Dha高產(chǎn)菌株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)二十二碳六烯酸的裂殖壺菌(Schizochytrium?sp.)CGMCC?No.5415及其發(fā)酵方法和應用。利用本發(fā)明提供的裂殖壺菌CGMCC?No.5415，可實現(xiàn)快速地積累生物量和DHA，具有廣泛的工業(yè)應用價值。
【專利說明】DHA高產(chǎn)菌株及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及二十二碳六烯酸的高產(chǎn)菌株及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002]DHA(二十二碳六烯酸)是一種重要的長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)，屬于ω3系列。DHA具有促進腦細胞生長發(fā)育、降血脂、抗炎和改善自身免疫、抗癌作用、促進神經(jīng)發(fā)育和改善視力等多種重要的生理功能，被譽為新一代功能保健因子，受到世人的極大關(guān)注。
[0003]DHA的傳統(tǒng)來源為深海魚油，但是，這種來源存在比較突出的缺陷:資源有限、提取工藝復雜、污染環(huán)境、含有強烈的魚腥味。因而傳統(tǒng)深海魚來源的DHA已遠不能能滿足社會的需求。而利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA以其獨有的技術(shù)優(yōu)勢成為研究熱點。其中利用微藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA具有更大的優(yōu)勢和潛能。
[0004]微藻具有生長周期短、繁殖速度快、可塑性強、對營養(yǎng)要素要求簡單等優(yōu)點。利用微藻高密度發(fā)酵生產(chǎn)可獲得高產(chǎn)量的DHA。目前已發(fā)現(xiàn)的微藻有裂殖壺菌、破囊壺菌、隱甲藻等。其中裂殖壺菌為一種海洋真菌，具有較強的多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)能力，且不飽和脂肪酸成分集中，制藥為DHA和DPA，其他不飽和脂肪酸含量低。
[0005]目前，利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA已成為熱點之一。涉及利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA的文獻有 CN1648233A、CN1916156A、CN101575584B、CN101519676B、CN101638361A、CN101812484B、CN101993824A、CN101993824A、CN101892160A、CN102864111A 等。其中 CN1648233A 公開了裂殖壺菌經(jīng)培養(yǎng)后生物量 為25g/L，DHA含量為8.7g/L ;CN1916156A公開了優(yōu)化培養(yǎng)后裂殖壺菌的生物量為42.5g/L，DHA含量為14.lg/L ;CN101575584B公開了利用裂殖壺菌生產(chǎn)DHA，優(yōu)化條件下細胞干重達到70g/L、油脂含量31.5g/L、DHA占總脂含量35% ;CN101812484B公開了經(jīng)120~130小時高密度培養(yǎng)發(fā)酵后，裂殖壺菌的生物量為120~150g/L、DHA含量為26~30g/L ；CN101892160A公開了經(jīng)100小時培養(yǎng)發(fā)酵后，裂殖壺菌生物量為72.5g/L、DHA含量為15.3g/L ；CN102199541A公開了經(jīng)72小時培養(yǎng)發(fā)酵后，裂殖壺菌的生物量為120g/L、油脂含量為54.3%、DHA為51.4% ；CN102864111A公開了經(jīng)72小時培養(yǎng)發(fā)酵后，裂殖壺菌的生物量為100g/L、DHA為22.9g/L。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一株能高產(chǎn)DHA的裂殖壺菌及其發(fā)酵方法和應用，本發(fā)明提供的高產(chǎn)DHA的菌株菌體產(chǎn)量增加快、易于大規(guī)模培養(yǎng)。
[0007]因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種高產(chǎn)二十二碳六烯酸的裂殖壺菌(Schizochytrium sp.),該菌株的保藏號為 CGMCC N0.5415。
[0008]本發(fā)明的第二個目的在于提供所述的裂殖壺菌CGMCC N0.5415用于生產(chǎn)二十二碳六烯酸的應用。
[0009]本發(fā)明的第三個目的在于提供通過發(fā)酵所述的裂殖壺菌CGMCC N0.5415獲得二十二碳六烯酸的生產(chǎn)方法，所述發(fā)酵的培養(yǎng)條件如下:[0010]種子培養(yǎng)基為:葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、海鹽15g/L、pH7.0 ；
[0011]發(fā)酵培養(yǎng)基(5L裝量發(fā)酵罐)為:葡萄糖60g/L，玉米漿12g/L，海鹽15g/L，ρΗ6.0 ；
[0012] 接種量10%，攪拌轉(zhuǎn)速為250~300rpm，溫度為25°C，溶氧為40%，空氣流量3L/min, ρΗ6.0，發(fā)酵72h ;其間，0-18小時，以2.5mL/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、18-48小時，以20ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、48-72小時，以6_8ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液；24-60小時，以10mL/h速率流加120g/L玉米漿溶液。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的裂殖壺菌CGMCC N0.5415能夠利用普通碳源和氮源，快速進行細胞培養(yǎng)和DHA的積累。通過條件優(yōu)化，經(jīng)72h發(fā)酵培養(yǎng)后，可使細胞培養(yǎng)生物量達到150g/L左右，DHA占菌體細胞干重的量為0.3g/g左右。相比現(xiàn)有技術(shù)，利用本發(fā)明提供的裂殖壺菌CGMCC N0.5415，可實現(xiàn)快速地積累生物量和DHA，達到高產(chǎn)的效果。
[0014]本發(fā)明提供了一種新的裂殖壺菌，可用于高產(chǎn)DHA，具有廣泛的工業(yè)應用前景。
【具體實施方式】
[0015]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0016]本發(fā)明的裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)已于2011年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC N0.5415。
[0017]實施例KHCCB30108的篩洗
[0018]將寧波舟山近海采集的水樣離心后取沉淀物涂布于含有青霉素(0.5g/L)和鏈霉素(0.5g/L)的固體培養(yǎng)基中(葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂20g/L，海水，PH7.0)，28°C培養(yǎng)4~5天。將獲得的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于新的固體平板上，平板劃線直至出現(xiàn)單菌落。經(jīng)過復篩后，最終得到一株純培養(yǎng)物，編號為HCCB30108。
[0019]實施例2、HCCB30108的鑒定
[0020]將實施例1獲得的HCCB30108送往中國科學院微生物研究所進行了菌種鑒定。根據(jù)HCCB30108的培養(yǎng)及細胞顯微形態(tài)特征、生理生化特征和rRNA基因序列等數(shù)據(jù)，確定HCCB30108 為裂殖壺菌(Schizochytrium sp.)。
[0021]裂殖壺菌HCCB30108于2011年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.5415。
[0022]實施例3、裂葙壺菌CGMCC N0.5415的發(fā)酵罐培養(yǎng)
[0023]將實施例2獲得的裂殖壺菌CGMCC N0.5415進行發(fā)酵培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基為:葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，海鹽15g/L，瓊脂粉20g/L，pH7.0。將斜面培養(yǎng)2天的裂殖壺菌接種于種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)基為:葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、海鹽15g/L、pH7.0。25°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以10%的接種量接種于含有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖60g/L，玉米漿12g/L，海鹽15g/L，pH6.0。接種量10%，控制攪拌轉(zhuǎn)速為250~300rpm，溫度為25°C，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制溶氧為40%，空氣流量3L/min，使用氨水控制PH維持在6.0。發(fā)酵0-18小時，以2.5mL/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、18-48小時，以20ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、48-72小時，以6_8ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液；24-60小時，以10mL/h速率流加120g/L玉米漿溶液，至72小時生物
量達到高峰,停止發(fā)酵。
[0024]發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心(8000rpm/min,8min),棄去上清。沉淀用等體積的1%的NaCl溶液洗，再次離心后，獲得濕菌體。將獲得的濕菌體進行冷凍干燥，獲得干菌體。4批發(fā)酵批次數(shù)據(jù)如表1所示。
[0025]表1、裂殖壺菌CGMCC N0.5415的發(fā)酵菌體量
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)二十二碳六烯酸的裂殖壺菌(Schizochytrium sp.),其特征在于:該菌株的保藏號為CGMCC N0.5415。
2.如權(quán)利要求1所述的裂殖壺菌CGMCCN0.5415用于生產(chǎn)二十二碳六烯酸的應用。
3.一種二十二碳六烯酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，通過發(fā)酵如權(quán)利要求1所述的裂殖壺菌CGMCC N0.5415獲得二十二碳六烯酸。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的培養(yǎng)條件如下: 種子培養(yǎng)基為:葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、海鹽15g/L、pH7.0 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基(5L裝 量發(fā)酵罐)為:葡萄糖60g/L，玉米漿12g/L，海鹽15g/L，pH6.0 ； 接種量10%，攪拌轉(zhuǎn)速為250~300rpm，溫度為25°C，溶氧為40%，空氣流量3L/min，pH6.0，發(fā)酵72h ;其間，0-18小時，以2.5mL/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、18-48小時，以20ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液、48-72小時，以6_8ml/h速率流加600g/L的葡萄糖溶液；24-60小時，以10mL/h速率流加120g/L玉米漿溶液。
【文檔編號】C12R1/645GK103981106SQ201410241970
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】金文翔, 阮麗軍, 楊志鈞, 夏興, 戈梅, 孫新強, 金一平, 張定豐, 王剛 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責任公司, 浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠