一種具有解磷能力的弗村假單胞菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高效解磷的弗村假單胞菌及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過紫外線-等離子體復(fù)合誘變技術(shù)多次復(fù)合誘變，選育出一株高效解磷且穩(wěn)定性好的菌株ZSW-3-5-1a，其分類命名為弗村假單胞菌（ Pseudomonasvranovensis ），已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.8750。該菌株具有高效溶解磷酸鈣和植酸鈣的能力，還能夠產(chǎn)生一定量的吲哚乙酸。用含有該菌株的液體或固體菌劑接種玉米、大豆和芥菜等農(nóng)作物，能夠提高土壤磷的利用率，提高農(nóng)作物產(chǎn)量。
CGMCC No 8750
20140120
【專利說明】一種具有解磷能力的弗村假單胞菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株具有解磷能力的弗村假單胞菌及其應(yīng)用，該菌株用紫外線-等離 子體復(fù)合誘變獲得，能夠提高土壤磷的利用率，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，屬于農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng) 域。

【背景技術(shù)】
[0002] 磷是植物營養(yǎng)三大要素之一，磷供應(yīng)不足已逐漸成為限制農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的最 重要因素之一。土壤中總磷含量充足，含有〇. 02-0. 5%的總磷，但大多以難溶性無機(jī)磷酸鹽 的形式存在（主要是磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵，在堿性土壤中以磷酸鈣為主），只有1%是以植 物能夠直接吸收利用的可溶性磷鹽形式存在。為滿足作物生長需要，全世界每年要向土壤 施用近3000萬噸磷肥，但其中的80%由于吸附、沉積或固定作用成為植物難以吸收利用的 無效磷，成為土壤磷的主體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國有74 %的耕地土壤缺磷，但是很多土壤全磷含量 卻很高。張福鎖等對我國黃土高原7省區(qū)的調(diào)查，土壤有效磷含量平均為6mgP /Kg，而全磷 量則達(dá)到1230mgP/Kg，為有效磷的205倍。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國從1949年到1992年間累計(jì)施入農(nóng) 田的磷肥有7880. 9 X IO4UP2O5)，其中大約有6000 X IO4UP2O5)積累在土壤中沒有被利用， 其當(dāng)季利用率僅為5%?25%。而停留在土壤的磷素又易隨雨水或灌溉流失進(jìn)入水體，導(dǎo)致 水體富營養(yǎng)化污染。因此，如何挖掘土壤潛在的磷庫資源，提高磷的利用率，一直是科學(xué)工 作者研究的熱點(diǎn)課題之一。
[0003] 土壤磷素分為無機(jī)態(tài)磷和有機(jī)態(tài)磷兩大類。礦質(zhì)土壤以無機(jī)磷為主，有機(jī)磷約 占全磷的20%?50%。植物主要利用土壤中的無機(jī)態(tài)磷，其吸收磷素的化學(xué)形態(tài)主要是 H2PCV和HPO廣，土壤中的磷卻主要以非溶態(tài)存在。影響土壤中磷利用率的因素很多，其中 微生物對土壤中磷的利用率影響最大。研究證明：土壤中存在大量的微生物，某些微生物 能夠通過代謝物活化難溶性磷，增加土壤中有效磷含量，促進(jìn)作物生長，具有這種能力的微 生物稱為解磷菌或溶磷菌（phosphate solubilizing microorganisms, PSM)。解磷菌除 了溶解土壤中難溶性或不溶性的磷素外，部分解磷菌還具有解鉀、產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體、 合成ACC脫氨酶等促進(jìn)植物的生長。具有解磷能力的微生物種類很多，目前報(bào)道的解磷菌 主要有有芽孢桿菌屬、歐文氏菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、沙雷氏菌屬、青霉菌屬和黃桿 菌屬等，但對具有解磷能力的弗村假單胞菌的報(bào)道甚少。陳守文等[專利號：CN101851596 B]報(bào)道了一株具有解無機(jī)磷能力的丁酸梭菌，其解無機(jī)磷能力為204.70±25.78mg/L，解 植酸鈣能力為52. 31 ±12. 60mg/L。林啟美等報(bào)道：溶解磷礦粉能力較強(qiáng)的細(xì)菌溶磷能力為 26. 92-43.34mg/L，大多數(shù)真菌則為59. 64-145.36 mg/L。由此可見，目前我國用于生產(chǎn)的 解磷菌株，其解磷能力較低，且應(yīng)用效果不穩(wěn)定，另外，從自然界分離的大部分野生的解磷 菌都存在生長緩慢、存活性弱、有效期短、解磷和促生長能力較低以及對土壤環(huán)境要求苛刻 等缺點(diǎn)，不能滿足作為促生微生物肥料的需要。為此，進(jìn)行野生菌種的改性，打破野生菌種 的正常代謝，使之產(chǎn)生所需要的目標(biāo)代謝產(chǎn)物(如提高解磷、解鉀能力等)、提高其抗性能力 等，要達(dá)到此目的，主要措施就是需要進(jìn)行菌種的選育，如進(jìn)行物理和化學(xué)誘變等。
[0004] 目前，微生物的改性主要有誘變和基因工程的方法，微生物肥料是將活的菌體直 接施入土壤和環(huán)境中，因此在我國的菌肥標(biāo)準(zhǔn)中明確限制基因工程菌的應(yīng)用。射線、核輻射 和化學(xué)誘變是目前普遍使用的誘變育種手段，但長期使用一種誘變劑往往會(huì)使菌株產(chǎn)生抗 性，要想獲得更大的變異就必需采用新的誘變源。等離子體輻射是直接在生物分子上沉積 能量，引起基因突變，從而達(dá)到誘變育種的目的。采用該方法誘變具有突變頻率高、突變譜 廣、生理損傷小等優(yōu)點(diǎn)。另外，采用等離子體和紫外線兩種誘變劑的交替和復(fù)合使用，可以 有效避免使用單一誘變劑產(chǎn)生的誘變飽和效應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，通過紫外線-等離子體復(fù)合誘變 獲得一株具有較高解磷能力的弗村假單胞菌Krafloreflsis)，該菌株還能夠 產(chǎn)生一定量的吲哚乙酸； 本發(fā)明的目的之二是提供含有上述弗村假單胞菌的微生物菌劑及其制備方法； 本發(fā)明的目的之三是提供上述弗村假單胞菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下： 弗村假單胞菌KraflOFefl1Si1S) ZSW-3-5-la，已于 2014 年 1 月 20 日保藏 在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號中國科學(xué)院微生物研究所)，CGMCC No. 8750。
[0007] 本發(fā)明在具體使用時(shí)，是將其制成微生物菌劑。
[0008] 含有弗村假單胞菌KraflOFefl1Si1S) ZSW_3-5_la菌劑的制備方法，包 括以下步驟： 1) 菌種發(fā)酵 ① 將凍存的弗村假單胞菌ZSW-3-5-la在37°C條件下快速解凍，按照0. 5-1%的接種量 接入裝有l(wèi)〇_15ml液體培養(yǎng)基A的試管中，28-32°C，靜置培養(yǎng)8-12小時(shí)，得到ZSW-3-5-la 的一級種子液； 液體培養(yǎng)基A組成為：胰蛋白胨5 g，酵母粉5 g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml，pH值 7. 2 ； ② 二級三角瓶液體培養(yǎng) 將一級種子液按照3-5%的接種量接入裝有50-100ml液體培養(yǎng)基A的三角瓶中， 28-32°C，150-200rpm 培養(yǎng) 8-12 小時(shí)； ③ 發(fā)酵罐發(fā)酵 將ZSW-3-5-la的一級培養(yǎng)液按照5-10%的接種量分別接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基E的發(fā)酵 罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-32°C，培養(yǎng)pH6. 8-7. 5,通氣培養(yǎng)48-72小時(shí)獲得菌懸液，即為 液體解磷菌劑，有效活菌數(shù)可達(dá)2. 1-5 XlO9 CFU/ml ; 發(fā)酵培養(yǎng)基E組成為：葡萄糖10-15g，麩皮5-10g，豆柏30-50g，玉米粉3-5g，（NH4) SO4 0. 2-0. 4g,KH2PO4 5-10g,K2HPO4 0. l-〇. 2g,KCl 0.2-0.5 g ,Ca2(PO4)3 10-13 g,MgSO4 ·7Η20 0· 25-0. 5g，MgCl2 · 6H20 5-10g,水 1000ml, pH 6· 8?7· 5 ; 2) 將秸桿粉、草炭土、麩皮和豆柏粉碎過60目篩，按照質(zhì)量比為 20-30:20-30:5-10:30-50的比例均勻混合再加入30-50%的發(fā)酵培養(yǎng)基Ε，混合均勻后，用 布袋或耐高溫塑料袋裝，1-1. 5Kg/袋，0. IMPa滅菌2-3小時(shí)，取出冷卻即為發(fā)酵固態(tài)基質(zhì)； 3)將步驟1)中得到的菌懸液按照100-200ml/kg的劑量與步驟2)中所得的發(fā)酵固態(tài) 基質(zhì)混勻，28-32°C發(fā)酵5-7天，即得到固體菌劑，菌體密度達(dá)到1-2X109 CFU/g。
[0009] 本發(fā)明還提供了含ZSW-3-5_la菌劑的使用方法，具體使用方法為： 液體菌劑在植物浸種或浸根時(shí)以100-500倍的液體菌劑稀釋液浸泡種子或植物根部 2-5小時(shí)，育苗期或生長期灌根采用1000-5000倍的液體菌劑稀釋液10-40ml/Kg 土壤劑量 澆灌稀釋液，整個(gè)生長期灌根1-3次；固態(tài)菌劑作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-15g/Kg 土壤。
[0010] 所述的液體菌劑稀釋液為步驟1)所得的液體菌劑與發(fā)酵培養(yǎng)基C按照I :50-100 或I :1000-5000的體積比混合制備所得，固體解磷菌劑為步驟3)所得的解磷固體菌劑。 [0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 1) 采用等離子體誘變和紫外誘變多次循環(huán)處理的方法，傳代15次遺傳性狀穩(wěn)定，保證 了突變菌株的穩(wěn)定性； 2) 提供的解磷菌與現(xiàn)有解磷菌相比，既具有較高的解無機(jī)磷能力，又具有一定的解有 機(jī)磷和解鉀能力，能夠分泌吲哚乙酸，具有ACC脫胺酶活性等促進(jìn)植物的生長，提高農(nóng)作物 的產(chǎn)量； 3) 本發(fā)明的菌劑營養(yǎng)要求簡單、易培養(yǎng)、生長周期短、能夠進(jìn)行規(guī)?；拇笊a(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖I :1A為ZSW-3-5-la在培養(yǎng)基上A的菌落形態(tài)；IB為ZSW-3-5-la在培養(yǎng)基B 上的菌落形態(tài)；IC為ZSW-3-5-la的革蘭氏染色照片； 圖2為ZSW-3-5-la傳代過程中解無機(jī)磷能力的穩(wěn)定性測定； 圖3為ZSW-3-5-la系統(tǒng)發(fā)育圖； 圖4為ZSW-3-5-la對土壤速效磷和速效鉀含量的影響：其中圖4A為施入液體或固體 ZSW-3-5-la菌劑對土壤中速效鉀的影響；其中圖4B為施入液體或固體ZSW-3-5-la菌劑對 土壤中速效磷的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 實(shí)施例1 ZSW-3-5-la的誘變篩選 按照本發(fā)明提供的解磷菌株的篩選方法選育解磷能力強(qiáng)的菌株，制備的步驟如下： 1) 以實(shí)驗(yàn)室從植物根際篩選的具有較高解磷能力的ZSW-3作為出發(fā)菌株； 2) 誘變選育 (1)制備出發(fā)菌株ZSW-3的單細(xì)胞懸液 將出發(fā)菌株ZSW-3接種于液體培養(yǎng)基A中，28-32°C，150-180rpm培養(yǎng)8-12小時(shí)，離心， 用無菌生理鹽水洗滌，置于裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩，使其分散成單細(xì)胞的菌懸液； 所述的液體培養(yǎng)基A組成為：胰蛋白胨5-10 g，酵母粉3-5 g，NaCl 5-10 g，蒸餾水 1000ml，pH 值 6. 8-7. 5。
[0015] (2)紫外線誘變 將步驟（I)所得的菌懸液分別調(diào)節(jié)濃度至107CFU/ml，取0. Iml涂布于固體培養(yǎng)基B上， 進(jìn)行紫外誘變，紫外誘變的頻率為15W，照射距離為30cm，照射時(shí)間8min ;28°C靜置培養(yǎng)7 天，挑選28個(gè)透明圈較大的單菌落，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，用鑰藍(lán)比色法測定各菌株的解磷能力， 選擇5株解磷活性最高的菌株，再分別作搖瓶復(fù)篩，選出一株解磷活性高且穩(wěn)定性好的菌 株ZSW-3-5,制成菌懸液用于下一步等離子體的誘變； 所述的搖瓶發(fā)酵復(fù)篩的步驟是：首先對上述分離得到的28個(gè)透明圈直徑D與菌落直徑 d比值較高的菌株接種到IOOml上述的液體培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)12小時(shí)。取5ml菌液接種到 裝有IOOml液體培養(yǎng)基B的250ml的錐形瓶中，28°C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)7天； 所述的液體培養(yǎng)基 B 組成為：葡萄糖 10 g，Ca3(P04)2 5g，MgCl2*6H20 5-8g，MgS04*7H20 0· 25g，KCl 0· 2 g，（NH4)2SO4 0· lg，蒸餾水 IOOOmL, pH 7· 0。
[0016] (3)等離子體誘變 將步驟（2)所得的ZSW-3-5菌株，制成107CFU/ml的菌懸液，取0. Iml均勻涂布于無菌 培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到等離子下面的電極上，調(diào)節(jié)上電極的位置，使得上下電極之間的距 離控制在3_左右，調(diào)節(jié)電壓為3V，電流為0. 5A，使空氣或氬氣放電，得到均勻的空氣或氬 氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電時(shí)間為3min。誘變后立即用無菌生理鹽水或磷酸鹽洗脫，涂 布于固體培養(yǎng)基B上，再進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，挑出一株解磷活性最高的一株菌ZSW-3-5-1，制成 菌懸液用于下一步的誘變；所述的搖瓶復(fù)篩的方法同步驟（2); (4)將步驟（3)所得的菌懸液活菌數(shù)調(diào)至107CFU/ml，循環(huán)重復(fù)紫外線誘變一等離子體 誘變1-2次，最后得到一株解磷活性最高的菌株ZSW-3-5-la。其解磷酸鈣、卵磷脂和植酸鈣 能力比其相應(yīng)的原始菌株分別提高了 129. 1%、11. 01%和79. 01%。ZSW-3-5-la與野生解磷 菌株ZSW-3解磷能力比較見表1。

【權(quán)利要求】
1. 一種具有解磷能力的菌株ZSW-3-5-la，其分類命名為弗村假單胞菌 已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 8750。
2. 含有權(quán)利要求1所述弗村假單胞菌ZSW-3-5-la的微生物菌劑。
3. 權(quán)利要求2所述微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟： 1) 菌種發(fā)酵 ① 將凍存的弗村假單胞菌ZSW-3-5-la在37°C條件下快速解凍，按照0. 5-1%的接種量 接入裝有l(wèi)〇_15ml液體培養(yǎng)基A的試管中，28-32°C，靜置培養(yǎng)8-12小時(shí)，得到ZSW-3-5-la 的一級種子液； 液體培養(yǎng)基A組成為：胰蛋白胨5 g，酵母粉5 g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml，pH值 7. 2 ； ② 二級三角瓶液體培養(yǎng) 將一級種子液按照3-5%的接種量接入裝有50-100ml液體培養(yǎng)基A的三角瓶中， 28-32°C，150-200rpm 培養(yǎng) 8-12 小時(shí)； ③ 發(fā)酵罐發(fā)酵 將ZSW-3-5-la的一級培養(yǎng)液按照5-10%的接種量分別接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基E的發(fā)酵 罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-32°C，培養(yǎng)pH6. 8-7. 5,通氣培養(yǎng)48-72小時(shí)獲得菌懸液，即為 液體解磷菌劑，有效活菌數(shù)可達(dá)2. 1-5X109 CFU/ml ; 發(fā)酵培養(yǎng)基E組成為：葡萄糖10-15g，麩皮5-10g，豆柏30-50g，玉米粉3-5g，（NH4) S040? 2-0. 4g，KH2P04 5-10g，K2HP04 0.1-0 . 2g，KCl 0.2-0.5 g，Ca2(P04)3 10-13 g，MgS04.7H20 0? 25-0. 5g，MgCl2 ? 6H20 5-10g，水 1000ml，pH 6. 8?7. 5 ; 2) 將秸桿粉、草炭土、麩皮和豆柏粉碎過60目篩，按照質(zhì)量比為 20-30:20-30:5-10:30-50的比例均勻混合再加入30-50%的發(fā)酵培養(yǎng)基E，混合均勻后，用 布袋或耐高溫塑料袋裝，1-1. 5Kg/袋，0. IMPa滅菌2-3小時(shí)，取出冷卻即為發(fā)酵固態(tài)基質(zhì)； 3) 將步驟1)中得到的菌懸液按照100-200ml/kg的劑量與步驟2)中所得的發(fā)酵固態(tài) 基質(zhì)混勻，28-32°C發(fā)酵5-7天，即得到固體菌劑，菌體密度達(dá)到1-2X109 CFU/g。
4. 權(quán)利要求1所述弗村假單胞菌在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求2所述微生物菌劑的使用方法，其特征在于：液體菌劑在植物浸種或浸根 時(shí)以100-500倍的液體菌劑稀釋液浸泡種子或植物根部2-5小時(shí)，育苗期或生長期灌根采 用1000-5000倍的液體菌劑稀釋液10-40ml/Kg 土壤劑量澆灌稀釋液，整個(gè)生長期灌根1-3 次；固態(tài)菌劑作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-15g/Kg 土壤。
【文檔編號】C12N1/20GK104371946SQ201410237364
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】朱曉麗, 宋進(jìn)喜, 馬俊杰, 李賀 申請人:西北大學(xué)