一種高表達水溶性肝素酶i融合蛋白及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高表達水溶性肝素酶I融合蛋白及其編碼基因，肝素酶I融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；肝素酶I融合蛋白的編碼基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明通過利用pColdTF載體對肝素酶I的表達基因進行改造，增加了一段表達pColdTF蛋白的核苷酸序列，獲得了肝素酶I融合蛋白；該肝素酶I融合蛋白的酶活可達64000U/L發(fā)酵液，表達量可達320mg/L發(fā)酵液，比酶活可達200U/mg。并且該酶還可通過鎳柱分離實現(xiàn)該融合蛋白的一步純化。
【專利說明】一種高表達水溶性肝素酶I融合蛋白及其編碼基因
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高表達水溶性肝素酶I融合蛋白及其編碼基因，屬于基因工程【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素/硫酸乙酰肝素(Heparin/Heparan Sulfate, Hep/HS)兩者具有相同的主鏈結(jié)構(gòu)，是通過20-100個由D-葡糖醛酸/L-艾杜糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成二糖連接而成的直鏈多糖，糖鏈中不同部位的羥基(-OH)及N-乙酰葡糖胺2位氨基的乙?；蛄蛩峄笻ep/HS的結(jié)構(gòu)變得異常復雜(Castelli et al.2004 ;Casu2005)。H印/HS廣泛分布于哺乳動物的細胞表面和胞外基質(zhì)中，在各種生命過程中起著重要作用，如:調(diào)節(jié)血管壁功能，凝血，炎癥反應和細胞分化等。
[0003]肝素酶Ofeparinase)是研究H印/HS構(gòu)效關(guān)系的重要工具酶。肝素酶廣泛存在于微生物和動物體內(nèi)，通過選擇性切割H印/HS多糖鏈對H印/HS的降解代謝和生物學功能進行調(diào)節(jié)。無論微生物還是哺乳動物來源的肝素酶對H印/HS糖鏈的切割均具有結(jié)構(gòu)選擇性。哺乳動物來源的酶是通過對己糖醛酸和葡萄糖胺之間的糖苷鍵的水解作用來降解糖鏈的，而微生物來源的肝素酶則是通過β-消除機制對葡萄糖胺和己糖醛酸之間的糖苷鍵進行切割，在己糖醛酸殘基的4、5位碳原子之間形成在232nm有特定紫外吸收的雙鍵。哺乳動物來源的肝素降解酶參與了細胞信號轉(zhuǎn)導，細胞遷移和癌變等各種生理病理過程。而微生物來源的肝素裂解酶則主要是參與微生物對肝素作為碳源的降解利用以及某些病原微生物對宿主的入侵過程。微生物來源的肝素酶由于種類多、酶活高、穩(wěn)定性好、易于大量表達純化、生產(chǎn)成本相對較低等優(yōu)點，在科學研究、工業(yè)生產(chǎn)及臨床上被廣范應用。具有巨大的開發(fā)價值(Tripathi CK et al.2012)。
[0004]三種來自于肝素黃桿菌(Flavobacteriumheparinum)的肝素裂解酶被廣泛研究并做為主要的商品化肝素酶被廣泛應用，被分別命名為為肝素酶I (Heparinase I)、肝素酶II (Heparinase II)、肝素酶III (Heparinase III)。這三種肝素裂解酶在降解肝素與硫酸乙酰肝素的能力上有差異，肝素酶I主要以降解肝素為主，肝素酶III主要降解硫酸乙酰肝素，肝素酶II既降解肝素也降解硫酸乙酰肝素(Linhardt et al.1987，1990)。這三個酶均為周質(zhì)空間空間蛋白，早期主要是通過對菌體進行滲透壓沖擊或超生破碎并結(jié)合各種色譜對天然酶蛋白進行分離純化，天然酶蛋白具有酶活高水溶性好等特點，但存在產(chǎn)量低、操作復雜、純度難以保證和成本高等問題。
[0005]自上世紀九十年代初開始，三種來自肝素黃桿菌的肝素酶被先后克隆表達(Godavarti et al.1996 ；Sasisekharan et al.1993 ；Shaya et al.2004)。但是，目前利用 pET表達系統(tǒng)在大腸桿菌中表達肝素酶時，一直存在重組酶水溶性差，易形成包涵體，需要復雜的蛋白復性處理，且復性蛋白不穩(wěn)定，容易在保存過程中再度沉淀時候等問題。近年來，肝素酶I被廣泛克隆到不同的表達載體與宿主中，但是依然面臨著表達量低，活性低，水溶性差等問題，因此尋找和建立表達效率高、酶蛋白水溶性好、活力高的肝素酶重組表達技術(shù)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種水溶性好、酶活力高的肝素酶I融合蛋白及其編碼基因。
[0007]一種肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]一種肝素酶I融合蛋白的編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]一種重組表達載體，在表達載體中插入了上述肝素酶I融合蛋白的編碼基因。
[0010]上述表達載體選自大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體。
[0011]一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，在宿主細胞或細胞系中插入了上述肝素酶I融合蛋白的編碼基因。
[0012]上述宿主細胞或細胞系選自大腸桿菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、枯草桿菌宿主細胞、乳酸菌宿主細胞、放線菌宿主細胞、絲狀真菌宿主細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
[0013]用于重組表達肝素酶I融合蛋白的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，可以是大腸桿菌宿主細胞(如 Escherichia coli BL21> Escherichia coli JM109> Escheri chi a coli DH5 α 等)、酵母菌宿主細胞(如 Saccharomyces cerevisiae>Pichia pastoris>Kluyveromyces Iactis等)、枯草桿菌宿主細胞(如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920 等)、乳酸菌宿主細胞(如Lactic acid bacteria C0CC101等)、放線菌宿主細胞(如Streptomycesspp.等)、絲狀真菌宿主細胞(如 Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Aspergillusniger、Aspergillus nidulans 等)、昆蟲細胞(如 Bombyxmori, Antharaea eucalypti 等)或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CH0，幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL
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[0014]上述編碼基因、重組表達載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系在制備肝素酶I融合蛋白中的應用。
[0015]益效果
[0016]本發(fā)明通過利用PColdTF載體對肝素酶I的表達基因進行改造，增加了一段表達PColdTF蛋白的核苷酸序列，獲得了肝素酶I融合蛋白；該肝素酶I融合蛋白的酶活可達64000U/L發(fā)酵液，表達量可達320mg/L發(fā)酵液，比酶活可達200U/mg。并且該酶還可通過鎳柱分離實現(xiàn)該融合蛋白的一步純化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為表達載體pColdTF-H印01的構(gòu)建過程示意圖。
[0018]圖2為從肝素黃桿菌中PCR擴增得到的肝素酶I基因電泳圖譜。
[0019]圖3為轉(zhuǎn)化子PCR驗證電泳圖譜。
[0020]圖4為轉(zhuǎn)化子酶切驗證電泳圖譜。
[0021]圖5重組肝素酶pCoIdTF-1fepOI表達及純化情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)；[0022]其中:M、蛋白質(zhì)分子量標準，條帶自上至下大小為116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD ;泳道1、對照菌株破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道2、重組菌破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道3、重組菌破壁后上清，上樣量10 μ L，泳道4、經(jīng)鎳柱純化的HCDase，上樣量10 μ Lo
[0023]圖6重組肝素酶pCo IdTF-H印OI降解肝素所得產(chǎn)物的HPLC分析圖。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例的闡述，是為了全面公開本發(fā)明如何實施的一些常用技術(shù)，而不是為了限制本發(fā)明的應用范圍。發(fā)明人已經(jīng)盡最大努力確保實施例中個參數(shù)的準確性(例如量，溫度，等等)，但是一些實驗誤差和偏差也應該予以考慮。除非另有說明，本發(fā)明中分子量是指重均分子量，溫度是攝氏度。
[0025]下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所述引物合成及測序工作均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，所有的限制性內(nèi)切酶及dNTP均購TaKaRa公司；所有感受態(tài)細胞(如:DH5a、BL21)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)；肝素酶I酶活測定底物肝素購自Sigma公司，其它的化學藥品均為一般分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。
[0026]實施例1、肝素酶I融合蛋白pColdTF-H印I的表達
[0027]—、去除信號肽的肝素黃桿菌肝素酶I編碼序列的克隆
[0028]表達載體pCoIdTF-HepI的構(gòu)建過程如圖1所示，具體過程如下:
[0029]1、引物的設計及合成
[0030]經(jīng)Genbank查詢得到肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)肝素酶I的 DNA 序列(Su, H., Blain, F., Musil, R.A., Zimmermann, J.J., Gu, K.and Bennett,D.C.1solation and expression in Escherichia coli of hepB and hepC, genescodingfor the glycosaminoglycan-degrading enzymes heparinase II and heparinaseIII, respectively, from Flavobacterium heparinum.App1.Environ.Microbiol.1996,62,2723-2734)，再根據(jù)去除編碼信號肽堿基的肝素黃桿菌肝素酶I的DNA序列設計引物，并在弓丨物序列中引入限制性內(nèi)切酶xba I和Nde I的識別位點，所用的上下游引物分別為:
[0031]上游引物(引物Pl):5’ -GCATATGCAGCAAAAAAAATCCGGTAACATC-3’ (帶下劃線的堿基為NdeI的酶切位點)，
[0032]下游引物(引物P2):5，-GTCTAGATCTGGCAGTTTCGCTGTACCCGC-3，(帶下劃線的堿基為Xba I的酶切位點)，擴增后，即分別引入Nde I和Xba I酶切位點。
[0033]2、PCR擴增去除信號肽的肝素黃桿菌肝素酶I的編碼序列
[0034]PCR擴增的反應體系為:50ng肝素黃桿菌基因組DNA模版，上游引物和下游引物各IOOpmol，I X擴增緩沖液(北京天為生物技術(shù)有限公司)，每種dNTP各200 μ mol/L, I單位高保真 PrimerSTAR HS DNA Polymerase ；
[0035]擴增程序為:95攝氏度變性5分鐘，68攝氏度引物退火并延伸2分鐘，30個循環(huán)后，72攝氏度延伸10分鐘結(jié)束反應。
[0036] 該PCR結(jié)果如圖2所示，表明擴增得到了 1.1kb的肝素酶I基因片段，測序表明，擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列I的第1414-2502位所示(命名為H印01)。圖2中，泳道1，2分別為退火溫度為對照以及實驗擴增結(jié)果，泳道M為分子量marker (條帶大小依次為 8kb、5kb、3kb、2kb、、lkb、750bp、500bp、250bp、100bp)，箭頭所指處為 1.1kb 左右目標片段。
[0037]3、構(gòu)建含有目的片段的克隆載體
[0038]參照試劑盒說明書進行操作，將步驟一中2中的PCR擴增的目的片段直接連接到載體pEasy Blunt Simple (TaKaRa公司)中，得連接產(chǎn)物。
[0039]4、轉(zhuǎn)化大腸桿菌及陽性克隆轉(zhuǎn)化子的篩選及測序
[0040]將步驟3獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，具體方法為:
[0041 ] 將10 μ I的連接產(chǎn)物與50 μ I的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞混勻，冰浴30分鐘，42攝氏度熱激60秒，冰浴3分鐘，然后加入300 μ I含100 μ g/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaC13g，水285mL)中，180rpm、37攝氏度振搖60分鐘，涂于含100 μ g/L氨芐青霉素的LB抗性培養(yǎng)平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaC13g，瓊脂粉4.5g，水285mL，16y I X-gal和4μ I IPTG/平板)進行藍白斑篩選。37攝氏度培養(yǎng)12-20小時。挑選白斑并以此為模版，用引物Pl和P2進行菌落PCR鑒定，PCR反應體系及反應條件與步驟2相同。
[0042]反應結(jié)束后，對擴增產(chǎn)物進行0.8wt%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可含轉(zhuǎn)化子的陽性克隆。將篩選得到的陽性克隆轉(zhuǎn)至5mL含0.05mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37攝氏度、220rpm振搖12小時，將菌液進行測序，將含有具有序列表中序列I的第1414-2502位核苷酸序列的肝素酶I蛋白編碼基因的pEasy Blunt-HepOl重組載體命名為pEasyBlunt-HepOl。
[0043]二、重組大腸桿菌表達載體的構(gòu)建
[0044]以pEasy Blunt-HepOI質(zhì)粒為模版，用引物Pl和P2進行PCR擴增肝素黃桿菌肝素酶I的基因，PCR反應體系及反應條件與步驟一中2相同。
[0045]將pColdTF載體(購自美國TaKaRa公司和PCR產(chǎn)物(以pColdTF-HepOl質(zhì)粒為模版的擴增產(chǎn)物)分別用Xba I和Nde I雙酶切，用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)連接，轉(zhuǎn)化DH5a，以Pl和P2為引物，通過菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子(如圖3所示)，提取可得到1.1kbPCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子中的pCoIdTF重組載體，分別通過Xba I和Nde I雙酶切驗證(如圖4所示)。圖 3 中 M 為分子量 marker 條帶大小依次為 8kb、5kb、3kb、2kb、、lkb、750bp、500bp、250bp、IOObp)，泳道1、2為PCR驗證的轉(zhuǎn)化子，箭頭所指處為肝素酶I基因條帶。圖4中M為分子量marker 條帶大小依次為 8kb、5kb、3kb、2kb、lkb、750bp、500bp、250bp、IOObp),泳道 I 為質(zhì)粒pColdTF被Xba I和Nde I雙切后電泳圖，泳道2為重組質(zhì)粒pCoIdTF-H印OI被Xba I和Nde I雙切后電泳圖，箭頭所指處為肝素酶I基因通過Xba I和Nde I雙酶切得到的1.1kb片段的質(zhì)粒進行測序，將含有具有序列表中序列I的第1414-2502位核苷酸序列的肝素酶I融合蛋白編碼基因的pColdTF重組載體命名為pColdTF-Η印I。
[0046]三、肝素酶I融合蛋白pColdTF-Η印I的表達
[0047]提取步驟二中含有pColdTF-Η印I的大腸桿菌DH5a中的質(zhì)粒，按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸菌BL21(DE3)。E.coli DH5a、E.coli BL21 (DE3)、感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。經(jīng)過氨芐青霉素篩選和利用步驟一中步驟I提供的引物進行菌落PCR鑒定，得到含有pColdTF-Η印I的大腸桿菌BL21 (DE3)，即BL21 (DE3)/pCoIdTF-HepI作為表達pCo IdTF-Hep I 的工程菌。[0048]以質(zhì)粒pColdTF轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到空載體對照BL21 (DE3) /pColdTF。
[0049]以下操作對上面的工程菌平行進行。
[0050]將空載體對照和工程菌分別在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基(NaC110g/L，酵母提取物為5g/L，蛋白胨10g/L，含100 μ g/L氨芐青霉素)37攝氏度培養(yǎng)2.5小時后，加入終濃度為005mM IPTG16攝氏度誘導24小時。lOOOOrpm，8分鐘離心收集菌體并用20mmol/LTris-HCl (ρΗ7.5)洗滌兩次，重懸至OD600約為8.000附近。將上面OD600約為8.000重懸液進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲3秒和間歇3秒的處理198次)，12000rpm,30分鐘離心，超聲破碎后離心所得的上清液即為粗酶液。
[0051]酶活力(單位為IU/L)的檢測采用232nm的光吸收法，IIU的酶活定義為30攝氏度每分鐘產(chǎn)生I μ mo I不飽和鍵的反應效力。取肝素底物溶液0.5ml (25g/L肝素，40mM NaCl，
3.5mM CaCl2,17mM Tris-HCl，pH7.5)，加入上步中所得的粗酶液，其他體積以Tris緩沖液補充，最終的反應體積為1.5ml，測單位時間內(nèi)在232nm的吸光度變化ΛΑ232。消光系數(shù)ε =3800Μ-1。比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗酶液蛋白濃度(單位為mg/L)的比值。蛋白濃度監(jiān)測采用常規(guī)的Bradford法。
[0052]結(jié)果如表1所示，空載體對照菌株BL21 (DE3) /pColdTF誘導培養(yǎng)后無酶活，工程菌BL21表達出了有活性的可溶性pCoIdTF-1fepI融合蛋白。
[0053]經(jīng)過測序，BL21 (DE3)/pCoIdTF-HepOI表達出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:2所示；并且該融合蛋白pColdTF-Η印I中pColdTF的氨基酸序列如SEQ ID No:2的自氨基酸第1-471所示；該融合蛋白中的H印I的氨基酸序列如SEQ ID No:2的自氨基酸第471-834所示。
[0054]對最佳宿主BL21表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳:取上述超聲破碎后離心所得的上清夜(粗酶液)5μ I做可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳，取上述超聲破碎后離心所得的沉淀來做不可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖5所示。
[0055]圖 5 中 M 為 marker (由上至下大小為 116kD,66.2kD, 45kD, 35kD, 25kD, 18.4kD,
14.4kD ;泳道1、對照菌株破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道2、重組菌破壁前菌體，上樣量10 μ L，泳道3、重組菌破壁后上清，上樣量10 μ L，泳道4、經(jīng)鎳柱純化的HCDase，上樣量10μ L(目的蛋白 91.7KDa)。
[0056]實施例2、通過鎳柱純化肝素酶I融合蛋白pColdTF-1fepI
[0057]將pColdTF-HepI轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)(購自美國Novagen公司)，然后按照該公司提供的操作步驟進行重組酶誘導表達。并用Ni Sepharose6Fast Flow (GE)凝膠對H印I融合蛋白進行純化，純化條件按照GE公司的產(chǎn)品手冊操作。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測重組pCoIdTF-H印I的純化情況，結(jié)果如圖5的5號泳道所示，純化后的重組H印I融合蛋白在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預測的分子量相吻合。
[0058]實施例3、HepI融合蛋白的酶活測定
[0059] 將質(zhì)量濃度為1%肝素、pCoIdTF-HepI 酶液、5 倍緩沖液(250mM Tris_HCl、500mMNaClUOmM CaCl2,PH7.9)以及水按2:1:2:5(體積比)的比例混合后，在最適溫度和最適pH下反應2-10min,按前述的紫外法測酶活力(Yamagata, Saito et al.1968),同時用購于康為世紀公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測定H印I融合蛋白酶液的蛋白含量，結(jié)果表明重組H印I融合蛋白對肝素的比活為200U/mg。[0060]實施例4、H印I融合蛋白降解肝素降解產(chǎn)物的高效液相(HPLC)分析
[0061]將質(zhì)量濃度為1%肝素、H印I融合蛋白酶液、5倍緩沖液(250mM Tris-HCl、500mMNaClUOmM CaCl2, PH7.9)緩沖液以及水按2:1:2:5(體積比)的比例混合后，在最適溫度和最適pH下反應10min條件下反應,進行HPLC分析。HPLC分析條件為凝膠柱:superdexpeptidel0/300GL (GE);流動相:0.2M 碳酸氫銨；流速:0.4mL/min ;檢測條件:UV232nm。
[0062]結(jié)果如圖6所示，從圖6可以看出經(jīng)HepI融合蛋白降解后，肝素寡糖產(chǎn)物聚合度隨降解時間的延長而快速降低，最終轉(zhuǎn)變成二糖。該結(jié)果表明IfepI融合蛋白屬于內(nèi)切肝素/硫酸乙酰肝素裂解酶，可被用于肝素/硫酸乙酰肝寡糖的制備及其構(gòu)效關(guān)系研究。
[0063]實施例5、切除IfepI融合蛋白水溶性蛋白標簽后酶活比較
[0064]將質(zhì)量濃度為1%肝素、IfepI 酶液、5 倍緩沖液(250mM Tris-HCl、500mM NaClUOmMCaCl2, PH7.9)緩沖液以及水按2:1:2:5(體積比)的比例混合后，在最適溫度和最適pH下反應10min條件下反應，
[0065]以上H印I酶是重組H印I融合蛋白經(jīng)抗凝血酶在37度處理pColdTF-H印012h切除水溶性蛋白標簽后，加入到以上反應體系中，按前述的紫外法測酶活力(Yamagata，Saitoet al.1968),同時用購于康為世紀公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測定pColdTF-HepI酶液的蛋白含量，結(jié)果表明重組pColdTF-1fepI已切除水溶性標簽對肝素的比活為250U/mg，接近天然酶活力。
[0066]說明書中涉及的參考文獻
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【權(quán)利要求】
1.一種肝素酶I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一種肝素酶I融合蛋白的編碼基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.—種重組表達載體，在表達載體中插入了權(quán)利要求2所述肝素酶I融合蛋白的編碼基因。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，所述表達載體選自大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體或哺乳動物細胞表達載體。
5.一種重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，在宿主細胞或細胞系中插入了權(quán)利要求2所述肝素酶I融合蛋白的編碼基因。
6.如權(quán)利要求5所述的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系，其特征在于，所述宿主細胞或細胞系選自大腸桿菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、枯草桿菌宿主細胞、乳酸菌宿主細胞、放線菌宿主細胞、絲狀真菌宿主細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
7.權(quán)利要求2所述的編碼基因、權(quán)利要求3所述的重組表達載體或權(quán)利要求5所述的重組菌或轉(zhuǎn)基因細胞系在制備肝素酶I融合蛋白中的應用。
【文檔編號】C12N15/80GK103992995SQ201410246947
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】李福川, 趙梅, 韓文君, 王文爽, 彭立正 申請人:山東大學