枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)及其應(yīng)用，所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為保藏編號CGMCC No.3665菌株或其直接傳代物，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發(fā)明的菌株能夠有效的分泌β-1，3-1，4-葡聚糖酶，能夠防治梨黑斑病，是有效的生物防治劑，應(yīng)用前景十分廣闊。
CGMCC No3665
20100312
【專利說明】枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物和化肥化工領(lǐng)域，具體的涉及一種能夠分泌β-1，3-1，4-葡聚 糖酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國是世界第一梨果生產(chǎn)大國，鮮梨產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的2/3。許多品種如雪 花梨、庫爾勒香梨、鴨梨等以其優(yōu)質(zhì)而在國際享有盛譽。由半知菌亞門交鏈孢屬鏈格孢霉 [Alternaria alternate (Fr. )Keissler]引起的黑斑病是梨采后儲藏期的主要病害之一， 影響梨果的儲藏時間以及品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 對于梨采后病害的防治，目前仍以低溫貯藏和化學(xué)保鮮劑為主，但不當(dāng)?shù)牡蜏厝?易造成梨果冷害的發(fā)生，長期使用化學(xué)保鮮劑會促使某些病原真菌的抗性增加，且農(nóng)藥殘 留問題也對公眾的健康和環(huán)境造成威脅。因此，安全、無污染、環(huán)境友好型生物保鮮技術(shù)越 來越受到人們的重視.因此，如何得到能夠防治梨黑斑病的生物保鮮劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員 亟待解決的技術(shù)問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，優(yōu)選的，所述的枯 草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)為保藏編號CGMCC No. 3665菌株或其直接傳代物，保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0005] 本發(fā)明另一方面還涉及一種含有枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis)的菌劑。
[0006] 本發(fā)明另一方面還涉及上述菌劑在防治梨黑斑病中的應(yīng)用。
[0007] 在本發(fā)明的另一方面，還涉及所述枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis)在產(chǎn) β -1，3-1，4-葡聚糖酶中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的β -1，3-1，4-葡聚糖酶的氨基酸序列為 SEQ ID NO. 2。
[0008] 本發(fā)明的菌株能夠有效的分泌β-1，3_1，4-葡聚糖酶，能夠防治梨黑斑病，是有 效的生物防治劑，應(yīng)用前景十分廣闊。
[0009] 微生物信息
[0010] 本發(fā)明所篩選的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis) J18已經(jīng)保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 3665,保藏地址為：北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2010年03月12日。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1 :重組蛋白的Western Blot檢測
[0012] 圖2 :SDS_PAGE分析純化后的重組蛋白
[0013] M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2 :親和純化后的重組蛋白
[0014] 圖3 :重組酶對梨鏈格孢霉菌絲的抑制作用
[0015] 圖4 :重組酶在PDA平板上對梨鏈格孢霉的抑制
[0016] 圖5 :重組酶對梨黑斑病的防治
[0017] 左：重組酶；右：對照（無菌水）
[0018] 圖6 :重組酶對梨黑斑病的防治效果
[0019] 左：對照（只噴施病原菌）；右：重組酶處理
[0020]
[0021]

【具體實施方式】 [0022]
[0023] 實施例1
[0024] 1.菌株的分離
[0025] 從四川成都梨果園土樣中篩選到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus substilis) J18， 該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，中國微生物菌種保藏中心 登記編號 CGMCC No. 8343。
[0026] 2.試驗方法
[0027] 2. 1引物的設(shè)計與合成
[0028] 通過在GenBank文庫中進(jìn)行序列查找與同源性比對，根據(jù)已登錄的β-1，3-1， 4-葡聚糖酶的基因序列及表達(dá)載體pET28a(+)的多克隆位點設(shè)計引物，在正反向引物5'端 分別引入BamH I和Xho I酶切位點，并加入相應(yīng)的保護(hù)性堿基，由上海生物工程公司合成。
[0029] 引物序列如下：
[0030] 上游引物 Gl :5 ' -CGGGATCCATGCAAACAGGTGGATCG-3 '
[0031] 下游引物 G2 :5 ' -CCGCTCGAGGCTTATTTTTTTGTATAGCGCACCC-3 '
[0032] 2. 2 β _1，3-1，4_匍聚糖酶基因的克隆
[0033] 2. 2. 1枯草芽孢桿菌（Β. substilis) J18基因組DNA的提取
[0034] 對枯草芽孢桿菌J18基因組DNA進(jìn)行提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟如 下：
[0035] (1)將枯草芽孢桿菌J18以1 % (V/V)的接種量接種于LB培養(yǎng)基，在37°C條件下、 200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。吸取IOmL菌液5000r/min離心IOmin,保留菌體。
[0036] (2)用 STE(lmM EDTA，pH8. 0 ;10mM Tris-HCl，pH8. 0 ;0· IM NaCl)洗滌一次， 5000r/min 離心 lOmin，棄上清。
[0037] (3)力卩 4mL TE(lmmol/L EDTA，pH8. 0 ;10mmol/L Tris-HCl，pH8. 0)懸浮沉淀，并加 8 μ L 溶菌酶溶液（50mg/mL)，37°C 靜置 20min。
[0038] (4)力卩 10 μ LRnase (10mg/mL)，再加入 0· 5mL 的 10% SDS 溶液，37°C靜置 30min。
[0039] (5)加 1(^1^蛋白酶1((2〇11^/1^)，371：靜置6〇1^11。
[0040] (6)加入相同體積的Tris-飽和酚溶液，混勻，8000r/min離心5min，吸取上清轉(zhuǎn)移 至新的I. 5mLEP管中。
[0041] (7)向上清液中加入相同體積的酚：氯仿，混勻，8000r/min離心5min，吸取上清 轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管中。
[0042] (8)向上清液中加入1/5體積、濃度為lOmol/L的醋酸銨和2倍體積無水乙醇，顛 倒混合，靜置l〇min，離心沉淀DNA。用70%乙醇洗滌，吸干，加500 μ L TE溶解DNA，-20°C 保存。
[0043] 2· 2· 2 β -I，3-1，4-葡聚糖酶基因 PCR擴(kuò)增
[0044] 以提取的枯草芽孢桿菌（Β. subtilis) J18的基因組DNA為模板，Gl和G2為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在0. 2mL的PCR小管中加入以下成分。
[0045] PCR反應(yīng)體系（20 μ L)如下：
[0046]

【權(quán)利要求】
1. 一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，優(yōu)選的，所述的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)為保藏編號CGMCC No. 3665菌株或其直接傳代物，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心。
2. -種含有上述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的菌劑。
3. 上述菌劑在防治梨黑斑病中的應(yīng)用。
4. 上述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)在產(chǎn)￠-1,3-1,4-葡聚糖酶中的應(yīng)用，優(yōu) 選的，所述的￠-1,3-1,4-葡聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
【文檔編號】C12N9/24GK104371947SQ201410246944
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】宋水山, 黃亞麗, 李惠榮, 賈振華, 宋聰, 馬宏, 黃媛媛 申請人:河北省科學(xué)院生物研究所