一種鯉魚肝損傷模型及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種用于篩選保肝藥物的鯉魚肝損傷模型及其應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二惡英對(duì)鯉魚肝組織切片進(jìn)行處理，建立鯉魚肝損傷模型，再用檢測(cè)藥物處理肝損傷模型，判斷藥物對(duì)鯉魚肝損傷的治療效果。本發(fā)明所建立的鯉魚肝損傷模型來(lái)源一致、培養(yǎng)環(huán)境可控、可重復(fù)性強(qiáng)，可滿足多種藥物的同批次篩選，周期短、大大節(jié)約藥物篩選所需時(shí)間和成本。
【專利說(shuō)明】一種鯉魚肝損傷模型及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鯉魚肝損傷模型，及將該模型應(yīng)用于篩選保肝藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]2，3，7，8_四氯二苯-對(duì)-二惡英CTCDD)是一種毒性很強(qiáng)的化合物，主要來(lái)源于工業(yè)垃圾以及農(nóng)藥濫用等，它不僅給水產(chǎn)和畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)生態(tài)平衡和人類健康也構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，研究二惡英的毒性機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前科學(xué)研究熱點(diǎn)之一，但是目前關(guān)于二噁英的毒性機(jī)制研究方面相關(guān)報(bào)道還比少。T⑶D是一種對(duì)魚產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的穩(wěn)定持久環(huán)境污染物，魚對(duì)水污染特別敏感，魚組織吸收了污染物會(huì)影響其許多生理和生化作用。通常情況下，TCDD是在肝中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，所以肝是TCDD的主要儲(chǔ)存部位和靶器官。
[0003]精密肝切片技術(shù)是一種新興的技術(shù)手段，既保留了肝細(xì)胞的功能特點(diǎn)，又維持了組織完整性，使該系統(tǒng)更接近在體情況。精密肝切片培養(yǎng)系統(tǒng)在預(yù)測(cè)藥物的體內(nèi)代謝和毒性方面比其他體外方法如混合肝細(xì)胞培養(yǎng)有更多的優(yōu)越性。對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物而言，國(guó)內(nèi)外沒有應(yīng)用魚類肝精密組織切片損傷模型來(lái)篩選魚類保肝藥物的報(bào)道，從而制約了魚類保肝藥物的研究和開發(fā)。將精密肝切片技術(shù)應(yīng)用于新魚藥開發(fā)方面有很大研究前景，對(duì)于研究藥物代謝分子機(jī)制及臨床用藥也具有很好的指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種鯉魚肝損傷模型，該模型建立方法重復(fù)性強(qiáng)、可滿足多種藥物的同批次篩選、周期短。
[0005]一種鯉魚肝損傷模型，由以下步驟制得:
[0006]步驟I，取鯉魚肝組織進(jìn)行肝切片；
[0007]步驟2，將步驟I所得肝切片用含濃度為0.1~0.6μ g/L的2，3，7，8_四氯二苯-對(duì)-二惡英的L-15培養(yǎng)基，在5% CO2、27°C條件下培養(yǎng)造模3~4小時(shí)；
[0008]步驟3，清洗掉2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二惡英，得到鯉魚肝切片損傷模型。
[0009]作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟I中鯉魚肝組織取出后置于預(yù)先以氧飽和的冰浴的L-15培養(yǎng)液中，用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行包被處理。
[0010]作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟I中肝切片的厚度為300μπι。
[0011]作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2所用的L-15培養(yǎng)基中，3，7，8_四氯二苯-對(duì)-二惡英的濃度為0.3 μ g/L。
[0012]資料顯示，TCDD對(duì)小龍奸的半數(shù)致死量為0.30 μ g/kg、對(duì)鱒魚的半數(shù)致死量為
0.171 μ g/kg，而在鯉魚上面未見有T⑶D半數(shù)致死量相關(guān)報(bào)道。通過(guò)試驗(yàn)中測(cè)定切片活力ATP發(fā)現(xiàn)，當(dāng)T⑶D濃度達(dá)到0.6 μ g/L時(shí)，切片活力極顯著下降，引起了切片重度損傷，這可能會(huì)造成切片中組織的死亡，從而對(duì)后面的給藥處理的恢復(fù)效果造成嚴(yán)重影響，因此沒有將濃度超過(guò)0.6 μ g/L。當(dāng)T⑶D濃度為0.3 μ g/L時(shí)，T⑶D實(shí)驗(yàn)組精密肝切片培養(yǎng)上清液中的GPT、GOT、SOD、MDA水平和肝切片勻漿液中LDH均有極顯著的升高，ATP活性出現(xiàn)極顯著降低，精密肝切片受到了明顯損傷。因此，0.3 μ g/L為造模的最佳濃度。
[0013]上述鯉魚肝損傷模型在篩選魚類保肝藥物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)在于:第一，來(lái)源一致、培養(yǎng)環(huán)境可控，因此可重復(fù)性強(qiáng)；第二，切片數(shù)量可根據(jù)需要進(jìn)行分離，可滿足多種藥物的同批次篩選，可比性強(qiáng)；第三，周期短，可大大節(jié)約藥物篩選所需時(shí)間和成本。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
[0016]鯉魚肝損傷模型的建立
[0017]選取重量為900g左右實(shí)驗(yàn)鯉魚用100mg/L的MS-222進(jìn)行麻醉，然后將麻醉好的鯉魚放入超凈工作臺(tái)無(wú)菌條件下取肝臟，置于預(yù)先以氧飽和的冰浴的L-15培養(yǎng)液中，選取約4mmX 4mm肝組織塊用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行包被處理，將包被好的肝組織塊放入含L-15培養(yǎng)液的切片機(jī)標(biāo)本槽中進(jìn)行切片，切片厚度為300 μ m，持續(xù)通氧。切片完成后，選取完整切片置于含ImL L-15培養(yǎng)基(含10%新生小牛血清、2.5 μ g/mL兩性霉素、0.lmg/mL鏈霉素、100IU/mL青霉素，ρΗ7.0)的12孔板中，6片/孔，放入5% C02、27°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。
[0018]將所得肝切片換用含T⑶D濃度為0、0.1,0.2,0.3,0.6 μ g/L的L_15培養(yǎng)基，在5% C02、27°C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)3h后留取上清培養(yǎng)基，并收集精密肝切片(用無(wú)菌鑷子夾取肝組織切片)制備組織勻漿(將取出的肝組織切片用PBS沖洗2遍，對(duì)精密肝切片進(jìn)行稱重，稱重結(jié)束后加入0.9%生理鹽水進(jìn)行研磨，肝組織與生理鹽水比例為1:9，制成10%的組織勻漿，3000r/min離心10min，留取上清液)，分別測(cè)定組織勻漿中乳酸脫氫酶(LDH)、三磷酸腺苷(ATP)和上清培養(yǎng)液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(S0D)、丙二醛(MDA)指標(biāo)。
[0019]表1不同濃度T⑶D對(duì)鯉魚肝切片培養(yǎng)液中GPT、GOT、SOD和MDA影響(平均值土 S.D., η = 6)
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一種鯉魚肝損傷模型，其特征在于:由以下步驟制得: 步驟I，取鯉魚肝組織進(jìn)行肝切片； 步驟2，將步驟I所得肝切片用含濃度為0.1~0.6Pg/L的2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二惡英的L-15培養(yǎng)基，在5%C02、27°C條件下培養(yǎng)造模3~4小時(shí)； 步驟3，清洗掉2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二惡英，得到鯉魚肝切片損傷模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚肝損傷模型，其特征在于:步驟I中鯉魚肝組織取出后置于預(yù)先以氧飽和的冰浴的L-15培養(yǎng)液中，用低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行包被處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚肝損傷模型，其特征在于:步驟I中肝切片的厚度為300 μ m0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚肝損傷模型，其特征在于:步驟2所用的L-15培養(yǎng)基中，3,7,8-四氯二苯-對(duì)-二惡英的濃度為0.3Pg/L。
5.權(quán)利要求1-3 中任一項(xiàng)所述的鯉魚肝損傷模型在篩選魚類保肝藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103992983SQ201410245581
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月4日
【發(fā)明者】杜金梁, 殷國(guó)俊, 曹麗萍, 劉英娟, 王加豪 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心