一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，包括：(1)取斜面菌絲體靈芝菌株，挑取菌絲塊接入種子培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)7-14天，得到種子培養(yǎng)液；(2)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照5％-15％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后培養(yǎng)3-10天，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加1vol％-5vol％的油酸，最終獲得靈芝菌絲體，進(jìn)而提取菌絲體中的靈芝三萜。本發(fā)明工藝簡單、有效，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價值，可成功實現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的，縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率，且對其它的真菌菌絲體發(fā)酵過程優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)和啟迪意義。
【專利說明】一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于靈芝三萜發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]靈芝(Ganoderma lucidum)是擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝菌屬真菌,是我國最著名的高等藥用真菌。靈芝的關(guān)鍵藥效成分是靈芝多糖和靈芝三萜。其中靈芝三萜具有消炎止痛、鎮(zhèn)靜、解毒、保肝、抗艾滋病病毒、抗腫瘤、保肝作用，抑制組胺釋放、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等功能，是靈芝發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0003]現(xiàn)階段，靈芝菌體及其關(guān)鍵藥效成分的產(chǎn)量成為阻礙靈芝產(chǎn)品應(yīng)用的瓶頸。由于液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝具有生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)，目前已成為獲取靈芝及其活性物質(zhì)的最有效方法。近年來，靈芝的液體發(fā)酵技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但如何進(jìn)一步提高靈芝菌絲體或關(guān)鍵藥效成分的產(chǎn)量以降低生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益，己成為加快靈芝產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程函待解決的問題。
[0004]目前研究 表明，茉莉酸甲酯、苯巴比妥、阿司匹林、銅離子和鈣離子都能夠誘導(dǎo)靈芝三萜合成。這些工作為研究靈芝三萜生物合成的調(diào)控機(jī)制提供了很好的材料和表型。但是靈芝三萜發(fā)酵產(chǎn)品作為食品和藥品，必須考慮其發(fā)酵的安全性和經(jīng)濟(jì)性。茉莉酸甲酯本身價格昂貴，苯巴比妥是一種普遍性中樞神經(jīng)抑制藥，阿司匹林是一種解熱鎮(zhèn)痛藥，銅離子
是一種重金屬。
[0005]在靈芝三萜發(fā)酵實際生產(chǎn)中，需要一種具有食品安全級別的，價格低廉的誘導(dǎo)物，而油酸作為一種單不飽和脂肪酸，存在于動植物體內(nèi)，具有食用安全性并且價格較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，該方法工藝簡單、有效，可應(yīng)用于靈芝三萜的工業(yè)化生產(chǎn)中，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價值，且對其它的真菌菌絲體發(fā)酵過程優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)和啟迪意義。
[0007]本發(fā)明的一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，包括:
[0008](I)取在斜面培養(yǎng)基中活化后的斜面菌絲體靈芝菌株，挑取菌絲塊接入種子培養(yǎng)基中，接種后于20-30°C、50-200r/min下培養(yǎng)7_14天，得到種子培養(yǎng)液；
[0009](2)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照5% -15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于20-30°C、50-200r/min下培養(yǎng)3-10天，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加lvol%-5vol% (相對于培養(yǎng)基)的油酸，最終獲得靈芝菌絲體，進(jìn)而提取菌絲體中的靈芝三萜。
[0010]所述步驟(1)中的斜面培養(yǎng)基為:39g馬鈴薯葡萄糖瓊脂溶于IL去離子水中滅菌后即得。
[0011]所述步驟(1)中的靈芝菌株為滬農(nóng)靈芝I號Ganoderma lucidum,已在[上海農(nóng)業(yè)學(xué)報2013年第29卷第5期67-69]公開。[0012]所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基的組分為:豆餅粉20g/L，無水葡萄糖25g/L，七水硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L,自然pH。
[0013]所述步驟⑵中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:豆餅粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸鎂2.25g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，自然pH。
[0014]所述步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)第O天(第O天指接種時同時加入油酸)、第I天、第2天或第3天添加油酸。在種子培養(yǎng)基中加入油酸，一方面提高細(xì)胞膜的通透性，另一方面提高供體能量，增加系統(tǒng)整體的供氧能力。
_5] 有益.效果
[0016](I)本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中加入合適的油酸，在沒有添加其它物質(zhì)，沒有額外能源消耗的條件下，大幅提高了培養(yǎng)基中的溶解氧濃度和細(xì)胞膜的通透性，并且不會影響菌種的生產(chǎn)能力，改變了細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的過程，從而促進(jìn)靈芝菌絲體的發(fā)酵；
[0017](2)本發(fā)明工藝簡單、有效，可應(yīng)用于靈芝三萜的工業(yè)化生產(chǎn)中，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價值，可成功實現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的，縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率，且對其它的真菌菌絲體發(fā)酵過程優(yōu)化具有一定的指導(dǎo)和啟迪意義。 【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0019]實施例1
[0020](I)取在斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂(美國BD公司生產(chǎn))粉末39g溶于IL去離子水中滅菌后即得)中活化后的斜面菌絲體滬農(nóng)靈芝I號菌株，挑取黃豆粒大小的菌絲塊接入IOOmL種子培養(yǎng)基(豆餅粉20g/L，無水葡萄糖25g/L，七水硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L,自然pH)中，接種后于26°C，150r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)14天；
[0021](2)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(豆餅粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸鎂2.25g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，自然pH)中，接種后于26 °C，150r/min下培養(yǎng)10天獲得靈芝三萜。
[0022]步驟(2)中所述的發(fā)酵過程中采用發(fā)酵第O天添加油酸的方法；油酸的添加濃度為 3νο1% ο
[0023]測定靈芝三萜含量:將干燥的靈芝菌絲體研磨成粉末后，Ig菌絲體加入50mL95%的乙醇中浸提14小時后過濾，上清液即為待測樣品溶液。加待測樣品溶液0.1mL于試管中(設(shè)三個重復(fù))，再加5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.5mL，充分混勻后，在60°C水浴中保溫20min，取出后立即冷卻至室溫，然后再加入冰醋fe 5mL搖勾后在550nm處測定樣品的吸光度，樣品的三萜含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算可得。采用該方法測得靈芝三萜的含量為
5.27mg/100mg，與對照(不添加油酸)的1.50mg/100mg相比，提高了 2.51倍。
[0024]實施例2
[0025](I)取在斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂(美國BD公司生產(chǎn))粉末39g溶于IL去離子水中滅菌后即得)中活化后的斜面菌絲體滬農(nóng)靈芝I號菌株，挑取黃豆粒大小的菌絲塊接入IOOmL種子培養(yǎng)基(豆餅粉20g/L，無水葡萄糖25g/L，七水硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L,自然pH)中，接種后于26°C，150r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)14天；
[0026](2)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(豆餅粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸鎂2.25g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，自然pH)中，接種后于26 °C，150r/min下培養(yǎng)10天獲得靈芝三萜。
[0027]步驟(2)中所述的發(fā)酵過程中采用發(fā)酵第I天添加油酸的方法；油酸的添加濃度為 3νο1% ο
[0028]測定靈芝三萜含量:測定方法同實施例1。采用該方法測得靈芝三萜的含量為
3.63mg/100mg,與對照(不添加油酸)的1.50mg/100mg相比，提高了 1.42倍。
[0029]實施例3
[0030](I)取在斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂(美國BD公司生產(chǎn))粉末39g溶于IL去離子水中滅菌后即得)中活化后的斜面菌絲體滬農(nóng)靈芝I號菌株，挑取黃豆粒大小的菌絲塊接入IOOmL種子培養(yǎng)基(豆餅粉20g/L，無水葡萄糖25g/L，七水硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L,自然pH)中，接種后于26°C，150r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)14天；
[0031](2)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(豆餅粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸鎂2.25g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，自然pH)中，接種后于26 °C，150r/min下培養(yǎng)10天獲得靈芝三萜。 [0032]步驟(2)中所述的發(fā)酵過程中采用發(fā)酵第2天添加油酸的方法；油酸的添加濃度為 3νο1% ο
[0033]測定靈芝三萜含量:測定方法同實施例1。采用該方法測得靈芝三萜的含量為1.53mg/100mg,與對照(不添加油酸)的1.50mg/100mg相比，提高了 0.02倍。
【權(quán)利要求】
1.一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，包括: (1)取在斜面培養(yǎng)基中活化后的斜面菌絲體靈芝菌株，挑取菌絲塊接入種子培養(yǎng)基中，接種后于20-30°C、50-200r/min下培養(yǎng)7_14天，得到種子培養(yǎng)液； (2)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照5%-15%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于20-30°C、50-200r/min下培養(yǎng)3_10天，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中添加Ivol % _5vol %的油酸，最終獲得靈芝菌絲體，進(jìn)而提取菌絲體中的靈芝三萜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，其特征在于:所述步驟(1)中的斜面培養(yǎng)基為:39g馬鈴薯葡萄糖瓊脂溶于IL去離子水中滅菌后即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，其特征在于:所述步驟(1)中的靈芝菌株為滬農(nóng)靈芝I號Ganoderma lucidum。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，其特征在于:所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基的組分為:豆餅粉20g/L，無水葡萄糖25g/L，七水硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3.0g/L,自然pH。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:豆餅粉30g/L，可溶性淀粉20g/L，七水硫酸鎂2.25g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，自然pH。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝液體深層發(fā)酵菌絲體中靈芝三萜含量的方法，其特征在于:所述步驟( 2)中發(fā)酵培養(yǎng)第O天、第I天、第2天或第3天添加油酸。
【文檔編號】C12N1/14GK104017852SQ201410236081
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】馮杰, 張勁松, 楊焱, 賈薇, 馮娜, 劉方 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院