表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒及其應(yīng)用，屬于表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒的拯救和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明通過重疊PCR方法將螢火蟲熒光素酶基因克隆到豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的Npro蛋白編碼區(qū)內(nèi)，利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術(shù)拯救了一株穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組病毒CSFV-NproFluc，其微生物保藏編號為：CGMCC?No.9058。本發(fā)明重組豬瘟病毒所攜帶的熒光素酶基因在連續(xù)傳代過程中穩(wěn)定遺傳，豬瘟病毒感染性沒有發(fā)生變化，在抗體效價(jià)測定以及高通量篩選豬瘟病毒特異性抑制劑等方面有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組豬瘟病毒，尤其涉及一株表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒，本發(fā)明還涉及該重組豬瘟病毒在抗體效價(jià)測定和篩選豬瘟病毒特異性抑制劑中的應(yīng)用，屬于表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒的拯救和應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]豬痕(classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(classical swine fevervirus, CSFV)引起的一種接觸性、致死性傳染病，以高熱和出血為其典型特征，發(fā)病率和死亡率極高，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須申報(bào)的動物疫病。豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，常造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也是中國計(jì)劃要消滅的重大動物疫病之一。目前，對豬瘟疫情的防控主要是通過對感染豬進(jìn)行嚴(yán)格撲殺和對周邊地區(qū)進(jìn)行消毒防疫。
[0003]豬痕病毒(CSFV)是黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬(Pestivirus)的成員，CSFV基因組為單股正鏈線性RNA分子，基因組大小為12.3kb，兩端分別為5'端非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)和 3'端 UTR,中間包含一個(gè)大的開放閱讀框(open readingframe，0RF)，其中ORF編碼一個(gè)由3898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白。該多聚蛋白在病毒感染的宿主細(xì)胞內(nèi)，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解為11種病毒特異性蛋白，包括4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(C、Ems、El和E2)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NpM、P7、NS2_3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B) (Moen nig, V., 2000.1ntroduction to classical swine fever: virus, diseaseand control policy.Vet.Microbiol.73, 93 - 102.)。
[0004]反向遺傳操作技術(shù)的建立為研究CSFV基因功能和新型疫苗開辟了新的途徑。利用反向遺傳操作技術(shù)將外源標(biāo)簽插入病毒基因組可以用來研究病毒的復(fù)制、病毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選(Beer, M., Reimann, 1., Hoffmann, B., Depner, Κ., 2007.Novelmarker vaccines against classical swine fever.Vaccine25, 5665 - 5670.)。例如，攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的CSFV可用于病毒感染的快速檢測和中和抗體效價(jià)的測定(Li，Y.，Shen, L., Sun, Y., Yuan, J., Huang, J., Li, C., Li, S., Luo, Y., Qiu, H.J., 2013.Simplified serumneutralization test based on enhanced green fluorescent protein-tagged classicalswine fever virus.J.Clin.Microbiol.51, 2710 - 2712.)。但是，綠色突光蛋白的檢測需要通過借助熒光顯微鏡進(jìn)行判斷，因此在高通量篩選方面受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是拯救一株能夠穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase, Flue)基因的重組CSFV，該穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶的重組CSFV能夠快速檢測CSFV的復(fù)制并能高通量篩選抗豬瘟病毒因子，解決現(xiàn)有技術(shù)中用綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組豬瘟病毒的檢測需要借助熒光顯微鏡進(jìn)行判斷以至在高通量篩選方面受到限制等問題。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:[0007]本發(fā)明通過重疊PCR方法將螢火蟲熒光素酶基因克隆到豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的Npro編碼區(qū)內(nèi)第412位堿基和第413位堿基之間(即ΝΡ11'°蛋白第13位和第14位氨基酸之間)，構(gòu)建出含有Fluc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-NproFluc ;利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術(shù)用pBRCISM_Npir°Fluc拯救出
5株攜帶 Fluc 基因的重組豬瘟病毒，即:CSFV-NpMFluc、CSFV-NproFluc-U CSFV-NproFluc-2,CSFV-NproFluc-3 和 CSFV-NpMFluc_4，其中重組病毒 CSFV_Npir°Fluc 在所表現(xiàn)出的 Fluc 活性以及遺傳穩(wěn)定性方面明顯優(yōu)于另外4株重組豬瘟病毒；本發(fā)明將性能最為優(yōu)異的重組豬瘟病毒CSFV-Np1:°Fluc提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為=CGMCC N0.9058 ；分類命名為:表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒。保藏單位:中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時(shí)間是2014年4月11日；保藏地址:中國北京朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0008]本發(fā)明還提供了拯救攜帶Fluc基因的重組病毒CSFV-Npn5Fluc的方法，包括以下步驟:
[0009](I)擴(kuò)增 Fluc 基因；
[0010](2)擴(kuò)增CSFV病毒第215-412位堿基和第413-684位堿基之間的基因片段；
[0011](3)通過重疊PCR將步驟⑴和⑵的擴(kuò)增片段融合，獲得融合片段Fluc-N_ ；
[0012](4)將步驟(3) 獲得的融合片段FIuc-Npm克隆至豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆中，構(gòu)建出含有Fl uc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-NpmFIuc ；
[0013](5)將質(zhì)粒pBRCISM-NpmFIuc轉(zhuǎn)染SK6細(xì)胞，將細(xì)胞傳代后，收獲病毒，即得。
[0014]其中，步驟⑶中重疊PCR所用引物序列為SEQ ID N0.1-6所示；步驟⑷中所用豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆為pBRCISM ;步驟(4)中用XhoI和AgeI雙酶切融合片段Fluc-Npn5和豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆。
[0015]本發(fā)明通過間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和RT-PCR方法均顯示重組病毒CSFV-NproFluc拯救成功。測定病毒生長曲線后發(fā)現(xiàn)該重組病毒與親本病毒Shimen株相比，病毒滴度下降了近10倍。該重組病毒在兩種豬源細(xì)胞系(PK-15和SK6)上連續(xù)傳代的過程中，其所攜帶的Fluc基因并沒有發(fā)生丟失，且在傳代的過程中病毒滴度和表達(dá)Fluc基因能力未發(fā)生明顯變化，證明了該重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。
[0016]通過在不同時(shí)間點(diǎn)檢測CSFV-Npn5Fluc的Fluc活性發(fā)現(xiàn)，在感染重組病毒后4.5h檢測到CSFV Npm蛋白的表達(dá)。Western blot檢測結(jié)果表明，在CSFVHluc感染SK6細(xì)胞12h后，可以檢測到預(yù)期大小的Npm-FIuc融合蛋白。隨著感染時(shí)間的延長，目的蛋白免疫染色的信號強(qiáng)度逐漸增大，同F(xiàn)luc活性增強(qiáng)的趨勢相同。
[0017]CSFV基因組為12.3kb，其允許外源基因插入的容量是未知的。本發(fā)明插入的Fluc基因(1653bp)片段較大，是EGFP基因(717bp)的兩倍多，在CSFV基因組中引入較大基因片段能否成功拯救病毒、乃至所拯救的重組病毒是否保持親本病毒的特性具有不可預(yù)見性。
[0018]本發(fā)明以相同的方法通過重疊PCR將F1UC-FMDV2A融合基因引入豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的Npro蛋白編碼序列之前，構(gòu)建出含有Fluc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-Fluc2A ;利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術(shù)，將pBRCISM-Fluc2A轉(zhuǎn)染SK6細(xì)胞，但是未能拯救出重組豬瘟病毒。
[0019]本發(fā)明以相同的方法通過重疊PCR將Fluc基因引入豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆pBRCISM的NS5A編碼序列之中(即NS5A蛋白第3166位和第3167位氨基酸之間)，構(gòu)建出含有Fluc基因的CSFV全長感染性克隆，命名為pBRCISM-NS5A-Fluc。利用基于RNA聚合酶II的反向遺傳操作技術(shù)，用pBRCISM-NS5A-Fluc轉(zhuǎn)染SK6細(xì)胞，同樣也未能拯救出
重組豬瘟病毒。
[0020]本發(fā)明還提供了攜帶Fluc基因的重組病毒CSFV-NpmFIuc在抗體效價(jià)測定中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明用該重組病毒對免疫攻毒后的50份豬血清進(jìn)行了中和試驗(yàn)，結(jié)果表明，CSFV-Fluc-NT測定的抗CSFV中和抗體滴度與由IDEXX-ELISA測定的抗體阻斷率呈現(xiàn)良好的相關(guān)性(R2 = 0.9194)，表明CSFV-NpmFIuc可以用來定量檢測中和抗體。
[0022]本發(fā)明還提供了攜帶Fluc基因的重組病毒CSFV-NpmFIuc在篩選CSFV特異性抑制劑中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明用該重組病毒測定了 12個(gè)針對CSFV基因組不同區(qū)域的siRNA的干擾效果。結(jié)果表明，利用該重組 病毒成功的篩選出了 3個(gè)對CSFV復(fù)制具有較強(qiáng)干擾效果的SiRNA分子。
[0024]與傳統(tǒng)的CSFV中和試驗(yàn)(CSFV-wt-NT)相比，CSFV_Fluc_NT具有較多優(yōu)勢。首先，CSFV-Fluc-NT無抗體的孵育和染色程序，從而可以節(jié)省時(shí)間；其次，CSFV-Fluc-NT中Fluc活性的測定可以在儀器上快速進(jìn)行，并不需要用目視判定結(jié)果的IFA。此外，CSFV-Fluc-NT可以在冷凍儲存板(細(xì)胞裂解后)儲存3d后進(jìn)行，也可以用于批量分析。本發(fā)明拯救的CSFV-NproFluc適用于高通量篩選抗病毒藥物。
[0025]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
[0026]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0027]術(shù)語“反向遺傳操作技術(shù)”意指通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上對病毒基因組進(jìn)行體外人工操作，如進(jìn)行基因點(diǎn)突變、缺失、插入、顛換、轉(zhuǎn)位和互補(bǔ)等改造，以此來研究RNA病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理、RNA編輯和自發(fā)重組與誘導(dǎo)重組、病毒與宿主間的相互作用關(guān)系、抗病毒策略、基因治療研究，以及構(gòu)建新型病毒載體來表達(dá)外源基因和進(jìn)行疫苗的研制等。
[0028]術(shù)語“基因組”意指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子(部分病毒是RNA)。
[0029]術(shù)語“核苷酸序列”意指DNA或RNA中堿基的排列順序。
[0030]術(shù)語“疫苗”意指將病原微生物(如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動免疫制劑。
[0031]術(shù)語“轉(zhuǎn)染”意指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。
[0032]術(shù)語“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒價(jià)，衡量病毒滴度的單位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)、半數(shù)致死量(LD5tl)和半數(shù)組織感染量(TCID5tl)。
[0033]術(shù)語“免疫”意指機(jī)體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應(yīng)答排除抗原性異物，以維持機(jī)體生理平衡的功能。
[0034]術(shù)語“中和抗體”意指當(dāng)病原微生物侵入機(jī)體時(shí)會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，能夠與病原微生物表面的抗原結(jié)合，從而阻止該病原微生物黏附靶細(xì)胞受體，防止侵入細(xì)胞。[0035]術(shù)語“抗血清”意指一種含有多克隆抗體的血清。
[0036]術(shù)語“傳代”意指當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液的過程，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1 為 pBRCISM (A)、pBRCISM-NproFluc (B)、pBRCISM-Fluc2A (C)和pBRCISM-NS5A-Fluc(D)的構(gòu)建示意圖；
[0038]圖2為CSFV-NpmFIuc的Fluc基因表達(dá)的動力學(xué)；
[0039]圖3為用RT-PCR檢測CSFV-NpmFIuc在SK6細(xì)胞上連續(xù)傳代過程中不同代次(PO、PU P2、P3、P8、P9 和 P10)病毒基因組中的 Fluc-Npr?；颍籑1:DL_15, 000DNA marker ;P0、P1、P2、P3、P8、P9和PlO =CSFV-NproFluc在傳代過程中基因組中的FIuc-Npm基因的RT-PCR檢測；Shimen:親本病毒Shimen株基因組中的Npm基因的RT-PCR檢測；NT:為陰性對照(Negative control)，即不加 RNA 模板進(jìn)行 RT-PCR 檢測；M2:DL-2000DNA marker ；
[0040]圖4為IFA測定CSFV-NpmFIuc在連續(xù)傳代過程中的病毒滴度；
[0041]圖5為測定CSFV-NpmFIuc在連續(xù)傳代過程中表達(dá)的Fluc活性；
[0042]圖6為CSFV-NpmFIuc的免疫熒光試驗(yàn)檢測結(jié)果；
[0043]圖7為CSFV-NpmFIuc與親本病毒Shimen株的生長曲線；*，p < 0.05 ；
[0044]圖8為用Western blot檢測Npio-FIuc融合蛋白的表達(dá)；
[0045]圖9 為 CSFV-NproFluc 表達(dá) Fluc 活性的最早時(shí)間;**，p < 0.01 ;*** ;p < 0.001 ;
[0046]圖10為CSFV-Fluc-NT和IDEXX-ELISA檢測中和抗體滴度的相關(guān)性分析；
[0047]圖11為CSFV-NpmFIuc用于抗病毒siRNA的篩選結(jié)果；#，p < 0.01 ；
[0048]圖12為CSFV-NpmFIuc對于不同濃度抗病毒siRNA的劑量依賴性分析結(jié)果；
[0049]圖13為siRNA對親本病毒Shimen株的抑制效果驗(yàn)證結(jié)果；**, p < 0.01。
【具體實(shí)施方式】
[0050]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0051]1、實(shí)驗(yàn)材料
[0052]CSFV石門(Shimen)株(GenBank登錄號AF092448.2)和PK-15細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；SK6細(xì)胞由瑞典國家獸醫(yī)研究所Lihong Liu博士惠贈。
[0053] 包含F(xiàn)luc基因的質(zhì)粒pGEM-luc購自Promega公司；pMD18_T Simple載體購自TaKaRa公司；CSFV Shimen株的全長感染性克隆pBRCISM由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。針對CSFV E2蛋白的單克隆抗體和抗Npm蛋白的血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和保存；抗β -tubulin單克隆抗體和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Sigma公司。
[0054]雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；中和試驗(yàn)所用血清來源于用嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2免疫、用親本病毒Shimen株攻毒后的試驗(yàn)豬(Sun，Y.，Tian，D.Y.，Li，S.，Mengj Q.L.，Zhao, B.B.，Li，Y.，Li，D.，Ling, L.J.，Liao, Y.J.，Qiuj H.J.,2013.Comprehensive evaluation of the adenovirus/alphavirus-repliconchimeric vector-based vaccine rAdV-SFV-E2against classical swine fever.Vaccine31, 538 - 544.)。
[0055]實(shí)施例1攜帶Fluc基因的重組CSFV的拯救
[0056]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0057]1.1攜帶Fluc基因的全長感染性克隆的構(gòu)建
[0058]根據(jù)pGEM-luc 質(zhì)粒中 Fluc 基因設(shè)計(jì)引物 NpMFluc-2_F/Npir°Fluc-2-R(表 I)，以該質(zhì)粒為模板擴(kuò)增Fluc基因；根據(jù)親本病毒Shimen株全長序列設(shè)計(jì)引物NpmFIuc-1-F/NproFluc-1-R 和 Npir°Fluc-3-F/Npir°Fluc-3-R(表 I)，用這兩對引物分別擴(kuò)增病毒第 215-412位堿基和第413-684位堿基之間的基因片段；最后，以Npjr°Fluc-1-F/NpMFluc-3-R為引物，通過重疊PCR獲得融合片段FIuc-Npm,并將此融合片段FIuc-Npm連至pMD18-TSimple載體進(jìn)行測序鑒定。
[0059]表1引物名稱及其序列
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一株表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的重組豬瘟病毒，其特征在于:螢火蟲熒光素酶基因插入豬瘟病毒Shimen株Npm蛋白編碼區(qū)內(nèi)第412位堿基和第413位堿基之間。
2.按照權(quán)利要求1所述的重組豬瘟病毒，其特征在于，其微生物保藏編號為=CGMCCN0.9058。
3.—種拯救權(quán)利要求1或2所述的重組豬瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)擴(kuò)增螢火蟲熒光素酶基因； (2)擴(kuò)增豬瘟病毒第215-412位堿基和第413-684位堿基之間的基因片段； (3)通過重疊PCR將步驟⑴和⑵所擴(kuò)增的基因融合，獲得融合片段FIuc-Npm; (4)將步驟(3)獲得的融合片段FIuc-Npm克隆至豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆中構(gòu)建得到含有Fluc基因的豬瘟病毒全長感染性克隆質(zhì)粒； (5)將豬瘟病毒全長感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK6細(xì)胞，將細(xì)胞傳代后，收獲病毒，即得。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(3)中重疊PCR所用引物的序列為SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.6 所示。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(4)中所用豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆為pBRCISM。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(4)中用XhoI和AgeI雙酶切融合片段Fluc-Npn5和豬瘟病毒Shimen株全長感染性克隆。
7.權(quán)利要求1或2所述的重組豬瘟病毒在抗體效價(jià)測定中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1或2所述的重組豬瘟病毒在篩選豬瘟病毒抑制劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述的重組豬瘟病毒在高通量篩選抑制豬瘟病毒復(fù)制的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/70GK104017779SQ201410252648
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月9日
【發(fā)明者】仇華吉, 申梁, 李永鋒, 孫元, 李素, 羅玉子 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所