烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種烏頭酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。編碼該突變體的基因序列如SEQ?ID?No.2所示。本發(fā)明通過基因工程方法使黑曲霉中烏頭酸酶編碼基因突變，降低其酶活力，經(jīng)計(jì)算，烏頭酸酶突變體的酶活力與野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理論上可提高檸檬酸的產(chǎn)量和/或產(chǎn)率。
【專利說明】烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸，又名枸櫞酸，化學(xué)名稱是2-羥基丙烷-1，2, 3-三羧酸。因其具有令人愉悅 的酸味，人口爽快，無后酸味，安全無毒，已成為當(dāng)前世界上生產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的食用有 機(jī)酸。世界上檸檬酸行業(yè)的集約化程度非常高，生產(chǎn)重心已轉(zhuǎn)移至中國，我國檸檬酸產(chǎn)量和 出口量已連續(xù)多年居世界第一。2008年，我國檸檬酸產(chǎn)能達(dá)到10萬噸，占世界總量的70% 左右，其中70-80%用于生產(chǎn)飲料、食品，其余用于醫(yī)藥、化工、環(huán)保、化妝品、紡織、印染、建 筑等各個(gè)領(lǐng)域。
[0003] 黑曲霉（Aspergillus niger)是生產(chǎn)朽1檬酸最常見的菌株，已有報(bào)道稱黑曲霉在 發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸過程中存在三羧酸循環(huán)的酶系，其中由檸檬酸到異檸檬酸，即檸檬酸一順 烏頭酸一異檸檬酸，兩步反應(yīng)均由烏頭酸酶（aconitase，AC0)催化。因此阻斷檸檬酸向下 的代謝是檸檬酸的積累關(guān)鍵，即阻斷烏頭酸酶的催化反應(yīng)。通過基因工程方法使黑曲霉中 烏頭酸酶編碼基因突變，降低其酶活力，理論上可提高檸檬酸的產(chǎn)量和/或產(chǎn)率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的烏頭酸酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所 示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006] 與野生型的烏頭酸酶（野生型烏頭酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3和4所示）相比，本發(fā)明的烏頭酸酶突變體具體的氨基酸序列的改變是：M226V(第226 位甲硫氨酸變?yōu)槔i氨酸），N227Y (第227位天冬酰胺變?yōu)槔野彼幔?，T376N (第376位蘇氨酸 變?yōu)樘於０罚珹377T (第377位丙氨酸變?yōu)樘K氨酸），S529P (第529位絲氨酸變?yōu)楦?酸），I530M(第530位異亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼幔?，H580R(第580位組氨酸變?yōu)榫彼幔?br> [0007] 本發(fā)明還提供編碼所述烏頭酸酶突變體的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 本發(fā)明還提供含有編碼所述烏頭酸酶突變體基因的載體、。
[0009] 本發(fā)明還提供含有編碼所述烏頭酸酶突變體基因、或上述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及 工程菌。
[0010] 本發(fā)明還提供編碼所述烏頭酸酶突變體的基因在提高發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)量中的 應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明還提供用于PCR特異性擴(kuò)增編碼所述烏頭酸酶突變體的基因的引物對，所 述引物對為：
[0012] 正向引物：5，-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3，
[0013]反向引物：5，-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3，。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述烏頭酸酶突變體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0015] (1)從黑曲霉（Aspergillus niger)基因組DNA中，擴(kuò)增AC0的編碼基因 aco ;
[0016] ⑵采用易錯(cuò)PCR技術(shù)，以AC0的編碼基因 aco為模板，擴(kuò)增獲得AC0突變體基因；
[0017] (3)將步驟（2)所得易錯(cuò)PCR產(chǎn)物及表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)用Sac I和Not I雙酶 切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布至含Kan的LB平板，將平板 置37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即得構(gòu)建得到重組AC0基因突變庫；
[0018] (4)含Kan的LB平板上長出菌落，挑取其中的100個(gè)單克隆，轉(zhuǎn)接到含Kan的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)，待菌液0D_長至0. 8時(shí)，加入終濃度為0. 2mM的IPTG誘導(dǎo)， 放回37°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)12h后，收集菌體，超聲破碎，測定AC0野生型和突變體酶活，挑選酶 活力最低的一株，并測定其基因序列（SEQ ID N0. 2)。
[0019] 本發(fā)明通過基因工程方法使黑曲霉中烏頭酸酶編碼基因突變，降低其酶活力，經(jīng) 計(jì)算，烏頭酸酶突變體的酶活力與野生型蛋白的酶活相比，降低了 73 %，理論上可提高檸檬 酸的產(chǎn)量和/或產(chǎn)率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中野生型烏頭酸酶基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0021] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中烏頭酸酶突變體蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果；其中，1為 未誘導(dǎo)的菌體經(jīng)超聲破碎后，離心所得上清，2為烏頭酸酶野生型蛋白，3為烏頭酸酶突變 體蛋白。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0023] 實(shí)施例1烏頭酸酶基因的獲得
[0024] 以 lyg黑曲霉（Aspergillus niger)基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，按SEQ ID N0.4 的序列設(shè)計(jì)正向引物 AC0-F 為 5' -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3'，反向引物 AC0-R 為Y -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。其中，斜體字母部分分別為酶切位點(diǎn)Sac I和Not I。PCR反應(yīng)在50 μ 1總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在94°C變性5min后開始循環(huán)； 94°C變性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；再于72°C延伸10min。取3μ 1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖1所示。取100 μ 1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳，按照膠回收試劑盒的步驟回收目的片段。
[0025] 實(shí)施例2野生型烏頭酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0026] 實(shí)施例1中PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I和Not I雙酶切消化后，與同樣用Sac I和Not I內(nèi)切酶消化的pET-28a(+)質(zhì)粒（Novagen公司）進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建的載體被稱 為pET-ACO,然后用連接產(chǎn)物pET-ACO混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5- α (購自promega公司）， 并進(jìn)行序列測定提取轉(zhuǎn)化菌體庫的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株（Promega公司）。
[0027] 實(shí)施例3易錯(cuò)PCR擴(kuò)增黑曲霉烏頭酸酶基因
[0028] 利用Taq DNA聚合酶不具有3' -5'校對功能的性質(zhì)，在高鎂離子濃度（5-9mmol/ L)和不同濃度dNTP的濃度下（1. 5-3. 5mmol/L)，來控制隨機(jī)突變的頻率，向目的基因中引 入隨機(jī)突變，構(gòu)建突變庫。實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)的突變率約為〇. 6 %。
[0029] 易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系（100 μ 1):
[0030] lOxPCR反應(yīng)緩沖液 丨Ομ丨 dATP 2 μ? dTTP 4 μ? dCTP 4 ul dGTP 2 μ? MgCb 6 μ? 正向引物 4μ1 反向引物 4μ1 DNA模板（實(shí)施例]PCR片段） 4μ1 TaqDNA聚合酶 1 μ? ddH20 59 μ I 總體積 100 μΙ
[0031] PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?6°C預(yù)變性4min ;94°C變性lmin，56°C退火lmin，75°C延伸 2min，共45個(gè)循環(huán)；最后75°C延伸15min。采用膠回收方法回收PCR產(chǎn)物。取5μ1產(chǎn)物進(jìn) 行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032] 實(shí)施例4 pET-ACOM表達(dá)載體的構(gòu)建
[0033] 實(shí)施例3中PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I和Not I雙酶切消化后，與用Sac I 和Not I內(nèi)切酶消化的pET-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建的載體被命名為pET-ACOM，然 后用連接產(chǎn)物pET-ACOM混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，構(gòu)建轉(zhuǎn)化菌體突變庫。
[0034] 實(shí)施例5構(gòu)建表達(dá)突變庫及高產(chǎn)量突變體的篩選
[0035] 提取轉(zhuǎn)化菌體庫的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，獲得轉(zhuǎn)化子約100 株，構(gòu)建表達(dá)突變體庫。挑取突變菌株至含kan的LB培養(yǎng)基（150 μ 1/孔）的96孔板中， 37°C、150rpm培養(yǎng)，待0D值達(dá)0. 6-0. 8,加入IPTG (終濃度0. 2mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集 菌體。超聲破碎菌體，離心收集上清，并進(jìn)行酶活測定。檢測酶活性最低的菌株，并挑選其克 隆，并提取質(zhì)粒，測定與野生型烏頭酸酶對應(yīng)的基因序列。測定的基因序列為SEQ ID N0. 2 所示，其對應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示。烏頭酸酶突變體蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié) 果如圖2所示。
[0036] 烏頭酸酶的酶活檢測：按照烏頭酸酶活性檢測試劑盒（Biovision公司）進(jìn)行。經(jīng) 計(jì)算，野生型蛋白的酶活為6. 3u/L，突變體蛋白的最低酶活為1. 7u/L，結(jié)果表明，通過易錯(cuò) PCR對AC0進(jìn)行改造，獲得了酶活力降低了 73 %的突變株。
[0037] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0001] 序列表 <110〉安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司 <120〉烏頭酸酶突變體、其編碼基因及應(yīng)用 <130> KHP141112765.8 <160> 6 <170> Patentln version 3,3 <2丄0>丄 <211> 817 <212〉 PRT <213〉烏頭酸酶突變體 <400> 1 Met Gly Asp Ala Ser Glu Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Val Leu 15 10 15 Gin Gin Thr Arg Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Ala Leu 20 25 30 Pro Thr \mi Gly Asn Leu i.nu Thr Gin f.eu Va.1 Arg Va.1 Val Asp Ala 35 40 45 Leu Arg Ala Gin Asp His Pro Arg Glu Ala Asn. Ala Leu Thr Asp Val 50 55 60 Leu Ala丄ie Ser Gin Gin Pro Thr G丄u Met G丄y Gly Leu G丄y leu Ser 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ala Glu lie Thr Phe Leu 85 90 95 Val Thr Ala Trp Leu Glu Ala Leu Asn Ser Ala Asp Arg Ala Arg Ala 100 105 110 Pro Pro Val Pro Leu Ala Val Arg Pro Pro Gly Arg Arg Gly MeL Thr 115 120 125 \.f)U Ser Glu T,ys Tie Phe Ala i,eu His Asp f,eu Gly Arg Lys Gly Ser 130 135 .140 Val Ala Pro Gly Glu Leu Lie Arg Val Asp Val Asp Trp Val lie Ala 145 150 155 160 Ser Glu Aia Ser Trp Gin G丄y Met Giu G丄n Thr Tyr Glu Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly lie Tyr Arg Asn Asp Arg Phe Trp Leu Ala Gly Asp His 180 185 190 Val Val Asp Pro Arg Val Asn Glu Val Pro Lys Val Lys Ala Leu lie 195 200 205 Asp Ala Ser Glu Arg Ala Lys Arg Val Phe Lys Mel Thr Asp Tyr Glri 210 215 220 Gly Val Tyr Tyr Thr Tift ?,^ιι His Thr Glu Phe Tyr Arg Gin Arg Ala 225 230 235 240 Gin Pro Gly Met Val Val Val Gly Ser Asp Ser His Thr Cys Ser Ser 245 250 255
[0002] Gly Ala Leu Gly Cys Leu Ala lie Gly Leu Gly Ala Ala Asp Val Thr 260 265 270 Leu Pro Leu Val Thr Gly Glu Thr Trp Phe Lys Val Pro Glu Ser Val 275 280 285 Asn lie Arg Leu Val Gly Ala Pro Lys Pro Gly lie Gly Gly Lys Asp 290 295 300 Thr lie Leu Tyr lie Leu Gin Gin Leu Lys Arg Asn Thr Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Arg lie Val Glu Phc Thr Gly Pro G丄y Val Lys His Leu Ser Cys 325 330 335 Asp Ala Arg Phe Ala He Ser Asn Met Thr Thr Glu Phe Gly Gly lie 340 345 350 Thr Gly Val Phe Val Pro Asp Gin He Thr Glu Glu Phe lie Gin Lys 355 360 365 Arg Arg Leu Pro Arg His Lys Asn Thr Ser Val Tyr Phe Lys Pro Asp 370 375 380 Asp Asp Ala Glu Tyr Ala Glu Thr His Glu lie Asp Leu Gly Glu Val 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu Ala Lys Tyr Pro Asn Pro Asp Asp Val Val Pro Val 405 410 415 Thr Glu Gin Glu Gly Met His Leu Asp Gly Cys Phe lie Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Thr Ala Glu Glu Asp Leu lie Leu Gly Ala Leu Val Leu Glu Gin 435 440 445 Gly Leu Gin Asn Gly Leu Lys Pro Val Ser His Gly Lys Arg Lys Val 450 455 460 Val Pro Gly Ser Val Pro lie Leu His Arg Leu Arg Glu Leu Gly Leu 465 470 475 480 Ala Gin lie Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Glu lie Gly lie Pro Gly Cys 485 490 495 Ser Tyr Cys Val Gly Met Ser Ala Asp G丄n Ala G_Ly Pro G丄y Glu Val 500 505 510 Trp 丄丄e Ser Ser Gin Asn Arg Asn Phe G丄u Asn Arg Met G丄y Lys Gly 515 520 525 Pro Met Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ser Phe 530 535 540 Glu Met Lys [,eu i,ys Asp Pro His Glu Tyr Leu Ala Ala Tie Asp Leu 545 550 555 560 Glu Arg Trp His Thr Leu Arg Gly Va.1 Ser Va.l Ser Ala. Thr Asp Ser 565 570 575 Thr Gin Glu Arg lie Ser Tyr Met Glu Pro Ser Gly Ser Ala Thr Ala 580 585 590 Glu Ala Lys Thr Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Val Thr Glu Ala Asn 595 600 605
[0003] Thr Pro Glu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Asp Leu Met Thr Glv Lys 610 615 620 Val Gin Arg Leu Gly Asp Phe He Asp Thr Asp Ala Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640 Gin Pbe Leu He Gly Met Ser Asn Asn Gin lie Ala Gly G]u His Cys 645 650 655 Leu Glu His Thr His Pro Glu Phe Arg Gin Arg Val Lys Asp Gly Phe 660 665 670 Asn lie Val Val Ala Gly Lys Ala Phe Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu 675 680 685 Gin Ala Val Met Ala Leu Leu Gly Cys Gly Val Gin Cys Val lie Ala 690 695 700 Lys Ser Tyr Ser Phe He Phe Gin Arg Asn Met Pro Ser Leu Gly Leu 705 710 715 720 Leu Gly lie Thr Leu Thr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Ala Ala Gin Asp 725 730 735 Gly Asn Glu He Ser He Asp Phe Lys Thr Lys Val lie Asn Val Asp 740 745 750 Gly Lys Gin Tyr Ala Phe Gin Leu Ser Gin Met Glu Arg Glu Leu Phe 755 760 765 Gin His Gly Gly lie Ala Ser Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Arg Leu 770 775 780 Phe Glu Gin Met Thr Arg Pro Lys Asn Leu Gly Gly Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Ala Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ser Ala Gly Pro His Ala Gly Leu Gin 805 810 815 Trp <210> 2 <211> 2531 <212> DNA <213〉烏頭酸酶突變體基因 <400> 2 atgggtgacg ccagcgaacc atatgcccct tcgctgctgc tggtatigca gcaaacccgg 60 gatgtcgtcc tctccgaggc agacacatac gcattgccga ccctaggaaa tctgcttacc 120 cagctggtgc gagtggtcga tgcacttcga gcgcaggacc acccccggga ggccaatgcc 180 ctcaccgatg tcctcgcgat cagccaacaa cccacggaga tgggaggact cggtctatcc 240 gaagcggana rtntgacarc cgagcaggaa gctgaaatca cnttcrtggt gacggrgtgg 300 ctcgaagctt tgaactcagc cgatcgcgcc agggcaccgc ccgttccgct cgcggtccga 360 ccccccggtc gacgtggcat gacgctgagt gagaagatct ttgcgcttca cgatcttggt 420 cgcaagggat ccgtggcgcc tggggagttg atccgggtgg acgtcgactg ggttattgct 480 tccgaKKcat catggcaggg catggaacaa acgtatgagc gtctcgggaa acctggaalc 540 tatcggaatg accggttctg gctggcggga gatcatgttg tggaccctcg cgtgaatgag 600 gtccccaaag ttaaggcatt gattgacgct agtgagaggg ccaagcgtgt cttcaaaatg 660
[0004] accgactatc agggcgtgta ctatactatt cttcataccg agttctaccg cgagcgagcc 720 cagccgggta tggtggtcgt gggttccgat tcccacacct gctcgtccgg agcattaggc 780 tgcctggcca ttgggttggg cgcagccgat gtgacccttc cattggtcac cggagagacc 840 tggttcaaag tgcccga.atc ggtcaacatt cgtctcgtcg gtgctcccaa gcccggaa.tt 900 ggaggcaagg acacgatctt gtacatcctg caacaactga agcgaaacac cgtggccgca 960 gaccggattg tcgagttcac cggcccaggt gtgaaacatc tttcatgcga tgctcggttt 1020 gccattagca acatgactac agaattcggc ggaattaccg gtgtctttgt gcccgatcaa 1080 attacagaag aaltcatcca gaagcgacgt ctgccccgac acaaaaacac cagcgtctac 1140 ficgiitgfl.cgp, r,ga.gtangr,r, gaaa.occatg a.gatagar.ct tggcgaggtg 1200 cgatctttcc tggccaaata ccccaaccct gacgacgtcg ttccggtcac tgagcaggaa 1260 ggcatgcacc tggatggatg ctttattggt gcctgcacca ctgccgagga ggatctgatt 1320 ctcggtgctc tcgtgctgga acaagggctc cagaatggct. tgaagccagt. ttctcacgga 丄380 aagaggaagg UgLtccggg cLcagLgccc aLccUcaLd gactccgLga gcUgggcU 1440 gcgcagatct acgaggatgc tggatttgag atcggcattc caggatgcag ctactgtgtc 1500 ggaatgtcgg ctgatcaggc tggacctgga gaagtctgga tatcttccca gaaccgcaac 1560 tttgagaacc gtatgggcaa aggccccatg ggaaatcttg catcagctgc cactgttgcg 1620 gcatcgtctt tcgagatgaa gctgaaagat ccacatgaat acctcgcagc catcgatctc 1680 gaaagatggc ataccctccg cggtgtttct gtgtctgcaa cagactccac acaagaacgc 1740 atctcttata tggaacctag tggctccgcg actgcggagg caaagactgt tgactcacca 1800 gacgtcaagg taacagaggc aaatactcca gagacagcag atagctcttc gtccgacctc 1860 atgacaggca aagtgcagcg actgggcgat tttattgata ccgatgcttt ggcccctgcc 1920 cagtttctca tcggcatgtc aaacaatcag atcgcaggcg agcactgcct cgagcacacc 1980 caccccgagt ttcggcagcg cgtgaaagac ggcttcaata tcgtcgtggc aggcaaggca 2040 ttcggatgtg gatcgtcccg cgaacaagcg gtcatggcgc tgttaggctg cggcgtccaa 2100 tgtgtgattg rnaagtrata rtcatttatr ttrcagrgra nratgcrrag trttggtctt 2160 ttgggcatca cactgaccga cgaggagttt tacgacgcgg ctcaagacgg caac^agatt 2220 tccatagact tcaagaccaa ggtgatcaac gtggaiggga agcaatacgc tttccagttg 2280 agtcagatgg agcgggaact ctttcagcat ggcggtattg cgtcggcctt. ccagaaattt. 2340 g^aaaccggc LgLlcgagca gaLgacuiigu CGgaagaaLc Lgggggglgc caaglcccLL 2400 gcgctgcgtg gaagtgggga gagtgctggt ccgcatgcag gtttgcagtg gtagtagcct 2460 acttagtatc gtgaagatag tcttcagt.aa aacaagacgt agctttacta ttatgatatt 2520 cgttatgcat. g 2531 <210> 3 <211> 817 <212> PRT <213〉野生型烏頭酸酶 <400> 3 Met Gly Asp Ala Ser Glu Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Leu Leu Val Leu 15 10 15 Gin Gin Thr Arg Asp Val Val Leu Ser Glu Ala Asp Thr Tyr Ala Leu 20 25 30 Pro Thr Leu Gly Asn Leu Leu Thr Gin Leu Val Arg Val Val Asp Ala. 35 40 45 Leu Arg Ala Gin Asp His Pro Arg Glu Ala Asn Ala Leu Thr Asp Val
[0005] 50 55 60 Leu Ala lie Ser Gin Gin Pro Thr Glu Met Gly Gly Leu Gly Leu Ser 65 70 75 80 Glu Ala Asp Thr Leu Thr Pro Glu Gin Glu Ala Glu lie Thr Phe Leu 85 90 95 Va.1 Thr Ala Trp ]>e\i Glu Ala Leu Asn Ser Ala Asp Arg Ala. Arg Ala. loo 105 no Pro Pro Val Pro Leu A丄a Val Arg Pro Pro Gly Arg Arg Gly Met Thr 115 120 125 Leu Ser Glu Lys lie Phe Ala Leu His Asp Leu Gly Arg Lys Gly Ser 130 135 140 Val Ala Pro Gly Glu Leu lie Arg Val Asp Val Asp Trp Val lie Ala 145 150 155 160 Ser Glu Ala Ser Trp Gin Gly Met Glu Gin Thr Tyr Glu Arg Leu Gly 165 170 175 Lys Pro Gly He Tyr Arg Asn Asp Arg Phe Trp Leu Ala Gly Asp His 180 185 190 Val Val Asp Pro Arg Val Asn Glu Val Pro Lys Val Lys Ala Leu lie 195 200 205 Asp Ala Ser Glu Arg Ala Lys Arg Val Phe Lys Met Thr Asp Tyr Gin 210 215 220 Gly Met Asn Tyr Thr Tie i,eu His Thr Glu Phe Tyr Arg Glu Arg Ala 225 230 235 240 Gin Pro Gly Met Val Val Val Gly Scr Asp Scr His Thr Cys Scr Scr 245 250 255 Gly Ala Leu Gly Cys Leu Ala lie Gly Leu Gly Ala Ala Asp Val Thr 260 265 270 Leu Pro Leu Val Thr Gly G丄u Thr Trp Phe Lys Val Pro G·丄u Ser Vai 275 280 285 Asn lie Arg Leu Val Gly Ala Pro Lys Pro Gly lie Gly Gly Lys Asp 290 295 300 Thr lie Leu Tyr He Leu Gin Gin Leu Lys Arg Asn Thr Val Ala Ala 305 310 315 320 Asp Arg lie Val Glu Phe Thr Gly Pro Gly Val Lys His Leu Ser Cys 325 330 335 Asp Ala Arg Phe Ala He Ser Asn Met Thr Thr Glu Phe Gly Gly lie 340 345 350 Thr Gly Va.1 Phe Val Pro Asp Gin Tie Thr Glu Glu Phe Tie Gin I,ys 355 360 365 Arg Arg Leu Pro Arg His Lys Thr Ala Ser Val Tyr Phe Lys Pro Asp 370 375 380 Asp Asp Ala Glu Tyr Ala -Glu Thr His Glu He Asp Leu Gly Glu Val 385 390 395 400 Arg Ser Phe Leu A丄a Lys Tyr Pro Asn Pro Asp Asp Val Vai Pro Val
[0006] 405 410 415 Thr Glu Gin Glu Gly Met His Leu Asp Gly Cys Phe lie Gly Ala Cys 420 425 430 Thr Thr Ala Glu Glu Asp Leu lie Leu Gly Ala Leu Val Leu Glu Gin 435 440 445 Gly Leu Gin Asn Gly Leu Lys Pro Val Ser His Gly Lys Arg Lvs Val 450 455 460 Val Pro Gly Ser Val Pro lie Leu His Arg Leu Arg Glu Leu Gly Leu 465 470 475 480 Ala Gin lie Tyr Glu Asp Ala Gly Phe Glu He Gly lie Pro Gly Cys 485 490 495 Ser Tyr Cys Val Gly Met Ser Ala Asp Gin Ala Gly Pro Gly Glu Val 500 505 510 Trp lie Ser Ser Gin Asn Arg Asn Phe Glu Asn Arg Met Gly Lys Gly 515 520 525 Ser lie Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ala Thr Val Ala Ala Ser Ser Phe 530 535 540 Glu Met Lys Leu Lys Asp Pro His Glu Tyr Leu Ala Ala lie Asp Leu 545 550 555 560 Glu Arg Trp His Thr Leu Arg Gly Val Ser Val Ser Ala Thr Asp Ser 565 570 575 Thr Gin Glu His lie Ser Tyr Met Glu Pro Ser Gly Ser Ala Thr Ala 580 585 590 Glu Ala Lys Thr Val Asp Ser Pro Asp Val Lys Val Thr Glu Ala Asn 595 600 605 Thr Pro Glu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Asp Leu Mel Thr Gly Lys 610 615 620 Val Gin Arg Leu Gly Asp Phe lie Asp Thr Asp Ala Leu Ala Pro Ala 625 630 635 640 Gin Phe Leu lie Gly Met Ser Asn Asn Gin lie Ala Gly Glu His Cys 645 650 655 Leu Glu His Thr His Pro Glu Phe Arg Gin Arg Val Lys Asp Gly Phe 660 665 670 Asn lie Val Val Ala Gly Lys Ala Phe Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu 675 680 685 Gin Ala Val Met Ala Leu Leu Gly Cys Gly Val Gin Cys Val lie Ala 690 695 700 Lys Ser Tyr Ser Phe He Phe Gin Arg Asn Met Pro Ser Leu Gly Leu 705 710 715 720 Leu Gly lie Thr Leu Thr Asp Glu Glu Phe Tyr Asp Ala Ala Gin Asp 725 730 735 Gly Asn Glu He Ser lie Asp Phe Lys Thr Lys Val He Asn Val Asp 740 745 750 Gly Lys Gin Tyr Ala Phe Gin Leu Ser Gin Met Glu Arg Glu Leu Phe
[0007] 755 760 765 Gin His Gly Gly lie Ala Ser Ala Phe Gin Lys Phe Gly Asn Arg Leu 770 775 780 Phe Glu Gin Met Thr Arg Pro Lys Asn Leu Gly Ala Lys Ser Leu 785 790 795 800 Ala. Leu Arg Gly Ser Gly Glu Ser Ala. Gly Pro His Ala. Gly i.eu Gin 805 810 815 Trp <210> 4 <211> 2531 <212> DNA <213〉野生型烏頭酸酶 <400> 4 atgggtgacg ccagcgaacc atatgcccct tcgctgctgc tggtattgca gcaaacccgg 60 gatgtcgtcc tctccgaggc agacacatac gcattgccga ccctaggaaa tctgcttacc 120 cagctggtgc gagtggtcga tgcacttcga gcgcaggacc acccccggga ggccaatgcc 180 ctcaccgatg tcctcgcgat cagccaacaa cccacggaga tgggaggact cggtctatcc 240 gaagcggaca ctctgacacc cgagcsggaa gctgaaatca ccttcctggt gacggcgtgg 300 ctcgaagctt tgaactcagc cgatcgcgcc agggcaccgc ccgttccgct cgcggtccga 360 ccccccggtc gacgtggcat gacgctgagt gagaagatct ttgcgcttca cgatctlggt 420 cgnnagggat nogtggcgoc tggggagttg atcogggtgg Rc.gtc.gnc.tg ggttattget 480 tccgaggcat catggcaggg catggaacaa acgtatgagc gtctcgggaa acctggaatc 540 tatcggaatg accggttctg gctggcggga gatcatgttg tggoccctcg cgtgaatgag 600 gtccccaaag ttaaggcatt gattgacgct agtgagaggg ccaagcgtgt cttcaaaatg 660 accgactatc agggcat.gaa ctatactatt cttcataccg agttctaccg cgagcgagcc 720 cagccgggta tggtggtcgt gggttccgat tcccacacct gctcgtccgg agcattaggc 780 tgcctggcca ttgggltggg cgcagccgat gtgacccttc cattggtcac cggagagacc 840 tggttcaaag tgcccgaatc ggtcaacatt cgtctcgtcg gtgctcccaa gcccggaatt 900 ggaggcaagg acacgatctt gtacat'cctg eaacaactga agcgaaacac cgtggccgca 960 gaccggattg tcgagttcac cggcccaggt gtgaaacatc tttcatgcga tgctcggttt 1020 gccattagca acargactac agaattcggc ggaattaccg gtgtctttgt gcccgatcaa 1080 atiacagaag aattcatcca gaagcgacgt ctgccccgac acaaaaccgc cagcgtctac 1140 ttcaaacccg atgatgacgc cgagtacgcc gaaacccatg aaatagacct tggcgaggtg 1200 cgatctttcc tggccaaata ccccaaccct gacgacgtcg ttccggtcac tgagcaggaa 1260 ggcatgcacc tggatggatg ctttattggt gcctgcacca ctgccgagga ggatctgatt 1320 ctcggtgctc tcgtgctgga acaagggctc cagaatggct tgaagccagt ttctcacgga 1380 aagnggaagg ttgrtrcggg ctcagtgrcc arnnttcata gactcrgtga gnttgggctt 1440 gcgcagatct acgaggatgc tggatt.tgag atcggcattc caggatgcag ctactgtgtc 1500 ggaatgtcgg ctgatcaggc tggacctgga gaagtctgga tatcttcGca gaaccgcaac 1560 tttgagaacc gtaigggcaa aggctccatc ggaaatcttg catcagctgc cacagttgcg 1620 gcatCKtctt Lc^agatgaa gctgaaagat ccacatgaat acctcgcagc catcgatclc 1680 gaaagatggc ataccctccg cggtgtttct gtgtctgcaa cagactccac acaagaacac 1740 atctcttata tggaacctag tggctccgcg actgcggagg caaagactgt tgactcacca 1800
[0008] gacgtcaagg taacagaggc aaatactcca gfigacfigcag atagctcttc gtccgacctc 1860 atgacaggca aagtgcagcg actgggcgat tttattgata ccgatgcttt ggcccctgcc 1920 cagtttctca tcggcatgtc aaacaatcag atcgcaggcg agcactgcct cgagcacacc 1980 caccccgagt ttcggcagcg cgtgaaagac ggcttcaata tcgtcgtggc aggcaaggca 2040 ttcggatgtg gatcgtcccg cgaacaagcg gtcatggcgc tgttaggctg cggcgtccaa 2100 tgtgtgattg ccaagtcata ctcatttatc ttccagcgca acatgcccag tcttggtctt 2160 "ttgggcatca cactgaccga cgaggagttt tacgacgcgg ctcaagacgg caacgagatt 2220 tGGatagact tcaagaGcaa ggtgatGaaG gtggatggga agcaatacgc tttGcagttg 2280 agtcagatgg agcgggaact ctttcagcat ggcggtattg cgtcggcctt ccagaaattt 2340 ggaaaccggc tgttcgagca gatgaccaga ccgaagaatc tggggggtgc caagtccctt 2400 gcgctgcgtg gaagtgggga gagtgctggt ccgcatgcag gtttgcagtg gtagtagcct 2460 acttagtatc gtgaagatag tcttcagtaa aacaagacgt agctttacta ttatgatatt 2520 cgttatgcat g 2531 <210> 5 <211〉 28 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 gatcgagctc atggggtgac gccagcga 28 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 6 gatcgcggcc gccatgcata acgaatatca 30
【權(quán)利要求】
1. 烏頭酸酶突變體，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或該序列經(jīng)替換、 缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。
3. 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5. 含有權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述載體的工程菌。
6. 權(quán)利要求2或3所述基因在提高發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
7. 用于PCR特異性擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的引物對，其特征在于，所述引物對 為： 正向引物：5 ^ -GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3 ' 反向引物：5' -GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3'。
【文檔編號】C12N1/19GK104087570SQ201410245359
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】李榮杰, 尚海濤, 楊為華, 鄧遠(yuǎn)德, 徐斌, 楊金環(huán) 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司