以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法，涉及甘露醇的制備方法，將榨得的甘蔗汁經(jīng)離心與過濾，添加紅糖獲得甘蔗汁-紅糖濾液，再經(jīng)冷滅菌制備得到的無菌的甘蔗汁-紅糖濾液作為培養(yǎng)基待用；將活化好的腸膜明串珠菌菌種以1%接菌量加入到無菌的甘蔗汁-紅糖濾液培養(yǎng)基中，再經(jīng)培養(yǎng)制得發(fā)酵液和分離純化制得甘露醇。本發(fā)明方法降低了培養(yǎng)基的成本，從而克服了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇的瓶頸問題。
【專利說明】以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的技術(shù)方案涉及甘露醇的制備方法，具體地說是以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甘露醇被廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工和電子等行業(yè)。全球甘露醇消費(fèi)量約占多元醇總量的11%，每年約為15萬噸。美國(guó)是甘露醇的最大消費(fèi)國(guó)。其它如歐洲國(guó)家，用于生產(chǎn)口香糖、口含片和嘴嚼片的用量均較大。我國(guó)目前甘露醇消費(fèi)主要是直接用于生產(chǎn)甘露醇注射液、藥品輔助添加劑和無糖型食品添加劑等。由于食品行業(yè)尤其是口香糖對(duì)甘露醇需求量快速增加，甘露醇市場(chǎng)容量迅速擴(kuò)大。甘露醇在醫(yī)藥行業(yè)用量較大，目前我國(guó)僅甘露醇注射液每年就要消耗甘露醇4500噸，2003年醫(yī)藥行業(yè)消費(fèi)甘露醇5600噸。近年來我國(guó)肥胖和糖尿病較為嚴(yán)重，而且有越來越嚴(yán)重的趨勢(shì)，因此對(duì)無糖并具有營(yíng)養(yǎng)的甜味劑甘露醇需求潛力巨大，2004年我國(guó)食品及其添加劑領(lǐng)域?qū)Ω事洞嫉男枨罅考s3000噸。
[0003]現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)甘露醇的方法主要有四種:
(1)海帶提取法:提取I噸甘露醇約需13-15噸干海帶，生產(chǎn)過程產(chǎn)生大量廢水，能耗高，污染嚴(yán)重，收率低；
(2)催化加氫法:以蔗糖或葡萄糖為原料的鎳(Ni)催化高溫高壓加氫具有原料來源穩(wěn)定，生產(chǎn)期限不受限制，成本低，但是其產(chǎn)率較低，且伴生的山梨醇不易分離； (3)酶轉(zhuǎn)化法:酶法氫化需要在體系中加入價(jià)格昂貴的輔酶(NADH)，不經(jīng)濟(jì)；
(4)微生物發(fā)酵法:自然界中能合成甘露醇的微生物種類較多，細(xì)菌、酵母和霉菌中都有一些菌株具有產(chǎn)甘露醇的能力。其中，用乳酸細(xì)菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘露醇，以甘露醇為主要產(chǎn)物，同時(shí)產(chǎn)乳酸、乙酸、乙醇和二氧化碳，而不產(chǎn)生其它多元醇等副產(chǎn)物，因而所得甘露醇產(chǎn)物易于分離純化及精制，并且工藝條件溫和，轉(zhuǎn)化率較高。同時(shí)乳酸細(xì)菌是美國(guó)FDA認(rèn)可的GRAS菌，是一種相對(duì)安全的菌種，因而用乳酸細(xì)菌來生產(chǎn)甘露醇的研發(fā)有著明顯的優(yōu)勢(shì)。乳酸細(xì)菌又分為同型乳酸發(fā)酵細(xì)菌和異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌，采用同型乳酸發(fā)酵細(xì)菌可以只能將葡萄糖經(jīng)6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、1-磷酸甘露醇等中間化合物轉(zhuǎn)化為甘露醇，并且產(chǎn)量低于異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌；采用異型乳酸發(fā)酵細(xì)菌中的明串珠菌則可以將果糖或蔗糖中的果糖部分直接轉(zhuǎn)化為甘露醇，例如，CN201310537851.5公開的以紅糖為碳源明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法和CN 201410065372.2披露的一株明串珠菌突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用方法，這些方法不但產(chǎn)量高于同型乳酸發(fā)酵細(xì)菌，而且因?yàn)槊鞔榫娜旧w基因組大小只有2Mb左右，故發(fā)酵周期短。然而CN201310537851.5和CN 201410065372.2仍然存在培養(yǎng)基成本較高的缺陷，這些缺陷成為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇的瓶頸問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法，是一種以甘蔗汁為原料的制備培養(yǎng)基和腸膜明串珠菌應(yīng)用該培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法，降低了培養(yǎng)基的成本，從而克服了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘露醇的瓶頸問題。
[0005]本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法，步驟如下:
第一步，以甘蔗汁-紅糖為原料制備培養(yǎng)基:
(1.1)準(zhǔn)備用具:
將夾有0.2 μ m濾膜的濾器A用牛皮紙包裝好，然后與封口的IOOmL三角瓶一起放入高壓滅菌鍋內(nèi)，于121°C滅菌20分鐘，準(zhǔn)備好滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A和滅菌的IOOmL二角瓶；
(1.2)榨甘蔗汁:
稱取3350克甘蔗，去皮后切成條狀，放入果汁機(jī)中榨取甘蔗汁；
(1.3)甘蔗汁的離心與過濾:
取上一步(1.2)制得的1050mL甘蔗汁液用轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心30分鐘，取得甘蔗汁上清液A IOlOmL ;再把甘蔗汁上清液A用夾有0.2μπι濾膜的濾器B過濾而獲得甘鹿汁濾液B 1005mL ；
(1.4)添加紅糖獲得甘蔗汁-紅糖濾液:
往上述甘蔗汁濾液B 1005mL中加入紅糖2.5克并攪拌使其完全溶解，從而獲得甘蔗汁-紅糖濾液C ；
(1.5)冷滅菌:
在超凈工作臺(tái)的酒精燈附近將上述步驟(1.4)制得的甘蔗汁-紅糖濾液C用上述步驟
(1.1)準(zhǔn)備好的滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A過濾，制備得到無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 1000mL,在上述步驟(1.1)準(zhǔn)備好的滅菌的IOOmL三角瓶中加入剛制備得到的無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL后封口，作為下一步的培養(yǎng)基待用；
第二步，用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇:
(2.1)活化腸膜明串珠菌菌種:
將腸膜明串珠菌以1%接菌量加入到已經(jīng)置于50mL的三角瓶?jī)?nèi)的IOmLMRS培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12~16小時(shí)；
(2.2)接腸膜明串珠菌:
在超凈工作臺(tái)的酒精燈附近將上述步驟(2.1)活化好的腸膜明串珠菌菌種以1%接菌量加入到上述步驟(1.5)經(jīng)冷滅菌制得的置于IOOmL三角瓶?jī)?nèi)的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL中；
(2.3)培養(yǎng)制得發(fā)酵液:
將上述步驟(2.2)接腸膜明串珠菌后的三角瓶置于搖床中，在30°C下以120轉(zhuǎn)/分的速度振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，制得發(fā)酵液40mL ；
(2.4)分離純化:
將上述步驟(2.3)培養(yǎng)制得的發(fā)酵液40mL用轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心10分鐘，去除菌體沉淀得發(fā)酵上清液A 37mL ;在發(fā)酵上清液A 37mL中加入等量體積的乙醇，用轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心15分鐘，去除葡聚糖沉淀得發(fā)酵上清液B 74mL，將發(fā)酵上清液B 74mL在4°C結(jié)晶即制得甘露醇1.16克。
[0006] 上述以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法，所用的腸膜明串珠菌的分類命名為腸膜明串珠菌，拉丁文學(xué)名是Leuconostoc mesenteroides,該微生物(株)已于2009年11月由保藏中心收到，并登記入冊(cè)，保藏日期為2009年12月31日，保藏單位全稱是中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏編號(hào)=CGMCCl.10327。中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心于2013年09月12日發(fā)出存活性報(bào)告書。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的顯著進(jìn)步如下:
(I)本發(fā)明是屬于用乳酸細(xì)菌來生產(chǎn)甘露醇的方法，與現(xiàn)有的海藻提取法、催化加氫法和酶轉(zhuǎn)化法相比，不僅能耗低和收率高，更主要的是生產(chǎn)過程中沒有污染，是環(huán)境友好的，符合產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向。
[0008](2)與現(xiàn)有技術(shù)CN20131053785L 5、CN 201410065372.2和其它現(xiàn)有技術(shù)相比，本
發(fā)明方法的培養(yǎng)基的成本大幅度降低。下表列出了本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基的成本對(duì)比，可見本發(fā)明方法的經(jīng)濟(jì)效益十分突出。
【權(quán)利要求】
1.以甘蔗汁為原料用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的方法，其特征在于步驟如下: 第一步，以甘蔗汁-紅糖為原料制備培養(yǎng)基: (1.1)準(zhǔn)備用具: 將夾有0.2 μ m濾膜的濾器A用牛皮紙包裝好，然后與封口的IOOmL三角瓶一起放入高壓滅菌鍋內(nèi)，于121°C滅菌20分鐘，準(zhǔn)備好滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A和滅菌的IOOmL二角瓶； (1.2)榨甘蔗汁: 稱取3350克甘蔗，去皮后切成條狀，放入果汁機(jī)中榨取甘蔗汁； (1.3)甘蔗汁的離心與過濾: 取上一步(1.2)制得的1050mL甘蔗汁液用轉(zhuǎn)速為13000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心30分鐘，取得甘蔗汁上清液A IOlOmL ;再把甘蔗汁上清液A用夾有0.2μπι濾膜的濾器B過濾而獲得甘鹿汁濾液B 1005mL ； (1.4)添加紅糖獲得甘蔗汁-紅糖濾液: 往上述甘蔗汁濾液B 1005mL中加入紅糖2.5克并攪拌使其完全溶解，從而獲得甘蔗汁-紅糖濾液C ； (1.5)冷滅菌: 在超凈工作臺(tái)的酒精燈附近將上述步驟(1.4)制得的甘蔗汁-紅糖濾液C用上述步驟(1.1)準(zhǔn)備好的滅菌的夾有0.2 μ m濾膜的濾器A過濾，制備得到無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 1000mL,在上述步驟(1.1)準(zhǔn)備好的滅菌的IOOmL三角瓶中加入剛制備得到的無菌的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL后封口，作為下一步的培養(yǎng)基待用； 第二步，用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇: (2.1)活化腸膜明串珠菌菌種: 將腸膜明串珠菌以1%接菌量加入到已經(jīng)置于50mL的三角瓶?jī)?nèi)的IOmLMRS培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12~16小時(shí)； (2.2)接腸膜明串珠菌: 在超凈工作臺(tái)的酒精燈附近將上述步驟(2.1)活化好的腸膜明串珠菌菌種以1%接菌量加入到上述步驟(1.5)經(jīng)冷滅菌制得的置于IOOmL三角瓶?jī)?nèi)的甘蔗汁-紅糖濾液D 40mL中； (2.3)培養(yǎng)制得發(fā)酵液: 將上述步驟(2.2)接腸膜明串珠菌后的三角瓶置于搖床中，在30°C下以120轉(zhuǎn)/分的速度振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，制得發(fā)酵液40mL ； (2.4)分離純化: 將上述步驟(2.3)培養(yǎng)制得的發(fā)酵液40mL用轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心10分鐘，去除菌體沉淀得發(fā)酵上清液A 37mL ;在發(fā)酵上清液A 37mL中加入等量體積的乙醇，用轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心15分鐘，去除葡聚糖沉淀得發(fā)酵上清液B 74mL，將發(fā)酵上清液B 74mL在4°C結(jié)晶即制得甘露醇1.16克。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104017831SQ201410254455
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】金紅星, 成文玉, 李海超 申請(qǐng)人:河北工業(yè)大學(xué)