一種高產(chǎn)l-精氨酸鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵優(yōu)化工藝的制作方法
【專利摘要】本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的誘變育種以及菌株代謝工程改造進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，相關(guān)成果已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利4項(xiàng)?；谇捌谘芯?，本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)L-精氨酸鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵優(yōu)化工藝，是在之前利用鈍齒棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸的工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，主要通過種子培養(yǎng)以及發(fā)酵工藝改進(jìn)來提高L-精氨酸產(chǎn)量。該工藝種子培養(yǎng)過程中，種子生長(zhǎng)迅速且最終菌濃較高。該工藝發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，無需添加維生素、氨基酸等微量元素，工藝控制簡(jiǎn)單，菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定，L-精氨酸產(chǎn)量達(dá)到56.3g/L，為國(guó)內(nèi)目前最高產(chǎn)量之一；糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到32％，為國(guó)內(nèi)目前最高水平。
【專利說明】一種高產(chǎn)L-精氨酸鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵優(yōu)化工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提高L-精氨酸發(fā)酵產(chǎn)量和葡萄糖利用率的發(fā)酵工藝。
技術(shù)背景
[0002]L-精氨酸是人和動(dòng)物體內(nèi)的一種半必需氨基酸，是多種生物活性物質(zhì)的合成前體，具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用。隨著對(duì)精氨酸的生物學(xué)功能不斷地深入研究和了解，精氨酸在醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)上的用途越來越廣泛。
[0003]L-精氨酸的生產(chǎn)方法有水解法和發(fā)酵法。我國(guó)現(xiàn)有的生產(chǎn)廠家目前大多仍主要采用蛋白質(zhì)水解法來生產(chǎn)L-精氨酸，該方法對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重且收率不高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸工藝相對(duì)簡(jiǎn)單且對(duì)環(huán)境友好，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但是，?guó)內(nèi)以微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，產(chǎn)酸水平普遍較低，成本較高，生產(chǎn)水平和產(chǎn)量不能滿足國(guó)內(nèi)需求。因此，提高L-精氨酸的發(fā)酵產(chǎn)酸水平和葡萄糖利用率非常重要。
[0004]本實(shí)驗(yàn)室前期工作中通過誘變育種篩選得到高產(chǎn)精氨酸Corynebacteriumcrenatum SYPA5-5，并對(duì)該菌株的L-精氨酸合成代謝途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的分析；對(duì)1^_精氨酸合成代謝中的反饋抑制與反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控作用進(jìn)行了研究，解除了菌株SYPA5-5中的反饋抑制；同時(shí)對(duì)精氨酸合成的競(jìng)爭(zhēng)旁路代謝關(guān)鍵酶基因進(jìn)行敲除等代謝改造，在增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物精氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因簇表達(dá)的同時(shí)，削弱脯氨酸、谷氨酰胺等競(jìng)爭(zhēng)支路途徑的代謝流，最終使L-谷氨酸分 解代謝集中在L-精氨酸的合成代謝流從而提高了精氨酸的產(chǎn)量，相關(guān)成果已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利4項(xiàng)。
[0005]對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)精氨酸而言，合適的發(fā)酵工藝對(duì)保證產(chǎn)酸水平、菌株發(fā)酵性能的穩(wěn)定性、原料利用率至關(guān)重要。所以有必要通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化尤其是培養(yǎng)基的優(yōu)化提高精氨酸產(chǎn)量、菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定性、糖酸轉(zhuǎn)化率，降低生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所使用的菌株為Corynebacterium crenatum SYPA5-5,是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化的用于L-精氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵工藝，該工藝控制簡(jiǎn)單，菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定，L-精氨酸產(chǎn)量以及葡萄糖利用率得到顯著提高。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案:利用優(yōu)化過的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵種子，所述的種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，硫酸銨20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，碳酸鈣lg/L ;種子培養(yǎng)過程采用700mL帶擋板的三角瓶，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間24h ；培養(yǎng)好的種子接入優(yōu)化過的發(fā)酵培養(yǎng)基中，優(yōu)化過的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖170g/L，酵母粉8g/L，硫酸銨20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.5g/L ;發(fā)酵過程溫度為30°C，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，50%氨水控制pH7.0，通氣量3L/min，發(fā)酵至葡萄糖耗盡結(jié)束。
[0009]本發(fā)明的有益效果:利用本發(fā)明所提供的種子培養(yǎng)工藝，發(fā)酵種子生長(zhǎng)迅速且最終菌濃較大，接種發(fā)酵培養(yǎng)基后菌體生長(zhǎng)延滯期明顯縮短，顯著提高了精氨酸的發(fā)酵效率。利用本發(fā)明所提供的精氨酸發(fā)酵工藝，發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單，無需添加維生素、氨基酸等微量元素，工藝控制簡(jiǎn)單，顯著提高了菌株發(fā)酵性能的穩(wěn)定性以及L-精氨酸的產(chǎn)量和葡萄糖的利用率。
【具體實(shí)施方式】:
[0010]對(duì)照實(shí)施例:種子培養(yǎng)基成分:葡萄糖30g/L,玉米衆(zhòng)20g/L,尿素1.5g/L,磷酸二氫鉀lg/L，硫酸銨20g/L，硫酸鎂0.5g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基成分:葡萄糖120g/L，玉米漿40g/L，生物素8X 10_5g/L，組氨酸5X 10_4g/L，硫酸錳0.02g/L,硫酸銨20g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸亞鐵0.02g/L。種子培養(yǎng)過程采用普通250mL三角瓶，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間14h ;發(fā)酵過程溫度為30°C，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，50%氨水控制pH7.0，通氣量3L/min，發(fā)酵至葡萄糖耗盡結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后L-精氨酸產(chǎn)量為33.4g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為28 %。
[0011] 實(shí)施例:種子培養(yǎng)基成分為:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，硫酸銨20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，碳酸鈣lg/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖170g/L，酵母粉8g/L，硫酸銨20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.5g/L。種子培養(yǎng)過程采用700mL帶擋板的三角瓶，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間24h ;發(fā)酵過程溫度為30°C，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，50%氨水控制pH7.0,通氣量3L/min，發(fā)酵至葡萄糖耗盡結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后L-精氨酸產(chǎn)量為56.3g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為32%。
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)L-精氨酸鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵優(yōu)化工藝，是基于實(shí)驗(yàn)室前期的微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸研究工作，本實(shí)驗(yàn)室前期工作中通過誘變育種篩選得到高產(chǎn)精氨酸鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5,并對(duì)其L-精氨酸生物合成途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的代謝工程改造，顯著提高了 L-精氨酸產(chǎn)量，相關(guān)成果已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利4項(xiàng)，一種高產(chǎn)L-精氨酸鈍齒棒桿菌分批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，種子培養(yǎng)基含有葡萄糖、酵母粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、碳酸鈣；發(fā)酵培養(yǎng)基含有葡萄糖、酵母粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂；他們的含量如下: 種子培養(yǎng)基:葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，硫酸銨20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，碳酸鈣lg/L ； 發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖170g/L，酵母粉8g/L，硫酸銨20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.5g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種L-精氨酸分批發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，所述發(fā)酵優(yōu)化工藝采用權(quán)利要求1所述的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)c.crenatum SYPA5-5發(fā)酵種子,采用權(quán)利要求I所述的發(fā)酵培養(yǎng)基用于C.crenatum SYPA5-5發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵優(yōu)化工藝，其特征在于，種子培養(yǎng)過程采用帶擋板的三角瓶，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間24h ;發(fā)酵過程溫度為30°C，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，50% 氨水控制pH7.0，通氣量3L/min，發(fā)酵至葡萄糖耗盡結(jié)束。
【文檔編號(hào)】C12P13/10GK103981231SQ201410249335
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】許正宏, 饒志明, 滿在偉, 徐美娟, 楊套偉, 張顯, 耿燕 申請(qǐng)人:江南大學(xué)