(shū)I所述的解脂亞羅酵母菌株的用途，其特征是能降解赭曲霉素A(OTA)。
【文檔編號(hào)】A23B7/155GK104130953SQ201410231417
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】張紅印, 楊其亞, 王峻峻, 王海英, 張曉云 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)