一種日本囊對蝦放流效果的評估方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，包括：通過對母性遺傳的線粒體序列的擴增和測序，運用相關(guān)軟件分析遺傳距離，系統(tǒng)建樹，單倍型分析等，分析野生群體和繁育群體的序列差異和單倍型分布，統(tǒng)計各單倍型的群體內(nèi)頻率。通過選定一種或者幾種具有特異分子標(biāo)記的特定母蝦來繁育放流用的子一代小蝦，從而可以在回捕群體中測定個體所占的比例，與放流前這些分子標(biāo)記的比例相比較，就可以確定該批次的放流效果。本發(fā)明工藝簡單，成本低，在此方法基礎(chǔ)上制定科學(xué)的放流規(guī)劃、有效促進(jìn)野生日本囊對蝦種群資源恢復(fù)，對于放流個體的子代也同樣可以檢測，本發(fā)明還可用于多年連續(xù)監(jiān)測。
【專利說明】一種日本囊對蝦放流效果的評估方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海水動物增殖放流領(lǐng)域，特別涉及一種日本囊對蝦放流效果的評估方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 日本囊對奸，又稱日本對奸（Kuruma prawn)，學(xué)名 Marsupenaeus japonicas,別 名車蝦、斑節(jié)蝦、竹節(jié)蝦，在分類學(xué)上隸屬于甲殼綱、十足目、游泳亞目、對蝦科、對蝦屬。原 產(chǎn)日本、中國、菲律賓、澳大利亞等國，廣泛分布于印度、西太平洋地區(qū)，主要在日本列島、南 非紅海、阿拉伯灣、孟加拉灣日本及我國等海區(qū)，以日本的沿海數(shù)量最多。棲息地底質(zhì)以沙 質(zhì)底為主，有潛沙習(xí)性，在自然海域，自仔蝦期就潛沙，漲潮時出來覓食，退潮后就潛入淺水 的沙中，當(dāng)體長達(dá)2.5?3cm，逐漸改為晚上活動覓食，白天潛入沙中；分布區(qū)的底溫范圍為 16?31°C，底層鹽度范圍在28?34之間；沒有長距離洄游現(xiàn)象，僅在小范圍內(nèi)移動；不同 生活時期的分布區(qū)域有所差異，幼蝦主要分布在鹽度較低、沙質(zhì)底的河口水域，隨著個體的 成長，逐步移向深水區(qū)；產(chǎn)卵期較長，周年均有性成熟個體的出現(xiàn)，但主要產(chǎn)卵期為12?3 月份；產(chǎn)卵盛期，雌性大于雄性，其它時期個體大小大致相等；雌蝦體長和體重范圍分別為 50?200mm和4?95g，雄ilH本長和體重范圍分別為50?175mm和4?57g ;不同的生長 階段日本囊對蝦的餌料組成也不同，總體上以攝食底棲生物為主，兼食底層浮游動物和游 泳動物。
[0003] 日本囊對蝦是我國海水蝦類養(yǎng)殖的主要種類之一，特別是近年來在對蝦養(yǎng)殖業(yè)深 受病害侵害的情況下，日本囊對蝦以其相對抗病力較強、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟效益高、離水性較 好以及適于長距離運輸?shù)葍?yōu)點倍受養(yǎng)殖業(yè)者的青睞。近年來，由于捕撈強度的不斷加大、生 態(tài)變遷、水域污染、病害頻發(fā)以及人工養(yǎng)殖業(yè)對野生日本囊對蝦的盲目需求等綜合因素的 影響，日本囊對蝦野生資源數(shù)量急劇萎縮。為保護(hù)、恢復(fù)日本囊對蝦種群和漁業(yè)資源，大規(guī) 模種苗放流后日本囊對蝦資源量得到了一定的恢復(fù)。不過由于無法準(zhǔn)確區(qū)分回捕群體中放 流個體和野生個體及數(shù)量，因而無法科學(xué)評估放流群體對野生資源的補充水平，分析野生 資源的動態(tài)變化并制定科學(xué)的放流規(guī)劃，這是日本囊對蝦放流迫切需要解決的重大問題。
[0004] 基于線粒體DNA的進(jìn)化速率為核DNA的5-10倍，篩選到可代表種內(nèi)變異的分子標(biāo) 記的概率較高；線粒體為母性遺傳，重組率極低，還可應(yīng)用于分析特定放流群體的后代，可 避免由雜交原因引入的混淆。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，該方法 工藝簡單，成本低，在此方法基礎(chǔ)上制定科學(xué)的放流規(guī)劃、有效促進(jìn)野生日本囊對蝦種群資 源恢復(fù)，對于放流個體的子代也同樣可以檢測，還可用于多年連續(xù)監(jiān)測。
[0006] 本發(fā)明的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，包括：
[0007] (1)采集日本囊對蝦放流區(qū)域的野生群體和準(zhǔn)備用于放流的繁育群體，選用線粒 體序列中的片段作為研究對象，通過PCR擴增和測序，分析野生群體和繁育群體的序列差 異和單倍型分布，統(tǒng)計各單倍型的群體內(nèi)頻率；
[0008] (2)篩選出代表日本囊對蝦種內(nèi)差異的單倍型作為分子標(biāo)記，確定該標(biāo)記的序列 特異性，計算分子標(biāo)記在野生群體中所占的比例，定期監(jiān)測比例變動范圍（根據(jù)日本囊對 蝦的自然繁育周期）；
[0009] (3)選定在野生群體中歷年所占比例變動小的分子標(biāo)記，將帶有選定的分子標(biāo)記 的母蝦用于人工繁育放流用的子一代；
[0010] (4)在捕撈期回捕放流區(qū)域的個體，檢測分子標(biāo)記，計算帶有選定的分子標(biāo)記的個 體在回捕群體中的比例，確定比例變動情況，從而估算放流群體對該區(qū)域所有日本囊對蝦 生態(tài)量的貢獻(xiàn)值，最終確定該批次的放流效果。
[0011] 所述步驟（1)中的線粒體序列為細(xì)胞色素B基因DNA序列、D-loop區(qū)序列或C0I 序列。
[0012] 所述細(xì)胞色素B基因DNA序列如SEQ ID N0:1所示；對應(yīng)的PCR擴增引物 MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R序列如SEQ ID N0:2和N0:3所示。用DNA測序的方法確定檢測樣 本的分子標(biāo)記。測定的每個個體的CYTB基因序列的堿基與序列有少量差異，從而構(gòu)成各種 不同的單倍型。
[0013] 所述步驟⑴中的PCR反應(yīng)體系為：30yL反應(yīng)體系，其中包括3yL10XPCR緩 沖液，引物的濃度均為1〇μΜ，上游引物和下游引物分別為0. 5yL，lyL2. 5mM each dNTP， 0· 5 μ LTaq DNA聚合酶，0· 5 μ L DNA模板；補充23. 5 μ L去離子水至30 μ L。
[0014] 所述步驟（1)中的PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C退火 45心721：延伸70 8，共28個循環(huán)，最后721：延伸71^11，101：保存并結(jié)束程序。
[0015] 所述步驟（2)中的變動范圍要求不超過5%。
[0016] 所述步驟（3)中放流前對增殖群體的母本、子代預(yù)先進(jìn)行檢測，以確定選定的分 子標(biāo)記的有效性、可檢出性，并確定子一代攜帶的分子標(biāo)記與用于繁育的母蝦一致。
[0017] 連續(xù)多年對分子標(biāo)記進(jìn)行追蹤檢測，評估該批次放流的長期效果。
[0018] 不同批次的放流選用不同的分子標(biāo)記，以分別評估各個批次的放流效果。
[0019] 不同分子標(biāo)記的探測根據(jù)實際需要可以采用直接測序、熒光定量PCR、寡核苷酸探 針、限制性酶切等方法。
[0020] 本發(fā)明通過對母性遺傳的線粒體上細(xì)胞色素B基因DNA序列的擴增和測序，運用 相關(guān)軟件分析遺傳距離，系統(tǒng)建樹，單倍型分析等，分析野生群體和繁育群體的序列差異和 單倍型分布，統(tǒng)計各單倍型的群體內(nèi)頻率。通過選定一種或者幾種具有特異分子標(biāo)記的特 定母蝦來繁育放流用的子一代小蝦，從而可以在回捕群體中測定具有這些特異分子標(biāo)記的 個體所占的比例（群體內(nèi)頻率），與放流前這些分子標(biāo)記的比例相比較，就可以估算放流群 體對該區(qū)域所有日本囊對蝦生態(tài)量的貢獻(xiàn)值，最終確定該批次的放流效果。
[0021] 有益效果
[0022] 本發(fā)明工藝簡單，成本低，在此方法基礎(chǔ)上制定科學(xué)的放流規(guī)劃、有效促進(jìn)野生日 本囊對蝦種群資源恢復(fù)，對于放流個體的子代也同樣可以檢測，本發(fā)明還可用于多年連續(xù) 監(jiān)測。

【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0024] 實施例1
[0025] 日本囊對蝦DNA提取和PCR :
[0026] (1)提取 DNA:Trizol 法提取。
[0027] A.取 1000 μ LTris-cl 加入 2ml 離心管中；
[0028] B.取適量的組織（約2_3mg)，并用已經(jīng)消毒后的剪刀充分剪碎；
[0029] C.浸泡 45min 后，4°C，12000rpm，lOmim ;
[0030] D.棄上清，加入600μ L Tris-buffer，50y L10% SDS，7y L蛋白酶K，55°C水浴2h， 直至完全消化，溶液澄清；
[0031] E.加入350 μ L苯酚，350 μ L氯仿：異戊醇（24:1)，振蕩至完全混勻；4 °C， 12000rpm,lOmim ；
[0032] F.取上清于新的2ml離心管中，加入與上清等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，振蕩至 完全混勻；4°C，12000rpm，lOmim ;
[0033] G.取上清于新的1. 5ml離心管中，加入2倍上清體積的冰無水乙醇，充分混勻后， 于-20°C下靜置lh，4°C，12000rpm，15mim，棄上清，室溫晾干；
[0034] H.加入 60 μ L ddH20, _2(TC 保存。
[0035] (2)PCR反應(yīng)體系為：30 μ L反應(yīng)體系，其中包括3 μ L10XPCR緩沖液、引物的濃 度均為ΙΟμΜ，上游引物和下游引物分別為0. 5yL，lyL dNTP，0. 5yL Taq DNA聚合酶， 0· 5 μ L DNA模板；補充24 μ L去離子水至30 μ L。
[0036] 擴增程序為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C退火45s，，72°C延伸70s，，最 后72°C延伸7min，KTC保存并結(jié)束程序。
[0037] 技術(shù)分析：
[0038] (1)分析野生群體和繁育群體的序列差異和單倍型分布，統(tǒng)計各單倍型的群體內(nèi) 頻率；
[0039] (2)篩選出代表日本囊對蝦種內(nèi)差異的單倍型作為分子標(biāo)記，確定該標(biāo)記的序列 特異性，計算分子標(biāo)記在野生群體中所占的比例，定期監(jiān)測比例變動范圍，以變動范圍不超 過5%為宜；
[0040] (3)選定在野生群體中歷年所占比例變動小的分子標(biāo)記，將帶有選定的分子標(biāo)記 的母蝦用于人工繁育放流用的子一代；
[0041] (4)在捕撈期回捕放流區(qū)域的個體，檢測分子標(biāo)記，計算帶有選定的分子標(biāo)記的個 體在回捕群體中的比例，確定比例變動情況，從而估算放流群體對該區(qū)域所有日本囊對蝦 生態(tài)量的貢獻(xiàn)值，最終確定該批次的放流效果。
[0042] 日本囊對蝦CYTB測序所得序列用于分析的片段為1136個堿基對，從中截取測序 可信度高，有代表性的731個堿基對的片段作為應(yīng)用對象，一共發(fā)現(xiàn)74個多態(tài)性位點，得到 46個單倍型。從中選取5個單倍型（5個單倍型具體序列為如SEQ ID NO:4-8所示），放流 前預(yù)備調(diào)查中其對應(yīng)的個體占全部調(diào)查基礎(chǔ)野生個體的比例范圍為6. 3?9. 7%，利用該 5個單倍型的母蝦人工繁育的小蝦用于放流，放流后第一次回捕調(diào)查結(jié)果顯示，具備該5個 單倍型分子標(biāo)記的個體占總回捕個體的16.6%。
[0001] 說明書核苷酸和氨基酸序列表 SEQUENCE LISTING <110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 <120> -種日本囊對蝦放流效果的評估方法 <130〉 1 <160> 8 <170^ Palcnlln version 3.3 <210 1 <211> 1247 <212> DNA <213>人工序列 <400> 1 tlaclaacac Ulltllggl cctllacgci laicalctla aiaalgacaa taccaattcg 60 laaalclcac cccUallla aaallclaaa iggagcagla gtcgalUac cagccccagc 120 caalaillcl acaclllgaa atlUggglc Iclcltaggt tlatglUag laatccaaat 180 tgllaclggg ctciuuag cialacacia tacagcccac gugaccltg cauuccag 240 tglagclcac dltgccgag algllaatta tggUgaclc dacgaaclc tcacgccaa 300 tgglgculcc tlctlcltla UlgcLLata tatgcacaca ggacgaggla tUattalgg ttccLlccu laccttcacg (cigatcagi aggagUgia attetaette cglgaiggc 420 aaclgccltc clLggUatg tccllccclg agglcagala Iccitclgag gagcaaclgl 480 caLlactacH； cUlluLcgg ccaLccctUi taUgggcua galtiagtec aatgacitilg 540 aggaggtttc gcagtagata acgcaacact aacacgcttc ttacctttc sctttctgtt 600 cxcaUcalt gtagcagcag clacaalcal IcacaltcU iUattcacc aaacaggtlc 660 laacaalccc cUtggaalcg ttagaaalgL agataaagta caltccalc dliitutac 720 allcaaagac atcaccggal ttatcgtaat actaaclgcc cliattttat taaclUaci 780 [0002] aaaccctlal (ttclaggag acccagacaa LLttaltccc g;taacccll Lagttacccc 840 ggcccaialc cagcccgaal ggtalUlU alllgcaial gccatcttgc gatctaU.cc 900 laalaagtia gggggagtaa UgccLlggt tataiclatc UgaltcUc Icatctlacc 960 Utlacacal gcagciaaat Ucggagcci lacaUUac cclcllaacc agaccatatt 1020 cigalcliia glaaglalig lallcclacl lacaigaall ggagclcgcc cigligaaga 1080 IccttatgU atlacaggac aaatcclaac cglgctUat Uclcatatl acaltaltaa 1140 cccaclcacc cicatctggl gagalaaaal aclagallaa gltaltiggc tgacaggaaa 1200 gcacglgttt tgaaagclcg ctaiaggggl tgaalcctc feataac 1247 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <4()0> 2 gatllaccag teccagc 17 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3 ggalltgtcc tglaataaca tiag 24 <210> 4 <211> 731 <212> DNA <213>人工序列 <4()()> 4 aggaatagal qjlaagalgg catatgcaaa tiaaaaatac Gittcgggct ggiatgggc 60 cgggglaacl aaagggllag cgggaalaaa allglclggg tcicclaaaa giiaagggll 120
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[0005] <210> 7 <211〉 731 <212> DNA <213>人工序列 <400> 7 aggaalagat cgcaagatgg calalgcaaa laaaaaatac caitcgggct ggatatgggc ({) cgggglaacl aiagggltag cgggaataaa altgtctggg tlcctaaaa gilaagggtl 120 tagtaaagtt aataaaataa gggragttag tattacgata aitccggtga gtctttgaa 180 tgtaaaataa ggatggaatg gtactttatc tacatttcta acgatlccta ggggatigtt 240 agaacctgll Igglgaataa aaagaatgtg aatgaligta gdgctgcla caatgaatgg 300 gaacagaaag igaaaggtaa agaagcgtgt lagtgttgcg Uatctactg cgaaacclcc 360 Icaaattcat tggactaaat ciggiccaat ataagggatg gccgagaaaa ggtlagtaat 420 gacagtlgct cctcagaagg alatclgacc tcagggaagg acataaccaa ggaaggcagl 480 tgccattacg agaagtagaa ttacaaclcc lactgaicag gcgigaaggt aaaggaagga 540 accataaiaa atacclcgcc ctgtglgcat ataiaagcaa ataaagaaga aggaggcacc 600 a^ggcgigg agagttcgta ggagtcaacc ataattaaca tctcggcaaa tgtgagclac 660 actggaaaat gcaaggtcta cgtgggctgt atagtgtata gctaaaaaga gcccagtaac 720 aalUggalt a 731 <210> 8 <211〉 731 <212> DNA <213>人工序列 <400> 8 aggaalagal cgcaagatgg calalgcaaa laaaaaatac catlcgggcl ggalalgggc 60 aggggtaact saagggttag cgggaataaa aitgtctggg Ctcctaaaa gitaagggtt 120
[0006]
【權(quán)利要求】
1. 一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，包括： (1) 采集日本囊對蝦放流區(qū)域的野生群體和準(zhǔn)備用于放流的繁育群體，選用線粒體序 列中的片段作為研究對象，通過PCR擴增和測序，分析野生群體和繁育群體的序列差異和 單倍型分布，統(tǒng)計各單倍型的群體內(nèi)頻率； (2) 篩選出代表日本囊對蝦種內(nèi)差異的單倍型作為分子標(biāo)記，確定該標(biāo)記的序列特異 性，計算分子標(biāo)記在野生群體中所占的比例，定期監(jiān)測比例變動范圍； (3) 選定在野生群體中歷年所占比例變動小的分子標(biāo)記，將帶有選定的分子標(biāo)記的母 蝦用于人工繁育放流用的子一代； (4) 在捕撈期回捕放流區(qū)域的個體，檢測分子標(biāo)記，計算帶有選定的分子標(biāo)記的個體在 回捕群體中的比例，確定比例變動情況，從而估算放流群體對該區(qū)域所有日本囊對蝦生態(tài) 量的貢獻(xiàn)值，最終確定該批次的放流效果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：所述步 驟（1)中的線粒體序列為細(xì)胞色素B基因DNA序列、D-loop區(qū)序列或COI序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：所述細(xì) 胞色素B基因DNA序列如SEQ ID NO: 1所示；對應(yīng)的PCR擴增引物MJ-CYTB-F、MJ-CYTB-R 序列如SEQ ID NO:2和NO:3所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：所述步 驟⑴中的PCR反應(yīng)體系為：30μ?反應(yīng)體系，其中包括SyLlOXPCR緩沖液，引物的濃度 均為ΙΟμΜ，上游引物和下游引物分別為0. 5yL，lyL2. 5mM each dNTP，0. 5yL Taq DNA聚 合酶，0. 5 μ L DNA模板；補充23. 5 μ L去離子水至30 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：所述步 驟（1)中的PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，50°C退火45s，72°C延伸70s， 共28個循環(huán)，最后72°C延伸7min，10°C保存并結(jié)束程序。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：所述步 驟（2)中的變動范圍要求不超過5%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：所述步 驟（3)中放流前對增殖群體的母本、子代預(yù)先進(jìn)行檢測，以確定選定的分子標(biāo)記的有效性、 可檢出性，并確定子一代攜帶的分子標(biāo)記與用于繁育的母蝦一致。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：連續(xù)多 年對分子標(biāo)記進(jìn)行追蹤檢測，評估該批次放流的長期效果。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種日本囊對蝦放流效果的評估方法，其特征在于：不同批 次的放流選用不同的分子標(biāo)記，以分別評估各個批次的放流效果。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099412SQ201410247079
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】蔣科技, 胡敬環(huán), 張鳳英, 宋煒, 馬凌波, 程家驊, 李圣法, 姜亞洲, 馬春艷, 張丹, 房婭博, 喬振國 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所