‘南通小方柿’DkGA2ox2 基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及‘南通小方柿’DkGA2ox2基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。本發(fā)明首次從‘南通小方柿’克隆得到了一個新的DkGA2ox2基因，將其導(dǎo)入煙草，DkGA2ox2在煙草中過量表達(dá)；DkGA2ox2轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的矮化能力，可使植株矮化至野生型植株的32.11％。
【專利說明】‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]矮化植株株型緊湊，冠幅小，抗倒伏，且生產(chǎn)管理方便，豐產(chǎn)性能好。通過基因工程的手段利用矮化性狀可以顯著提高小麥和水稻等作物的產(chǎn)量，從而引發(fā)了上世紀(jì)響譽(yù)全球的“綠色革命”,從而使矮化育種成為植物育種的發(fā)展趨勢。赤霉素(gibberellin，GA)是一類四環(huán)二萜羧酸，作為五大植物激素之一，影響著高等植物生長發(fā)育的各個階段，如種子萌發(fā)、莖的伸長、花的誘導(dǎo)分化和性別決定、果實(shí)坐果等。早在1926年被日本植物病理學(xué)家發(fā)現(xiàn)，目前已發(fā)現(xiàn)赤霉素類物質(zhì) 136 種(http://www.plant - hormones, info/gibberellins.htm)。其中，只有GA1、GA3、GA4、GA5、GA7等少數(shù)赤霉素具有生物活性，其余為合成前體或降解產(chǎn)物。赤霉素2-氧化酶(GA2i3 -羥化酶，GA2ox)是植物體內(nèi)赤霉素代謝過程中的關(guān)鍵酶，是由多基因編碼的雙加氧酶，作用于有生物活性的GA1和GA4,使其在C - 2位羥基化轉(zhuǎn)變成無活性的GA8和GA34,令植物體內(nèi)GAs的活性降低而使植物節(jié)間縮短，產(chǎn)生矮化性狀。其矮化功能已在擬南芥、煙草、小麥、茄科植物、百喜草、水稻、楊樹、李樹、長壽花和矮牽牛中得到驗(yàn)證。果樹的矮化栽培更具有早果、質(zhì)優(yōu)、更新快、效益高的優(yōu)點(diǎn)。柿(Diospyroskaki)最早栽培于我國，已有2000多年歷史，我國亦是其原產(chǎn)地之一。但我國柿品種多為高大喬木，不便于管理栽培?！贤ㄐ》绞痢?Diospyros kaki Linn.cv.Nantongxiaofangshi)是 1982年在江蘇省進(jìn)行果樹資源普查時于南通市發(fā)現(xiàn)的珍稀矮生型柿樹品種。干性弱，無明顯中心干，樹姿開張，表現(xiàn)出明顯的矮生性狀；成年樹高僅3.5 - 4米，為同等條件下生長的喬化品種的60%。但有關(guān)該品種矮生特性的分子層面的研究卻尚未開展，是否與GA相關(guān)也還不了解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一個新的‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因。
[0004]本發(fā)明的又一目的是提供含有該基因的重組表達(dá)載體。
[0005]本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]含有所述的DkGA2ox2基因的重組表達(dá)載體。
[0009]所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選將所述的DkGA2ox2基因插入到表達(dá)載體pYH4215的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間所得。
[0010]含有所述的DkGA2ox2基因的宿主。
[0011 ] 所述的宿主優(yōu)選農(nóng)桿菌。
[0012]所述的DkGA2ox2基因在創(chuàng)制矮化新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。[0013]所述的含有DkGA2ox2基因的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制矮化新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。
[0014]有益效果:
[0015]由于現(xiàn)有技術(shù)中尚未有柿科DkGA2ox2同源基因的報道，本發(fā)明通過同源克隆的方法，根據(jù)Genbank中其他物種中已知同源序列的保守區(qū)設(shè)計引物，經(jīng)多次試驗(yàn)篩選引物及利用梯度PCR的方法對退火溫度的進(jìn)行不斷優(yōu)化得到了 DkGA2ox2的中間片段。本發(fā)明首次從‘南通小方柿’克隆得到了一個新的DkGA2ox2基因，通過blast將DkGA2ox2核苷酸序列與NCBI上登錄的其它物種進(jìn)行序列比對，DkGA2ox2與牽?；?⑶189414.2)、蘋果(FJ571521.1)、夾竹桃(AY594292.1)、毛白楊(JX102472.1)、梨(JF441168.1)、酸模(DQ641499.1)、葡萄(KC898179.1)、矮牽牛(⑶059939.1)煙草(AB125232.1)、陸地棉(HQ891931.1)的一致性分別為 75 % ,76 % ,74 % ,75 % ,75 % ,75 % ,74 % ,74 % ,73 %,73%?！贤ㄐ》绞痢疍kGA2ox2氨基酸序列的同源性分析和比對結(jié)果表明，本發(fā)明所獲得的DkGA2ox2與其他物種已知基因之間同源性較低，說明兩基因在不同物種間保守性不高，在進(jìn)化過程中所發(fā)生的變異程度也不同。
[0016]本發(fā)明還構(gòu)建了 DkGA2ox2的重組表達(dá)載體，將其導(dǎo)入煙草，DkGA2ox2在煙草中過量表達(dá)；DkGA2ox2轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的矮化能力，可使植株矮化至野生型植株的32.11%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1轉(zhuǎn)DkGA2ox2基因煙草PCR檢測
[0018]其中M表示marker，CK表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，P表示陽性對照(質(zhì)粒)，I _ 21表示DkGA2ox2轉(zhuǎn)基因煙草株系
[0019]圖2轉(zhuǎn)DkGA2ox2基因煙草RT - PCR檢測
[0020]其中M表示marker，CK表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏琍表示陽性對照(質(zhì)粒)，2 - 12表示DkGA2ox2轉(zhuǎn)基因煙草株系
[0021]圖3移栽80天的轉(zhuǎn)基因煙草株系的表型觀察。
[0022]其中，WT:非轉(zhuǎn)基因煙草株系；2 - 1，2 - 4:轉(zhuǎn)DkGA2ox2基因煙草株系(下同)。
[0023]圖4轉(zhuǎn)基因煙草株系的株高變化情況。
[0024]圖5外源噴施GA3可恢復(fù)轉(zhuǎn)基因煙草表型
[0025]其中，A:噴施6^前；B:噴施6^后
[0026]圖6轉(zhuǎn)基因植株葉片GA1+3含量。
[0027]圖7轉(zhuǎn)基因和對照株系不同葉位上葉片的葉綠素含量。
[0028]其中橫坐標(biāo)4，10，16分別代表植株由下往上第4，10，16葉位葉片。
[0029]圖8過量表達(dá)DkGA2ox2基因誘導(dǎo)煙草NtGA20ox、NtGA3ox和基因的表達(dá)。
[0030]圖9pYH4215質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1
[0032]取‘南通小方柿’葉片，參考蔡斌華等改進(jìn)的CTAB法提取RNA。根據(jù)GenBank中公布的GA2ox基因cDNA序列保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物。GA2ox-F - AAYGGYGATRTBGGHTGGRTYGAATA - 3’ (SEQ ID N0.2) ；GA2ox-R:5’ - TGCYTYACRCTYTTAAAYCTYCCATTWGTCA - 3，(SEQ ID N0.3)。其中，Y:代表 C 或 T ;R 代表A或G ;B代表C、T或G ;H代表A、T或C ;W代表A或T。
[0033] 中間片段的獲得
[0034]總RNA 中 DNA 的消化:(TaKaRa code: D2270A)。反轉(zhuǎn)錄參照 PrimeScript? RTreagent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa code: RR037A)。PCR 擴(kuò)增體系:100ng/ μ LcDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5μ L, dNTP (2.5mM) 2 μ L,上下游引物(GA2ox-F/GA2ox-R)各 I μ L，0.15 μ L rTaq 酶，用水補(bǔ)足至 25 μ L。PCR 程序?yàn)?94°C 4min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 40s，35個循環(huán);72°C延伸IOmin0產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。回收目的片段并連接到PMD19-T載體上轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞隨機(jī)篩選白色菌落進(jìn)行測序。
[0035]末端的獲得
[0036]反轉(zhuǎn)錄時將PrimeScript? RT reagent Kit中Ramdom6替換為接頭引物Rl 1466:5’ -GCAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN-3’ 其中 V 代表 A 或 G 或 C，N 代表:A、T、C或G(SEQ I D N0.4)，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度從37 °C調(diào)至42 °C，反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)的溫度從85°C調(diào)至95°C )。PCR程序及體系亦同于中間片段的獲得。以通用引物 R16326:5’ - GGTGGTAGAGCTCGCAGGACTGCAGCTGACTG - 3’ (SEQ ID N0.5)和特異外偵^引物 GA2ox23 ' GSP-1:5’ - TTGATGGACGAGCAGAGCG - 3’ (SEQ ID N0.6)進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序如下:PCR擴(kuò)增體系:IOOng/μ L cDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L,MgCl2(25mM)1.5yL, dNTP (2.5mM) 2 μ L，上下游引物各 lyL,0.15 μ L rTaq 酶，用水補(bǔ)足至25 μ L0 PCR 程序?yàn)?94°C 4min ；94°C 30s，61。。30s, 72°C 40s, 35 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后做模板，以內(nèi)側(cè)引物R16324:5’ - AGAGCTCGCAGGACTGCAGCAGCTGACTGACTAC - 3，(SEQ ID N0.7)與 GA2ox23' GSP-2:5’ - CATCTCCGTTCTAAGATCCAACA -3，(SEQ ID N0.8)進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，
[0037]體系同上。
[0038]51末端的獲得
[0039]cDNA 的獲得參照 SMARTer? RACE cDNA amplification kit (Clontech,Cat.Nos.634923&634924)。利用 UPM 和特異的外側(cè)引物 GA2ox25 ' GSP-1:
5’ - AGTTCTGGTCGGGCGGGACG - 3 ’ (SEQ ID N0.9)進(jìn)行降落 PCR 的第一輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序如下:10 X Ex Taq buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5 μ L，IOOng/ μ L cDNAl.0 μ L，GSP-10.5 μ L，UPM2.0 μ L，dNTP (2.5mM) 0.5 μ L, Ex Taq0.2 μ L, ddH2017.8 μ L,終體積25.0 μ L0
[0040]反應(yīng)條件為:94°C5min ；94°C 30s，70°C 降落到 68°C 30s (每循環(huán)降低 0.5°C )，72°C 2min，5 個循環(huán)；94°C 30s，68°C 30s，72°C，90s，共 30 個循環(huán)；72°C lOmin。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋 10 倍后做模板，以內(nèi)側(cè)引物 GA2ox25' GSP-2:5’ - GCCCTTCCGCCATTAACTCCAGTA -3’ (SEQ ID N0.10)與NUP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，體系同上。產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收目的片段進(jìn)行T/A克隆后測序。
[0041]利用DNAMAN對5'端、3'端及中間片段正確克隆的序列進(jìn)行拼接，得到基因的全長序列，如SEQ ID N0.1所示。用BLAST進(jìn)行相似性檢索，發(fā)現(xiàn)DkGA2ox2核苷酸序列與牽牛花(⑶ 189414.2)、蘋果(FJ571521.1)、夾竹桃(AY594292.1)、毛白楊(JX102472.1)、梨(JF441168.1)、酸模(DQ641499.1)、葡萄(KC898179.1)、矮牽牛(⑶059939.1)煙草(AB125232.1)、陸地棉(HQ891931.1)的一致性分別為 75 % ,76 % ,74 % ,75 % ,75 % ,75 %,74%,74%,73%,73% ,屬于 DkGA2ox2 屬于 GA2-氧化酶家族。
[0042]實(shí)施例2
[0043]根據(jù)載體和DkGA2ox2基因的酶切位點(diǎn)，設(shè)計含有BamHI和SacI基因特異引物，DkGA2ox2B-F:5’ -CGGGATCCATGGTGGTATTGTC-3’ (SEQ ID N0.11) ；DkGA2ox2S-R:5’ -CGAGCTCCTAAGTTAACGAGGCTGC-3’ (SEQ ID N0.12);以‘南通小方柿’全長 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為:IOOng/μ L cDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5μ L,dNTP (2.5mM) 2 μ L，上下游引物各IyL, 0.15 μ L rTaq酶，用水補(bǔ)足至25 μ L。PCR程序?yàn)?940C 4min ；94°C 30s, 62°C 40s, 72°C 70s，35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。產(chǎn)物在 I %瓊脂糖凝膠電泳分析?；厥漳康钠尾⑦B接到PMD19-T載體上轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞隨機(jī)篩選白色菌落進(jìn)行測序。
[0044]將原始的pYH4215載體及經(jīng)測序驗(yàn)證正確后的pMD19_T載體中DkGA2ox2基因利用BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切。割膠回收載體和基因片段，連接5h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。菌液PCR鑒定陽性克隆，隨機(jī)挑取3個單克隆送樣測序，以確保產(chǎn)物的準(zhǔn)確性及特異性。提取質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定。將大腸桿菌質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽性克隆。
[0045]實(shí)施例3
[0046]凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，調(diào)取單菌落于50ml含Km50mg.L—1的YEB液體培養(yǎng)基中，280C，200rpm搖床培養(yǎng)至0D600值約0.5時，5000rpm離心10min，倒去上清。菌體用50ml MS不含激素，不調(diào)pH的液體培養(yǎng)基重新懸浮，搖床培養(yǎng)Ih ;取30d苗嶺生根健壯煙草祖培苗，從頂部剪取第4和5片完全展開葉，將煙草葉片剪成l_2cm2的葉塊放入上述培養(yǎng)基中，不斷輕搖浸泡3min ;用鑷子取出葉片，放在無菌濾紙上吸去多余菌液，接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+BA1.0mg.L、NAA0.2mg.L-1 ρΗ5.8)中，28°C暗培養(yǎng)2_3d ;結(jié)束后，將煙草葉片轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg.L -1,NAA0.2mg.L ^hygSOmg.L- 1+cb200mg mL-l,ρΗ5.8)中，直接置于25°C下光照培養(yǎng),光暗周期16h/8h,光強(qiáng)為40-50 μ mol.moL-2.84,每兩周繼代培養(yǎng)一次，直至愈傷組織分化出抗性植株。待抗性芽長至3-5cm時，剪下接入生根培養(yǎng)基(1/2MS+IBA0.2mg.L -1hygSOmg.L 1+Cb200mg.L1, ρΗ5.8)中誘導(dǎo)生根。一個月后打開瓶蓋，進(jìn)行自然光照，溫度控制在20-25°C，煉苗I周。再將轉(zhuǎn)基因苗移栽至育苗杯中，保持環(huán)境濕潤，待可健壯生長后置于室外自然條件下培養(yǎng)。
[0047]實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因煙草株系的檢測
[0048]在超凈工作臺上剪取轉(zhuǎn)基因煙草及未侵染的野生型煙草葉片，浸入10μ I⑶S染液中，放置37°C培養(yǎng)箱中過夜后，使用70%乙醇脫色觀察染色結(jié)果。對染色結(jié)果為藍(lán)色的植株提取基因組DNA和總RNA，進(jìn)行PCR和RT-PCR的檢測。
[0049]4.1基因組DNA和總RNA的提取
[0050] 基因組DNA和總RNA的提取參考蔡斌華等(2008)和張計育等(2010)的方法，并稍作修改，具體方法如下:取幼苗葉片約0.3g于液氮中迅速研磨成粉末，加入含有900 μ LCTAB裂解液的2mL離心管中，65°C水浴30min (每IOmin輕輕顛倒混勻一次)，加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1),輕輕上下顛倒混勻；4°C, 12000rpm離心15min,取上清,加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)，輕輕上下顛倒混勻；4°C，12000rpm離心15min，取上清，重復(fù)抽提一次；轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管中，加入兩倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇和1/10的3M的NaAc (pH5.2)(提取DNA)或者加入等體積的IOM LiCl (提取總RNA)，- 20°C靜置直至絮狀沉淀出現(xiàn)，4°C，12000rpm離心15min ;70%乙醇洗滌沉淀1- 2次，超凈工作臺上干燥，溶于50 μ L DEPC處理過的ddH20中。取I μ L的總核酸，用I %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。
[0051]4.2PCR 檢測
[0052]取上述提取的總核酸20 μ L進(jìn)行基因組中RNA的消化，具體參照佟照國等(2008)的方法。將消化后的基因組DNA溶解于20 μ L的ddH20中，取I μ L的核酸，用I %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。DNA在Bio - photometer上檢測濃度，體系為I μ L DNA樣加入49 μ LddH20, DNA濃度、0D280/0D260直接從儀器上讀取。
[0053]PCR檢測模板:轉(zhuǎn)基因植株DNA、陽性質(zhì)粒樣品、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓闐NA ;PCR引物參照表 I ;擴(kuò)增反應(yīng)體系:IOOng/μ L cDNAl μ L, 10XPCR Buffer2.5 μ L, MgCl2 (25mM) 1.5μ L,dNTP(2.5mM)2 μ L,引物 DkGA2ox2B_F(SEQ ID N0.11)和 DkGA2ox2S_R(SEQ ID N0.12)各lyL,0.15 μ L rTaq 酶，用水補(bǔ)足至 25 μ L。PCR 程序?yàn)?94 °C 4min ；94°C 30s, 62 °C 40s,72°C 70s，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。產(chǎn)物在I %瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖1。
[0054]4.3RT - PCR 檢測
[0055]將提取的總RNA在Bio - photometer上檢測濃度，體系為I μ L RNA樣加入49 μ LddH20, RNA 濃度、0D280/0D260、0D260/0D230 直接從儀器上讀取；取 I μ L 的總 RNA，用 1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，剩余的總RNA進(jìn)行DNA消化后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體方法參考說明書(TaKaRa DRR047A)進(jìn)行，合成后的cDNA于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0056]RT - PCR檢測模板:轉(zhuǎn)基因植株cDNA、陽性質(zhì)粒樣品、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓阠DNA ;其余同PCR檢測，結(jié)果見圖2。
[0057]實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因煙草矮化性狀分析
[0058]5.1轉(zhuǎn)基因煙草植株形態(tài)指標(biāo)的測定
[0059]轉(zhuǎn)基因植株在莖和葉的形態(tài)上發(fā)生了顯著變化(圖3)，移栽后80d野生型煙草對照株系已到達(dá)盛花期，而轉(zhuǎn)基因株系2 -1剛進(jìn)入開花初期，但花序數(shù)量明顯減低。2 - 4則還未有花期的跡象，表現(xiàn)出花期延遲的現(xiàn)象。且植株明顯矮小，葉型緊湊。為了更精確的量化這些現(xiàn)象，對移栽80天的對照和轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行株高、節(jié)間、莖粗、葉片長度(從葉基部到葉尖)和葉片寬度(葉片最寬距離)的測量，計算葉片長寬比。表1結(jié)果顯示2個轉(zhuǎn)基因株系株高均與對照有極顯著差異，2 - 1、2 - 4的株高為對照的59.31%和32.11%。另外，轉(zhuǎn)基因株系節(jié)間距離縮短，為野生型煙草的82.64%和32.23% ;莖粗增粗，比野生型煙草增長34.30%和64.98% ;葉片長度縮短，為野生型煙草的66.21 %和52.94% ;葉片寬度增大，比野生型煙草增長30.16%和4.37% ;以上指標(biāo)均到達(dá)極顯著差異水平。
[0060]野生型煙草和轉(zhuǎn)基因株系的生長趨勢大體相同，在移栽后20d之前長勢區(qū)別不大。但在移栽后60d-80d野生型煙草快速增長的期間，轉(zhuǎn)基因株系的株高并沒有大幅度的提高，而繼續(xù)保持和緩的生長趨勢(圖4)。
[0061]于移栽后30d對轉(zhuǎn)基因煙草植株及對照噴施100mg/L的GA3。每周兩次，連續(xù)噴施。30天后觀察表型發(fā)現(xiàn)，通過施用外源GA3處理，轉(zhuǎn)基因植株節(jié)間迅速伸長，能夠正常開花，可恢復(fù)正常表型如圖5。
[0062]表1轉(zhuǎn)DkGA2ox2基因植株形態(tài)指標(biāo)的測定
[0063]
【權(quán)利要求】
1.‘南通小方柿’ DkGA2ox2基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述的DkGA2ox2基因的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體是將所述的DkGA2ox2基因插入到表達(dá)載體pYH4215的BamHI和SacI酶切位點(diǎn)之間所得。
4.含有權(quán)利要求1所述的DkGA2ox2基因的宿主菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌為農(nóng)桿菌。
6.權(quán)利要求1所述的DkGA2ox2基因在創(chuàng)制矮化新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的含有DkGA2ox2基因的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制矮化新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用 。
【文檔編號】C12N1/21GK103993024SQ201410243661
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】渠慎春, 屠煦童, 辛璐, 宋少華, 蔡斌華, 余心怡, 候應(yīng)軍, 章鎮(zhèn) 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)