一種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG及其編碼基因與應(yīng)用。該薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG，是具有序列表中的SEQ?ID?NO.2所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其編碼基因?yàn)镃iAG基因SEQ?ID?NO.1的DNA序列。薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG基因可用于培育早花、矮化植物品種。CiAG為特異表達(dá)基因，其表達(dá)模式與組織以及植株的發(fā)育階段相關(guān)。過量表達(dá)CiAG的轉(zhuǎn)基因擬南芥與對(duì)照組相比，開花比野生型植株早，在四片基生葉出現(xiàn)時(shí)已經(jīng)開花，并且植株表現(xiàn)出矮化的特性，說明CiAG可以控制植物的成花轉(zhuǎn)變，影響植物的花期和營養(yǎng)生長，進(jìn)而調(diào)控植物的生殖生長。
【專利說明】—種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]薄殼山核桃童期很長，需15年左右，并且雄花發(fā)育早，雌花發(fā)育晚。另外，薄殼山核桃是雌雄同株異花植物，存在雌先型、雄先型和雌雄同型三種不同的類型，并且雄花主要著生在前一年生枝條中下部的雄花序上，而雌花曾總狀花序，著生在結(jié)果枝的頂端。由此可見，薄殼山核桃雌花和雄花的發(fā)育具有獨(dú)特的特點(diǎn)，對(duì)其花發(fā)育基因進(jìn)行研究，為培育早花早實(shí)品種以及縮短童期具有重要的意義。
[0003]MADS-box是一個(gè)保守性很強(qiáng)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，最早在酵母Mini ChromosomeMaintenancel (MCMl)、擬南芥AGAMOUS(AG)、金魚草DEFICIENS (DEF)和人類血清應(yīng)答因子Serum ResponseFactor (SRF)中發(fā)現(xiàn)，因此具有此結(jié)構(gòu)的功能基因被命名為MADS-box基因。MADS-box在果樹縮短童期中具有重要的作用，但是該基因是否能夠在果樹矮化中發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供該轉(zhuǎn)錄因子CiAG的編碼基因。
[0007]本發(fā)明的又一目的是提供該轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]本發(fā)明所提供的一種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子，命名為CiAG，來源于薄殼山核桃(Carya illinoensis (ffangench.)K.Koch)優(yōu)良品種‘馬罕’，氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0010]本發(fā)明所述的的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因，其cDNA序列如SEQID N0.1所示；序列中含有684bp的最大開放閱讀框，編碼SEQ ID N0.2所示的227個(gè)氨基酸
殘基序列。
[0011]含有本發(fā)明CiAG基因SEQ ID N0.1的表達(dá)載體。
[0012]所述的表達(dá)載體優(yōu)選將所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG的編碼基因插入到PCAMBIA1301載體的Kpn I和Sac I酶切位點(diǎn)間所得。
[0013]宿主菌是指將p CAMBIA1301-CiAG轉(zhuǎn)入的根癌農(nóng)桿菌EHA105.[0014]擴(kuò)增CiAG cDNA全長的引物為:
[0015]VvAG-ORF sense: 5’ -ATGGGGAGGGGGAGGATAGAAA-3’
[0016]VvAG-ORF antisense:5’ -CGCCATAACAGGGCAATAACCT-3’[0017]實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析中涉及的CiAG的qPCR引物為:
[0018]VvAG - qPCR sense:5，-AGGCTGCTACTCTACGACAAC-3，，
[0019]VvAG - Qpcr antisense:5’ -GGTTCCTCTCATTCTCCGCTATC-3’。
[0020]上述薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG、其編碼基因、含有編碼基因的表達(dá)載體在培育早花、矮化植物中的應(yīng)用。
[0021]有益效果:
[0022]本發(fā)明在薄殼山核桃中克隆到一個(gè)MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG基因，CiAG可能參與薄殼山核桃花發(fā)育、果實(shí)發(fā)育等生殖發(fā)育的大部分進(jìn)程。CiAG編碼基因在雄花、雌花和幼果中特異性表達(dá)。轉(zhuǎn)基因擬南芥 中過量表達(dá)CiAG編碼基因，與對(duì)照組相比，開花期顯著提前，植株矮化。這一結(jié)果說明CiAG基因可以控制植物的成華轉(zhuǎn)變過程，同時(shí)可以使植株矮化。
[0023]本發(fā)明的CiAG對(duì)于培育早花、矮化植物品種特別是早花早熟矮化的薄殼山核桃具有重要意義，在作物育種方面具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0024]利用本發(fā)明的植物表達(dá)載體，將CiAG基因?qū)胫参矬w內(nèi)，可以獲得開花提前、植株矮化的轉(zhuǎn)基因植株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1CiAG基因在薄殼山核桃的表達(dá)特性
[0026]1，葉；2，當(dāng)年生枝條；3，雌花；4，雄花；5，幼果
[0027]圖2.CiAG過量表達(dá)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0028]圖3.轉(zhuǎn)CiAG基因擬南芥和對(duì)照組RT-PCR檢測(cè)。
[0029]A:CiAG特異引物RT-PCR產(chǎn)物；B:18S產(chǎn)物；WT:野生型；1_5:轉(zhuǎn)基因型
[0030]圖4轉(zhuǎn)CiAG基因擬南芥和對(duì)照的表型觀察
[0031]WT:野生型；T:轉(zhuǎn)基因株系
【具體實(shí)施方式】
[0032]下列實(shí)例中所有的方法無特別說明，均為常規(guī)方法
[0033]實(shí)施例1薄殼山核桃CiAG基因的克隆與鑒定
[0034]實(shí)驗(yàn)材料為薄殼山核桃品種‘馬罕’，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆得到的保守片段(莫正海等，2013，南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，44 (5) =730-734.)，設(shè)計(jì)兩條特異引物，進(jìn)行3’ RACE PCR0基因特異引物序列分別為，GSPl:5’-CACTACTAATCGTCAAGTCACCTTCTGT-3’ (SEQ ID N0.3) ；GSP2:5’ -CTTCTGTAAGAGGCGCAACGGCTT-3’ (SEQ ID N0.4)，與其搭配的引物為接頭引物均為 AUAP:5’ -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’ (SEQ ID N0.5)。取馬罕雄花，進(jìn)行 RNA 的提取，參照 BioTeke通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)進(jìn)行。取總RNAl μ g, cDNA合成采用PrimeScriptRTase (Takara)反轉(zhuǎn)錄酶，以帶接頭的 Oligo d(T)引物 AP:5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ (SEQ ID N0.6)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA。以薄殼山核桃雄花第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行巢式PCR，第一輪PCR反應(yīng)條件為:94°C 5min熱變性；94°C 45s, 65°C 45s，72°C lmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。將第一輪PCR溶液稀釋10倍，以此作為模板，進(jìn)行第二輪PCR，反應(yīng)條件同第一輪。將第二輪PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(Genscript)回收后，與pMD19-T載體(Takara, Japan)連接,然后轉(zhuǎn)化大腸菌DH5 α，挑選陽性克隆,進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的片段與原來的保守片段進(jìn)行比對(duì)、拼接，獲得序列長度為1013bp。
[0035]為了獲得其最大開放閱讀框，在其兩端設(shè)計(jì)基因特異引物，VvAG-ORF sense:5’ -ATGGGGAGGGGGAGGATAGAAA-3’ (SEQ ID N0.7)和 VvAG-ORF antisense:5’ -CGCCATAACAGGGCAATAACCT-3’ (SEQ ID N0.8)，以以薄殼山核桃雄花第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為 94°C 5min 熱變性；94°C 45s, 48°C 45s, 72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保存，將PCR產(chǎn)物回收、克隆、測(cè)序，經(jīng)分析后獲得SEQ ID N0.1所示序列。CiAG的ORF為684bp，編碼227個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0036]實(shí)施例2薄殼山核桃CiAG基因在不同器官中的表達(dá)特征
[0037]以薄殼山核桃三個(gè)品種(紹興、波尼、馬罕)為材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)薄殼山核桃不同組織葉片、當(dāng)年生枝條、雌花、雄花、幼果中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。各組織總RNA的提取同步驟(一)，cDNA的合成用能消除RNA中殘留DNA的試劑盒，PrimeScriopt RT reagent kit with gDNA Eraser (Takara, Japan),具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。內(nèi)參使用山核桃actin基因(周秦.山核桃果實(shí)成熟期間基因表達(dá)的初步分析[J],臨安:浙江農(nóng)林大學(xué)，2010)，引物序列為 ACTIN-F:5’ -GCTGAACGGGAAATTGTC-3’ (SEQID N0.9)，ACTIN-R:5’ -AGAGATGGCTGGAAGAGG-3’ (SEQ ID N0.10)。根據(jù) CiAG 基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物 VvAG - qPCR sense:5’ -AGGCTGCTACTCTACGACAAC-3’ (SEQ ID N0.11)，VvAG -Qpcr antisense:5’ -GGTTCCTCTCATTCTCCGCTATC-3’ (SEQ ID N0.12)。以來自不同組織的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析。
[0038]結(jié)果分析表明(圖1 )，CiAG基因在三個(gè)品種中均有表達(dá)，在生殖器官(雄花、雌花、幼果)中的表達(dá)量顯著高于營養(yǎng)器官(葉片、枝條)中的表達(dá)量，說明該基因在花發(fā)育過程起著重要的作用。
[0039]實(shí)施例3CiAG轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定
[0040]提取含有CiAG編碼基因目的片段的T-載體及表達(dá)載體pCAMBIA1301質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sac I雙酶切，切膠回收，然后用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定。將大腸桿菌質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(EHA105)感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽性克隆。獲得CiAG過量表達(dá)表達(dá)載體pCAMBIA1301-CiAG(圖2)。將過量表達(dá)載體通過用凍融法將pCAMBIA1301_CiAG轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌株EHA105 (Avsian-Kretchmer etal，2004，Plant Physiology, 135:1685-1696)中。pCAMBIA1301_CiAG 通過農(nóng)桿菌株 EHA105的介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化擬南芥，利用抗生素篩選和PCR技術(shù)篩選陽性轉(zhuǎn)基因植株。以經(jīng)抗生素篩選的抗性植株總RNA為模板，以未轉(zhuǎn)基因擬南芥植株總RNA為陰性對(duì)照進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)(圖3)，擬南芥18S作為RNA提取和cDNA合成成功的對(duì)照。將鑒定出的轉(zhuǎn)基因T2代種子和野生型擬南芥種子同時(shí)播到栽培基質(zhì)中，人工培養(yǎng)條件為:相對(duì)濕度80%，光照強(qiáng)度80-200 μ mol/M2/S，溫光周期為16h光照，22°C /8h黑暗，17°C。對(duì)其表型進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株矮化(表1)，開花比野生型植株提前，在四片基生葉出現(xiàn)時(shí)已經(jīng)開花(圖4)。
[0041]表1
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG,氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.權(quán)利要求1所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子的cDNA基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體是將所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG的編碼基因插入到pCAMBIA1301載體的Kpn I和Sac I酶切位點(diǎn)間所得。
6.含有權(quán)利要求2和3所述基因的宿主菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌是將pCAMBIA1301-CiAG轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105所得。
8.權(quán)利要求1所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG在培育早花矮化植物中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2或3中所述的薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子CiAG的編碼基因在培育早花矮化植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)載體在培育早花矮化植物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104004076SQ201410241481
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】張計(jì)育, 莫正海, 郭忠仁, 宣繼萍, 賈曉東, 黃勝男 申請(qǐng)人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所