腫瘤abl1基因位點分型檢測試劑盒、使用方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒、使用方法及應用，所述檢測試劑盒包括：PCR試劑和LDR試劑，所述的PCR試劑包括一對PCR正向引物和反向引物、雙蒸水、聚合酶、聚合酶配套緩沖液、dNTP和MgCl2；所述正向引物:5’-CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3’；所述反向引物:5’-TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3’。本發(fā)明在測序儀上實現(xiàn)用PCR-LDR技術(shù)檢測ABL1了基因位點，實現(xiàn)PCR-LDR技術(shù)在臨床的實驗。
【專利說明】腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒、使用方法及應用

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領域，特別涉及腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒、使 用方法及應用。

【背景技術(shù)】
[0002] 格列衛(wèi)(伊馬替尼）是一種酪氨酸激酶抑制劑，能抑制慢性粒細胞白血病患者因費 城染色體異常而產(chǎn)生的Bcr-Abl酪氨酸激酶的活性。目前格列衛(wèi)已經(jīng)成為國際上一線治療 慢性期成人Ph+慢性粒細胞性白血病的首選治療方法。然而隨著治療的不斷進行，發(fā)生格 列衛(wèi)耐藥的比率也越來越高，格列衛(wèi)耐藥是腫瘤細胞在格列衛(wèi)作用下，藥物靶基因 c-abl oncogene 1 (ABL1)基因中的某些位點發(fā)生改變，導致這種藥物對酪氨酸激酶的抑制作用下 降或消失。從而喪失抗腫瘤作用。
[0003] 連接酶檢測反應（ligase detection reaction, LDR)是近年來發(fā)展的一種核酸 檢測技術(shù)，是在反應中僅加入一對探針，模板被線性擴增。主要應用于單核苷酸檢測領域， 如單核苷酸多態(tài)性檢測（SNP) (Detection of HLA Polymorphisms by Ligase Detection Reaction and a Universal Array Format: A Pilot Study for Low Resolution Genotyping. Clarissa Consolandi, Elena Busti, Cinzia Pera, et al; Human Immunology (2003) 64,168 - 178)。
[0004] 近幾年，又出現(xiàn)了將LDR技術(shù)和PCR技術(shù)關(guān)聯(lián)使用，以及LDR技術(shù)、PCR技術(shù)和基 因芯片技術(shù)關(guān)聯(lián)用于基因多態(tài)性位點檢測（Norman P. Gerryl et al.，J. Mol. Biol. (1999) 292，251-262;U.S. Pat. Pub. No. 2003/0032016A1)。同時，隨著 LDR 技術(shù)的逐 步成熟，相關(guān)LDR檢測產(chǎn)品也在不斷問世，如腫瘤化療療效及毒副作用檢測的LDR方案，心 腦血管疾病易感基因 LDR檢測等產(chǎn)品。在乙型肝炎病毒耐藥突變中，所有相關(guān)的位點都是 單堿基突變，為LDR技術(shù)的應用提供了可能。目前，已經(jīng)有人成功報道了將乙型肝炎病毒 中的YMDD和'HDD用LDR技術(shù)在測序平臺上進行了成功檢測（A novel method based on ligase detection reaction for low abundant YIDD mutants detection in hepatitis B virus. Zhenxian X. and, Junxua X, et al Hepatology Research 34 (2006) 150 -155)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述的需求，本發(fā)明的目的在于提供了腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑 盒、使用方法及應用，本專利在測序儀上實現(xiàn)用PCR-LDR技術(shù)檢測ABL1 了基因位點，實現(xiàn) PCR-LDR技術(shù)在臨床的實驗，同時也為實現(xiàn)PCR-LDR多基因位點打下基礎，能夠也為實現(xiàn)多 基因相關(guān)位點分型做好準備。
[0006] 本發(fā)明檢測ABL1基因位點的原理：PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過 程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性一退火一延伸三個基 本反應步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時間后，使模板DNA 雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作 準備；②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C 左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板一引物結(jié)合物 在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制 原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性一退火一延伸三過 程，就可獲得更多的"半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。
[0007] LDR技術(shù)原理：LDR是利用高溫連接酶實現(xiàn)對基因多態(tài)性位點的識另lj。高溫連接酶 一旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的堿基錯配， 則連接反應就不能進行。并通過溫控循環(huán)該特異性連接反應可反復進行，達到線性擴增的 效果。
[0008] ABL1檢測序列如SEQ ID NO. 1所示： CCCCAACTACGACAAGTGGGAGATGGAACGCACGGACATCACCATGAAGCACAAGCTGGGCGGGGGCCAGTA CGGGGAGGTGTACGAGGGCGTGTGGAAGAAATACAGCCTGACGGTGGCCGTGAAGACCTTGAAGGAGGACACCATGG AGGTGGAAGAGTTCTTGAAAGAAGCTGCAGTCATGAAAGAGATCAAACACCCTAACCTAGTGCAGCTCCTTGGGGTC TGCACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCA6/7TGAGTTCATGACCTACGGGAACCTCCTGGACTACCTGAGGGAG TGCAACCGGCAGGAGGTGAACGCCGTGGTGCTGCTGTACATGGCCACTCAGATCTCGTCAGCCATGGAGTACCTAGA GAAGAAAAACTTCATCCACAGAGATCTTGCTGCCCGAAACTGCCTGGTAGGGGAGAACCACTTGGTGAAGGTAGCTG ATTTTGGCCTGAGCAGGTTGATGACAGGGGACACC 腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括：PCR試劑和LDR試劑，所述的 PCR試劑包括一對PCR正向引物和反向引物、雙蒸水、聚合酶、聚合酶配套緩沖液、dNTP和 MgCl2 ； 所述正向引物如 SEQ ID NO. 2 所示：5' -CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3' ； 所述反向引物如 SEQ ID NO. 3 所示：5' -TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3'。
[0009] 所述LDR試劑包括相關(guān)位點的熒光探針、檢測探針、雙蒸水、Taq連接酶和連接酶 配套緩沖液；所述聚合酶為Taq酶。
[0010] 所述LDR所用熒光探針序列為如SEQ ID N0. 4所示： 5' -P-TGAGTTCATGACCTACGGGAACCTCTACCTACCTACCTACC-FAM-3'。
[0011] 所述 LDR 所用檢測探針序列為：如 SEQ ID N0. 5 所示 5'-ACCTACCTACCTACCCGGGAG CCCCCGTTCTATATCATCAC-3'和如 SEQ ID Ν0· 6 所示 5'-CTACCTACCTACCTACCCGGGAGCCCCCGTT CTATATCATCAT-3'， 所述連接產(chǎn)物長度分別為82和84。
[0012] 所述熒光標記的一部分為和模板配對部分，另一部分則可引入隨機系列來調(diào)整 LDR產(chǎn)物長度，所述熒光探針在3'進行熒光標記和5'端進行磷酸化標記；所述熒光探針的 熒光基團為 5-FAM、6-FAM、TAMRA、HEX、TET、JOE、VIC、NED、R0X、Dl、D2、D3 或 D4。
[0013] 所述檢測探針的一部分為和模板配對部分，另一部分則可引入隨機系列來調(diào)整 LDR產(chǎn)物長度，所述檢測探針根據(jù)突變位點的需要進行設計，檢測探針為2-4根探針，檢測 探針中的3'端為檢測位點。
[0014] 腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒的使用方法，該方法包括以下步驟： (1)提取待測樣品基因組DNA，以待測樣品基因組DNA為模板進行PCR擴增：所用PCR 引物為一對正向引物和反向引物，其PCR產(chǎn)物中含有檢測相關(guān)位點， 正向引物如 SEQ ID NO. 2 所示：5' -CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3'， 反向引物如 SEQ ID NO. 3 所示：5' -TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3' ； (2 ) PCR的擴增產(chǎn)物進行LDR擴增； (3)用測序儀的Genescan功能對LDR產(chǎn)物進行測試，分析得到的檢測數(shù)據(jù)和擴增曲線 圖。
[0015] 所述步驟（1)中待測樣品基因組DNA提取為常規(guī)的血基因組抽提方法。 腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒在檢測ABL1基因中的應用。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為： 本發(fā)明腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒采用PCR關(guān)聯(lián)LDR方法(聚合酶鏈式反應關(guān) 聯(lián)連接酶檢測反應）進行檢測，本發(fā)明的試劑盒能夠方便檢出ABL1的各種基因分型，得到 的結(jié)果具有可靠、穩(wěn)定、操作簡單、快速的特點，簡化了傳統(tǒng)PCR測序檢測方法中，由于產(chǎn)物 純化和沉淀等繁瑣步驟造成的檢測時間長的問題，本發(fā)明的試劑盒具有較大的臨床應用價 值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為實施例1的檢測結(jié)果圖。
[0018] 圖2為實施例2的檢測結(jié)果圖。
[0019] 圖3為實施例3的檢測結(jié)果圖。

【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0021] 實施例1 ABL1基因位點分型的檢測方法步驟如下 (1) PCR 擴增： 將格列衛(wèi)耐藥病例外周血基因組DNA，進行PCR擴增，所用PCR引物為一對正向引物和 反向引物， 正向引物如 SEQ ID N0. 2 所示：5' -CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3' ； 反向引物如 SEQ ID N0. 3 所示：5' -TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3' ； PCR各組分體系(見表2): 表2

【權(quán)利要求】
1. 腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒，其特征在于，該檢測試劑盒包括：PCR試劑和 LDR試劑，所述的PCR試劑包括一對PCR正向引物和反向引物、雙蒸水、聚合酶、聚合酶配套 緩沖液、dNTP和MgCl 2 ; 所述正向引物如 SEQ ID NO. 2 所示：5' -CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3' ； 所述反向引物如 SEQ ID NO. 3 所示：5' -TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒，其特征在于，所述LDR 試劑包括相關(guān)位點的突光探針、檢測探針、雙蒸水、Taq連接酶和連接酶配套緩沖液；所述 聚合酶為Taq酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒，其特征在于，所述LDR 所用熒光探針序列為： 5' -P-TGAGTTCATGACCTACGGGAACCTCTACCTACCTACCTACC-FAM-3' ；所述 LDR 所用檢測探 針序列為：如 SEQ ID NO. 5 所示 5' -ACCTACCTACCTACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAC-3' 和 如SEQIDN0·6所示5'-CTACCTACCTACCTACCCGGGAGCCCCCGTTCTATATCATCAT-3'，所述連接 產(chǎn)物長度分別為82和84。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光 標記的一部分為和模板配對部分，另一部分則可引入隨機系列來調(diào)整LDR產(chǎn)物長度，所述 熒光探針在3'進行熒光標記和5'端進行磷酸化標記；所述熒光探針的熒光基團為5-FAM、 6-FAM、TAMRA、HEX、TET、JOE、VIC、NED、ROX、Dl、D2、D3 或 D4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的ABL1基因位點分型檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測探針 的一部分為和模板配對部分，另一部分則可引入隨機系列來調(diào)整LDR產(chǎn)物長度，所述檢測 探針根據(jù)突變位點的需要進行設計，檢測探針為2-4根探針，檢測探針中的3'端為檢測位 點。
6. 腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，該方法包括以下步 驟： (1) 提取待測樣品基因組DNA，以待測樣品基因組DNA為模板進行PCR擴增：所用PCR 引物為一對正向引物和反向引物，其PCR產(chǎn)物中含有檢測相關(guān)位點， 正向引物為如 SEQ ID NO. 2 所示：5' -CACCATGGAGGTGGAAGAGT-3'， 反向引物為如 SEQ ID NO. 3 所示：5' -TCTGAGTGGCCATGTACAGC-3' ； (2) PCR的擴增產(chǎn)物進行LDR擴增； (3) 用測序儀的Genescan功能對LDR產(chǎn)物進行測試，分析得到的檢測數(shù)據(jù)和擴增曲線 圖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的ABL1基因位點分型檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所 述步驟（1)中待測樣品基因組DNA提取為常規(guī)的血基因組抽提方法。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述腫瘤ABL1基因位點分型檢測試劑盒在檢測ABL1 基因中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152542SQ201410240322
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】祁小飛 申請人:蘇州大學附屬第一醫(yī)院