一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)引物組、試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了凝結(jié)芽孢桿菌LAMP檢測(cè)的引物組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明所建立的凝結(jié)芽孢桿菌LAMP檢測(cè)方法特異、靈敏、簡(jiǎn)便快捷，1.5h內(nèi)可完成，能用于樣品的快速檢測(cè)。
【專利說明】一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)引物組、試劑盒及其方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，具體涉及尤其涉及用于凝結(jié)芽孢桿菌 LAMP檢測(cè)的引物組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 凝結(jié)芽孢桿菌(ifeciBiAs coagw/afls)呈桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏陽(yáng)性菌，過氧化氫 酶陽(yáng)性，芽胞端生，無鞭毛。最適生長(zhǎng)溫度為45?50°C，最適pH值為6. 6?7.0。其能分 解糖類生成L-乳酸，為同型乳酸發(fā)酵菌。凝結(jié)芽孢桿菌是造成罐頭食品平蓋酸敗和乳制 品變質(zhì)主要微生物。傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)已經(jīng)漸漸不適應(yīng)食品生產(chǎn)車間的快速節(jié)奏，熒光定量 PCR被運(yùn)用于食品廠中，檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌的存在。然而PCR法需要昂貴的PCR儀，并且操 作繁雜，在實(shí)際運(yùn)用中很受限制。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)是2000年Notomi等人開發(fā)出來的一項(xiàng)新技術(shù)，利用 4條引物，并選擇性地使用環(huán)引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，可使靶基因在 60 min內(nèi)得到大量擴(kuò)增。反應(yīng)中，模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，從而保證引 物可以在等溫條件下順利與模板結(jié)合，并進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。竇明理等基于SP00A基因 設(shè)計(jì)出了凝結(jié)芽孢桿菌的LAMP引物組，該引物組專一性不強(qiáng)，能同時(shí)檢查多種耐熱芽孢桿 菌，而且SP00A基因存在于很多微生物當(dāng)中，不能針對(duì)性檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌。
[0005] 經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索未發(fā)現(xiàn)特異檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌的LAMP檢測(cè)的引物 組、檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法相關(guān)研究報(bào)道，因此研制凝結(jié)芽孢桿菌LAMP檢測(cè)的引物組、 檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法十分必要。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)引物組、試劑盒及其方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)所 存在的上述缺點(diǎn)和不足。
[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種凝結(jié)芽孢桿菌LAMP檢測(cè)用引物組。本發(fā)明的第 二個(gè)目的是提供凝結(jié)芽孢桿菌LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供凝結(jié)芽孢桿 菌LAMP檢測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明的檢測(cè)方法經(jīng)過一次簡(jiǎn)單的恒溫?cái)U(kuò)增，就可以達(dá)到快速檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌 的目的。采用該試劑盒和檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 作為本發(fā)明的第一方面，一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)的引物組，其特征在于，所述引物組以 凝結(jié)芽孢桿菌CK基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物：內(nèi)引物FIP/ BIP和外引物F3/B3,其核苷酸序列與SEQ ID N0. 1-4相同。 toon] 其中，所述兩對(duì)引物分別為： 外引物 F3 :TTTTGGCTCACGGAAGAG (SEQ ID NO. 1)， 外引物B3:TGAACTGGCAGTCATACG(SEQIDNO·2)， 內(nèi)引物 FIP :AGAACGCCTTCAAAATCGCACTT TTAGCTTGAATTATTACGGGAC (SEQ ID NO. 3), 內(nèi)引物 BIP :AACTTTAATAAGGCACCGATTGT GGTTTTATCTCGGGGATTTTGTCG (SEQ ID NO. 4)〇
[0012] 作為本發(fā)明的第二方面，一種采用所述的引物組的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，其 特征在于：所述試劑盒包含：引物組、陽(yáng)性對(duì)照品、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和顯色液。
[0013] 其中，所述引物組，包括內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3,其核苷酸序列與SEQ ID NO. 1-4相同，所述外引物和內(nèi)引物添加的摩爾比為1 :4?8。
[0014] 其中，所述陽(yáng)性對(duì)照品為含有凝結(jié)芽孢桿菌的基因組DNA。
[0015] 其中，所述 LAMP 反應(yīng)液中含有 0· 6 ?1. 4mmol/L dNTP，5 ?10 mmol/L Mg2+， 0· 5 ?L 2mol/L Betaine,10XThermopol Buffer。
[0016] 其中，所述Bst DNA聚合酶和顯色液為市售，顯色液為GeneFinder。
[0017] 作為本發(fā)明的第三方面，一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)方 法，其特征在于：包括以下的步驟： (1) 提供待測(cè)樣品DNA ; (2) 在LAMP反應(yīng)體系中加入所述引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增 反應(yīng)后滅活； (3) 滅活后部分產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時(shí)對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照品的顯色結(jié)果， 若顯色結(jié)果一致，說明待測(cè)樣品中含有凝結(jié)芽孢桿菌，若顯色結(jié)果不一致，則說明待測(cè)樣品 中不含有凝結(jié)芽孢桿菌。
[0018] 步驟（2)中，所述恒溫反應(yīng)的溫度范圍為58°C，反應(yīng)時(shí)間為80min。
[0019] 步驟（3)中，所述滅活的溫度為80°C，滅活時(shí)間為10min。
[0020] 本發(fā)明的有益效果： 1、該凝結(jié)芽孢桿菌LAMP方法操作簡(jiǎn)單，具有良好的特異性。
[0021] 2、該快速反應(yīng)試劑盒反應(yīng)條件溫和，所需儀器簡(jiǎn)單，擴(kuò)增快速高效，不到1.5h可 完成，與PCR相比更快速、經(jīng)濟(jì)，適用面更廣。
[0022]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為實(shí)施例1中凝結(jié)芽孢桿菌LAMP引物對(duì)種細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0024] Μ 泳道為標(biāo)準(zhǔn) DNA marker 2000。
[0025] 1號(hào)泳道為凝結(jié)芽孢桿菌的擴(kuò)增結(jié)果。
[0026] 2-6號(hào)泳道分別為含有枯草芽胞桿菌、蠟狀芽孢 桿菌（ZfeciBws cerews)、巨大芽抱桿菌(ifeciBws 地衣芽抱桿菌 iBacilluslicheniformii)私欠[麗後取{Escherichia coli、。
[0027] 圖2為實(shí)施例1中凝結(jié)芽孢桿菌LAMP引物對(duì)種細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用GeneFinder 染色圖。
[0028] 1號(hào)管為凝結(jié)芽孢桿菌的擴(kuò)增結(jié)果。
[0029] 2-6號(hào)管分別為含有枯草芽胞桿菌、蠟狀芽孢 桿菌（ZfeciBws cerews)、巨大芽抱桿菌(ifeciBws 地衣芽抱桿菌 、Bacilluslicheniformii)、卞施妖屬標(biāo)樣取{Escherichia coli、。
[0030] 圖3為實(shí)施例2中凝結(jié)芽孢桿菌LAMP引物對(duì)不同數(shù)量凝結(jié)芽孢桿菌的凝膠電泳 圖。
[0031] Μ 泳道為標(biāo)準(zhǔn) DNA marker 2000 1-5 號(hào)分別為 6cfu/體系、60 cfu/體系、600 cfu/體系、6000 cfu/體系、60000 cfu/ 體系。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施本發(fā)明的過程、 條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)， 本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0033] 實(shí)施例1 試驗(yàn)步驟 1、提取凝結(jié)芽抱桿菌枯草芽胞桿菌 錯(cuò)狀芽抱桿菌cereiAs)、地衣芽抱桿菌(^3<^7/〇57/<^61/7//〇/--/>5)、巨大芽抱桿 菌和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株C&cAericAia co/i)的DNA，上述菌種來源 見表1。
[0034] 2、以步驟1中的細(xì)菌DNA為模板，用凝結(jié)芽孢桿菌LAMP引物組進(jìn)行擴(kuò)增。
[0035] 擴(kuò)增體系為：25μ 1 由 2· 5μ 1 10XBuffer、9y ldNTP (2. 5mmol/L)、2y 1 FIP (20 mmol/L)、2μ 1 BIP (20 mmol/L)、0· 25 μ 1 F3 (20 mmol/L)、0· 25 μ 1 B3 (20 mmol/L)、 1 μ lBst DNA Polymerase (8υ/μ1)>2μ1 MgS04 (100 mmol/L) >4 μ IBetaine (5mol/L)> 2 μ 1 DNA 模板。
[0036] 擴(kuò)增條件為：58°C 80min進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，80°C滅活時(shí)間為10min，4°C保存。
[0037] 3、取5ul滅活產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，剩余液體產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色 結(jié)果。
[0038] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出本實(shí)施方式用擴(kuò)增凝結(jié)芽孢桿菌的特異LAMP 引物能夠從凝結(jié)芽孢桿菌DNA中擴(kuò)增出大量的梯度大小核酸片段，而未能從其他屬細(xì)菌 DNA中擴(kuò)增出核酸片段。
[0039] 如圖2所示，凝結(jié)芽孢桿菌DNA用凝結(jié)芽孢桿菌的特異LAMP引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增 的液體產(chǎn)物加 GeneFinder后呈草綠色，而其他屬細(xì)菌DNA用凝結(jié)芽孢桿菌的特異LAMP引 物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增的液體產(chǎn)物加 GeneFinder后呈橙黃色。
[0040] 圖1和圖2顯示結(jié)果一致，都說明了凝結(jié)芽孢桿菌的特異LAMP引物特異性好。
[0041] 表1菌種來源表

【權(quán)利要求】
1. 一種凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)的引物組，其特征在于，所述引物組以凝結(jié)芽孢桿菌CK基因 為靶基因、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物：內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3,其 核苷酸序列與SEQ ID NO. 1-4相同。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述兩對(duì)引物分別為： 外引物 F3 :ITTTGGCTCACGGAAGAG， 外引物 B3 :TGAACTGGCAGTCATACG， 內(nèi)引物 FIP :AGAACGCCTTCAAAATCGCACTT TTAGCTTGAATTATTACGGGAC, 內(nèi)引物 BIP :AACTTTAATAAGGCACCGATTGT GGTTTTATCTCGGGGATTTTGTCG。
3. -種采用如權(quán)利要求1所述的引物組的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所 述試劑盒包含：引物組、陽(yáng)性對(duì)照品、LAMP反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和顯色液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述引物組，包括內(nèi) 引物FIP/BIP和外引物F3/B3,其核苷酸序列與SEQ ID NO. 1-4相同，所述外引物和內(nèi)引物 添加的摩爾比為1 :4?8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述陽(yáng)性對(duì)照品為 含有凝結(jié)芽孢桿菌的基因組DNA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述LAMP反 應(yīng)液中含有 〇· 6 ?1. 4mmol/L dNTP，5 ?10 mmol /T, Mg2+，0· 5 ?1. 2mol/L Betaine， 10XThermopol Buffer。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述Bst DNA聚合 酶和顯色液為市售，顯色液為GeneFinder。
8. -種如權(quán)利要求3所述凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)試劑盒的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)方法，其特征 在于：包括以下的步驟： (1) 提供待測(cè)樣品DNA ; (2) 在LAMP反應(yīng)體系中加入所述引物組、LAMP反應(yīng)液、BstDNA聚合酶，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增 反應(yīng)后滅活； (3) 滅活后部分產(chǎn)物加入顯色液，觀察顯色結(jié)果，并同時(shí)對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照品的顯色結(jié)果， 若顯色結(jié)果一致，說明待測(cè)樣品中含有凝結(jié)芽孢桿菌，若顯色結(jié)果不一致，則說明待測(cè)樣品 中不含有凝結(jié)芽孢桿菌。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（2)中，所述恒溫 反應(yīng)的溫度范圍為58°C，反應(yīng)時(shí)間為80min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（3)中，所述滅活 的溫度為80°C，滅活時(shí)間為lOmin。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104152543SQ201410243762
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】符雷, 郗洪生, 施騰鑫, 陸亞怡 申請(qǐng)人:江蘇恒豐強(qiáng)生物技術(shù)有限公司