蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，即針對基孔肯雅病毒、克里米亞-剛果出血熱和裂谷熱病毒三種蟲媒病毒分別設(shè)計特異性引物和探針，通過單重PCR和克隆測序，確定了引物和探針的特異性后，進行多重PCR擴增，在擴增反應(yīng)體系中，上下游引物的濃度比為1:1-1:8；然后將探針與熒光編碼微球偶聯(lián)制得微球混合液并通過偶聯(lián)探針進行偶聯(lián)質(zhì)量控制；最后將多重PCR產(chǎn)物與微球混合液進行雜交反應(yīng)，同時加入用核酸檢測緩沖液稀釋的鏈霉素-藻紅蛋白，并通過液相芯片檢測儀對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析。本發(fā)明檢測特異性好，可以同時檢測三種蟲媒病毒；由于在多重PCR擴增過程中，采用不對稱PCR的擴增方法，本發(fā)明檢測靈敏度高。
【專利說明】蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可以同時檢測基孔肯亞熱病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、裂 谷熱病毒三種蟲媒病毒的液相芯片三重檢測方法以及所涉及的液相芯片的制備方法和應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 蟲媒病毒是指一類以吸血昆蟲為媒介，在脊椎動物和人、畜間傳播多種嚴重疾病 的病毒。目前已發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒約537種，分布遍及世界五大洲，已證實其中130余種對 人畜有致病性 [1]。在病毒分類中，蟲媒病毒隸屬14個病毒科。根據(jù)所包括病毒的種類及其 與人、畜疾病的關(guān)系，蟲媒病毒主要集中在披膜病毒科甲病毒屬（29種）、黃病毒科黃病毒 屬（69種）、呼腸孤病毒科（77種）和布尼安病毒科（350種），其中許多病毒對人類健康和 生命安全危害較大 [2]。
[0003] 基孔肯雅熱的病原體為基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV)，主要傳播 媒介為埃及伊蚊ii)、白紋伊蚊?)和非洲伊蚊 a/rica/ws)，以"人-蚊-人"的方式循環(huán)。該病毒最早在非洲，隨后在印度和東南亞流行。 近幾年，基孔肯雅熱在非洲和亞洲再次暴發(fā)，導(dǎo)致數(shù)百萬人發(fā)病 [3]，且傳播范圍具有超出現(xiàn) 有分布范圍的趨勢，即向中美洲、南美洲以及美國南部和中國等地區(qū)擴散。2008年，我國首 次從2例斯里蘭卡回國的輸入性病例血清標本中檢出CHIKV。2010年我國廣東省東莞市發(fā) 生基孔肯雅熱流行，共確定診斷173例患者。該病傳播媒介在我國廣泛分布，尤其在南方地 區(qū)具有引發(fā)基孔肯雅熱流行的條件 [2]。基孔肯雅熱的典型表現(xiàn)為突起高熱，關(guān)節(jié)疼痛以及 皮疹。在亞洲，CHIKV與出血熱綜合征有密切關(guān)系，類似登革出血熱或登革休克綜合征。
[0004] 克里米亞-剛果出血熱（Crimean Congo hemorrhagic fever, CCHF)(在中國稱 新疆出血熱）因感染CCHF病毒引起，是中國目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的4種蟲媒病毒性傳染病之一
[4] 〇CCHF病毒屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae)，內(nèi)羅畢病毒屬（Nairovirus genus)，CCHF 病毒廣（CCHFV)泛分布于非洲、中東、歐洲東南部和亞洲的干燥地區(qū)，我國新疆從1964至 1994年共報告260例病人 [5]。各種野生哺乳動物為該病毒儲存宿主，流行季節(jié)為3-6月，呈 散發(fā)流行。該病毒引起以發(fā)熱、全身性出血為典型特征的烈性傳染疾病，病死率高達67% [6]。
[0005] 裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus, RVFV)屬于布尼安病毒科白蛉熱病毒 屬，蚊蟲為主要傳播媒介。該病毒可引起具有高發(fā)病率和高病死率的急性出血性人畜共 患傳染病。人類感染裂谷熱后，主要表現(xiàn)為發(fā)熱，乏力，頭痛，肌肉痛，關(guān)節(jié)痛，有時會有惡 心，嘔吐，部分會出現(xiàn)眼部疾病、腦膜炎或出血熱。近10多年，該病在非洲流行較為嚴重， 2006-2007年肯尼亞共報道684例（155例死亡），索馬里報道114例（51例死亡）；2007年 坦桑尼亞報道290例（117例死亡），蘇丹報道228例；2008年馬達加斯加島報道418例（7 例死亡）（WH0, 2007, 2008)。該病曾被認為僅在非洲流行，直到2000年9月沙特阿拉伯和也 門有確診病例，該病具有向亞洲其他地區(qū)以及歐洲傳播的趨勢，我國應(yīng)引起高度關(guān)注 [7]。
[0006] 多重PCR (multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是根植于普通PCR技術(shù) 的一種特殊方法，可在同一 PCR反應(yīng)管中同時擴增出一個或多個核酸片段，一次操作即可 完成多個靶基因的擴增，具有高效性、經(jīng)濟性、簡便性等顯著的優(yōu)點。液相芯片技術(shù)是20世 紀90年代后期發(fā)展起來的被喻為后基因組時代的芯片技術(shù)，是融流式技術(shù)、熒光微球、激 光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的一種新型生物分子高通量檢測技術(shù) [8_9]。液相芯 片技術(shù)的出現(xiàn)，大大拓寬了科學(xué)研究者和醫(yī)學(xué)工作者的研究空間，目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用 于臨床診斷如腫瘤標志物、內(nèi)分泌激素、遺傳性疾病的基因診斷、組織配型的基因檢測、病 原菌感染等的檢測 [1°_14]。
[0007] 我國國土面積廣大，地理條件復(fù)雜多樣，地跨寒、溫、熱三帶，存在多種媒介昆蟲， 適宜多種蟲媒病毒生存?；卓涎艧岷涂死锩讈?剛果出血熱均在我國發(fā)生過較大規(guī)模的 暴發(fā)，同時我國具備裂谷熱病毒滋生、傳播的天然條件和疫情暴發(fā)的誘發(fā)條件 [15]。隨著人 類活動范圍的日益擴大和人員流動的日益廣泛，境外蟲媒病毒病傳入我國的可能性顯著增 力口。但上述三種病毒病的臨床表現(xiàn)相似，且主要流行于非洲、亞洲等地區(qū)，通過簡單的體溫 監(jiān)測及流行病學(xué)個案調(diào)查難以區(qū)分與鑒別。本研究采用多重PCR結(jié)合液相芯片技術(shù)(如圖 1所示)，能一次同時檢測這3種病毒，對這些病毒的監(jiān)測、檢測和控制研究具有重要的現(xiàn)實 意義。蟲媒病毒的早發(fā)現(xiàn)、早鑒定可以提高我國防控該類傳染病的能力，對保護人民的健康 和生命安全具有重要意義 [16]。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明將多重PCR技術(shù)和液相芯片技術(shù)有機結(jié)合，對CHIKV的E1基因、RVFV的 Polymerase L基因、CCHFV的Nucleoprotein基因聯(lián)合起來檢測，提供了一種相比單重PCR 技術(shù)檢測而言操作步驟簡化，而且成本低的檢測方法，同時還充分發(fā)揮了液相芯片技術(shù)高 通量的技術(shù)優(yōu)勢，大大減少了工作量。
[0009] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：針對CHIKV、RVFV、CCHFV三種蟲媒病毒分別設(shè)計特異 性引物和探針，通過單重PCR和克隆測序，確定引物和探針的特異性；然后設(shè)計三種病毒的 特異性探針，偶聯(lián)不同編號的編碼微球，并通過優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系和液相芯片雜交體 系，建立了針對CHIKV、RVFV、CCHFV三種蟲媒病毒液相芯片檢測最佳反應(yīng)條件，最后通過液 相芯片檢測系統(tǒng)實現(xiàn)對三種蟲媒病毒的同時檢測。
[0010] 具體而言，本發(fā)明提供的一種蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，包括如下步驟： 1)設(shè)計引物并對下游引物進行生物素標記，在引物特異性驗證成功后，進行蟲媒病毒 多重PCR擴增，其中所述蟲媒病毒為基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV)、克里米 亞-剛果出血熱病毒（Crimean Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)和裂谷熱病毒 (Rift Valley fever virus, RVFV)三種；其中所述PCR擴增的反應(yīng)體系為：

【權(quán)利要求】
1. 蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 設(shè)計引物并對下游引物進行生物素標記，在引物特異性驗證成功后，進行蟲媒病毒 多重PCR擴增，其中所述蟲媒病毒為基孔肯雅病毒CHIKV、克里米亞-剛果出血病毒CCHFV 和裂谷熱病毒RVFV三種，其中多重PCR擴增反應(yīng)體系為：
反應(yīng)條件為：95 °C，10 min;94 °C，30 s，55 °C，30 s，72 °C，30 s，35 cycles;72 °C，10 min ;4°C，hold;所述混合引物為上下游引物的混合物，上下游引物的濃度比為 1:1-1:8 ;反應(yīng)體系中所述模板可以為模板1、2、3種的任意一種或任意兩種組合或三種； 2) 設(shè)計核酸探針并進行氨基化修飾，與熒光編碼微球偶聯(lián)制得微球混合液； 3) 設(shè)計偶聯(lián)質(zhì)控探針并加入到步驟2)得到的微球混合液進行偶聯(lián)質(zhì)量控制，所述偶 聯(lián)質(zhì)控探針序列與步驟2)所述核酸探針序列互補； 4) 將PCR產(chǎn)物與微球混合液進行雜交反應(yīng)，同時加入用核酸檢測緩沖液稀釋的鏈霉 素-藻紅蛋白，并通過液相芯片檢測儀對反應(yīng)產(chǎn)物進行分析。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述基孔肯 雅病毒CHIKV、裂谷熱病毒RVFV和克里米亞-剛果出血熱CCHF的引物序列為：
〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述上下游 引物的濃度比為1:8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述核酸探 針和偶聯(lián)質(zhì)控探針的序列為：
〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述序列中 每個核酸探針的5'端加10個poly (T)，再加氨基修飾，并對偶聯(lián)質(zhì)控探針的5 '端進行了生 物素標記。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，步驟2)所述 偶聯(lián)微球混合液通過如下步驟制得： 1) 隨機選取帶有不同編號的羧基化微球并活化； 2) 向活化微球中各加入100 pmol/μ L的氨基化修飾的核酸探針3-5 μ?，瞬時震蕩； 3) 再各加3 μ?核酸偶聯(lián)活化劑，S卩10 mg/mL的EDC到上述微球中，瞬時震蕩； 4) 室溫避光孵育30-45min; 5) 向上述微球中各加200 μ?核酸偶聯(lián)洗滌液A，即0. 02%吐溫-20,全速震蕩5min ; 6) 12,000Xg 離心微球 lOmin; 7) 棄上清，向上述微球中加入20〇μ?核酸偶聯(lián)洗滌液B，即0. 1% SDS，全速震蕩5min ; 8) 12,000Xg 離心微球 lOmin; 9) 棄上清，不要觸動沉淀； 10) 各加入?οομ?核酸偶聯(lián)微球貯存液，全速震蕩或超聲波懸浮微球5min制得偶聯(lián) 微球混合液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，步驟3)偶聯(lián) 質(zhì)量控制包括如下步驟： 1) 取偶聯(lián)混合微球5PL，加入到1.5 mL離心管中，并用核酸檢測緩沖液1，即 1. 5XTMAC，稀釋至 33PL ; 2) 將偶聯(lián)質(zhì)控探針稀釋至0. Ο?μΜ的混合液，取7PL偶聯(lián)質(zhì)控探針混合液，加入到含上 述33PL微球混合液的1. 5mL離心管中； 3) 然后用核酸檢測緩沖液2，即1. 0XTMAC，補足體積至5(^L，52°C避光孵育15min ; 4) 加入25μ?的l(^g/mL SAPE，混勻，52°C避光孵育5min，加入反應(yīng)終止液5〇μ?; 5) 液相芯片系統(tǒng)中進行測試，判斷標準：空白質(zhì)控熒光信號中值小于100,偶聯(lián)質(zhì)控熒 光信號中值大于1〇〇〇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，步驟4)所述 雜交反應(yīng)步驟為： 1) 設(shè)置PCR產(chǎn)物上樣量，分別為?μ?ν反應(yīng)、3μ?ν反應(yīng)、5μ?ν反應(yīng)、7μ?ν反應(yīng)； 2) 全速震蕩重懸微球混合液約3min ; 3) 對每個樣品孔和背景孔，加入微球混合液1〇μ?，然后加入33μ?核酸檢測緩沖液1， 艮 Ρ 1. 5XTMAC ; 4) 對每個背景孔，加入1PL /3PL /5PL /7PL PCR blank產(chǎn)物； 5) 對每個樣品孔，加入1PL /3μ? /5μ? /7PL PCR產(chǎn)物； 6) 用核酸檢測緩沖液2，即1. 0XTMAC補足體積至5〇μ? ; 7) 充分混勻反應(yīng)孔中的各成份； 8) 蓋上蓋子，防止液體蒸發(fā)，于金屬加熱器中進行如下反應(yīng)：95°C lOmin，變性； 52°C 15min，雜交； 9) 在樣品進行雜交反應(yīng)時，用核酸檢測緩沖液2將鏈霉素-澡紅蛋白稀釋至l(^g/mL， 制備新鮮的報告液； 10) 向每個反應(yīng)孔中加入25μ?的報告混合液，充分混勻； 11) 于金屬加熱器中52°C孵育5min ; 12) 52°C預(yù)熱，加入5〇μ?終止液，混勻； 13) 依照液相芯片檢測儀的操作說明進行檢測，判斷標準為：待測樣本的熒光中值 彡250時，判斷為陽性樣本。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的蟲媒病毒液相芯片三重檢測方法，其特征在于，所述PCR產(chǎn)物 上樣量為7uL。
【文檔編號】C12Q1/68GK104120191SQ201410247111
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】李云峰, 蔡鵬 , 龍川鳳, 趙亮, 葛藤 申請人:李云峰