一種煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4及其克隆方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4及其克隆方法與應(yīng)用，煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4核苷酸序列如SEQID：No.1所示，編碼的氨基酸序列如SEQID：No.2所示。本發(fā)明還公開了煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法，具體步驟包括：A、確定NtHMA4基因序列；B、提取煙草RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；C、根據(jù)NtHMA4基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；D、回收和純化PCR產(chǎn)物；E、純化產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴(kuò)增、測序。通過調(diào)控?zé)煵萱k轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的表達(dá)，可降低鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片的轉(zhuǎn)運(yùn)率，從而降低煙葉的鉻含量，為生產(chǎn)綠色優(yōu)質(zhì)煙葉提供了基因資源。
【專利說明】—種煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4及其克隆方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4及其克隆方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草(AYcoiiaaa iaAacw?)是重要的經(jīng)濟(jì)作物,是爺科一年生草本植物。煙草屬大約有60多種。重金屬鎘是煙草生長的非必須元素，但容易被吸收，并且通過食物鏈對人體產(chǎn)生危害。鎘隨水灌溉和污泥進(jìn)入土壤中，被土壤吸附的鎘一般在(Tl5cm的表層土壤中積累。土壤中過量的鎘，不僅能在煙草體內(nèi)殘留，而且也會對煙草的生長發(fā)育起明顯的危害作用，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量，葉片發(fā)黃，光合過程的減弱，生長緩慢，植株矮小，根系受到抑制，生長受阻，產(chǎn)量下降。鎘污染對煙草種子出苗、煙草光合特性、煙草體內(nèi)礦質(zhì)元素含量、煙草組織結(jié)構(gòu)、煙草酶活性、煙草生長量和煙葉品質(zhì)均有較大影響。
[0003]Cd2+的吸收主要是通過一些對Cd2+具有低親和性的多底物金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或通道蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)。例如，小麥的LCTI蛋白在釀酒酵母中表達(dá)能夠介導(dǎo)Cd2+流入細(xì)胞內(nèi)，并使酵母細(xì)胞對Cd2+高度敏感，這種Cd2+高度敏感性可能是由于LCTI蛋白對Cd2+吸收所造成的。另外，金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Nramp家族也具有能夠?qū)d2+轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞內(nèi)的功能。釀酒酵母Nramp家族成員SMFl和SMF2蛋白不但能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Mn2+而且能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Cu2+、Co2+和Cd2+。目前研究表明，鎘元素從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)是借助于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行的，例如Pib型ATPase亞家族成員HMA。HMA蛋白家族可以根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)功能分為兩類，即Cu/Ag轉(zhuǎn)運(yùn)泵和Zn/Cd/Co/Pb轉(zhuǎn)運(yùn)泵。AtHMA4擬南芥中克隆的第一個編碼HMA的基因，該基因參與Zn2+的和Cd2+從根部向地上部 的轉(zhuǎn)運(yùn)。過表達(dá)AtHMA4不僅提高植物對Zn2+和Cd2+的耐性，而且增加上述金屬從根向地上部的轉(zhuǎn)移率?？梢夾tHMA4具有從根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。
[0004]國際上一些知名煙草公司和研究機(jī)構(gòu)正采用生物技術(shù)和基因工程技術(shù)對煙草品種進(jìn)行改良，以提高煙草對鎘的抗性，減少煙草對土壤鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。我國也提出了無公害優(yōu)質(zhì)煙的開發(fā)計(jì)劃，為煙草重金屬危害的研究提供了新的契機(jī)。隨著煙草鎘污染研究的深入，必將使我國煙草鎘污染控制邁上了新的臺階，為我國煙葉的健康和可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。因此，開發(fā)一種利用生物技術(shù)手段降低煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)率(葉片鎘含量/根鎘含量)的候選基因，通過基因操作減少煙葉鎘含量是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一目的在于提供一種煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4 ;本發(fā)明的第二目的在于提供所述煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法；本發(fā)明的第三目的在于提供所述煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4核苷酸序列為SEQ ID:N0.1 所示。
[0007]本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法包括以下步驟:
A、確定NtHMA4基因序列；
B、提取煙草RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；
C、根據(jù)NtHMA4基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
D、回收和純化PCR產(chǎn)物；
E、純化產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴(kuò)增、測序。
[0008]本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4用于降低鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到煙葉的轉(zhuǎn)運(yùn)率。 [0009]本發(fā)明利用RACE技術(shù)從煙草中得到一個煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4，具體步驟為:以煙草基因組數(shù)據(jù)庫(行業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫)基因Ntom0672570為核心序列設(shè)計(jì)RACE引物，3 ^ RACE基因特異引物為AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5 ' RACE基因特異引物為CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA。克隆基因末端 RACE 試劑盒為 Clontech Smart RACE cDNAAmplification Kit,反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。3'端擴(kuò)增到600bp左右的片段,5'端擴(kuò)增到500bp左右的片段?；厥蘸筮M(jìn)行測序，并與核心序列拼接獲得NtHMA4全長cDNA。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得NtHMM基因的過表達(dá)和RNAi植株，對NtHMM進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明NtHMA4基因具有將鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片的功能。NtHMA4基因的發(fā)現(xiàn)，為通過調(diào)控基因的表達(dá)，控制煙葉重金屬鎘含量，為生產(chǎn)綠色優(yōu)質(zhì)煙葉提供了基因資源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為利用引物對NtHMA4F/NtHMA4R擴(kuò)增基因結(jié)果,擴(kuò)增產(chǎn)物4377bp ；
圖2為pB 1121 -NtHMM載體PCR鑒定，所用引物對為NtHMA4F/NtHMA4R，擴(kuò)增產(chǎn)物為
4377bp ；
圖3為pBI121-NtHMA4載體測序驗(yàn)證，灰色部分為過表達(dá)載體中部分基因序列斜體部分為載體序列；
圖4為基因RNAi載體片段PCR擴(kuò)增結(jié)果，所用引物對為HMARNAiF/HMARNAiR，擴(kuò)增產(chǎn)物為369bp ；
圖5為RNAi載體pBI121-pQL1-NtHMA4的酶切驗(yàn)證，XbalI和SacI雙酶切后可以將1500bp左右的反向重復(fù)單元切下；
圖6為Ntmmmki煙草植株鎘轉(zhuǎn)移率，Vector Control為轉(zhuǎn)空載體對照，其余為轉(zhuǎn)基因植株；
圖?為NtHMM過表達(dá)煙草植株鎘轉(zhuǎn)移率，Vector Control為轉(zhuǎn)空載體對照，其余為轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012]本發(fā)明所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4核苷酸序列為SEQ ID:N0.1所示，編碼的氨基酸序列為SEQ ID:N0.2所不。[0013]所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4來源于絨毛狀煙草。
[0014]本發(fā)明所述所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法，包括以下步驟:
A、確定NtHMA4基因序列；
B、提取煙草RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；
C、根據(jù)NtHMA4基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
D、回收和純化PCR產(chǎn)物；
E、純化產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴(kuò)增、測序。
[0015]所述的步驟A包括如下步驟:(I)利用同源基因擬南芥At HMA4序列搜索NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtHMM的EST序列(NCBI號:FG135138.1)；
(2)利用FG135138.1比對煙草基因組數(shù)據(jù)庫(行業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫)，獲得一個基因序列(Ntom0672570)，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)RACE引物，克隆基因末端RACE試劑盒為Clontech SmartRACE cDNA Amplification Kit，反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。3'端擴(kuò)增到50(T700bp的片段，5'端擴(kuò)增到40(T600bp的片段。回收后進(jìn)行測序；(3)測序結(jié)果與核心序列拼接獲得NtHMA4全長cDNA。其序列如SEQ ID N0.1所示。其中，步驟(2)所述的RACE引物為:
3' RACE 基因特異引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'；
5' RACE 基因特異引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3'。
[0016]所述步驟C的特異性引物為:
正向引物:NtHMA4F:5/ - CTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3'；
反向引物:NtHMA4R:5/ - CTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3'。
[0017]本發(fā)明所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的應(yīng)用，其特征在于所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4用于制備降低煙葉鎘含量的轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
[0018]所述煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的應(yīng)用，主要通過調(diào)控該基因的表達(dá)，降低鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到煙葉的轉(zhuǎn)運(yùn)率，從而降低煙葉中重金屬鎘的含量。降低鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到煙葉的轉(zhuǎn)運(yùn)率的方法包括如下步驟:
A、構(gòu)建RNAi載體；
B、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化；
C、RNAi載體導(dǎo)入煙草；
D、培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株。
[0019]本發(fā)明的工作原理為利用RACE技術(shù)從煙草中得到一個煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4序列，具體步驟為:以煙草基因組數(shù)據(jù)庫(行業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫)基因Ntom0672570為核心序列設(shè)計(jì)RACE引物，3' RACE基因特異引物為AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5' RACE基因特異引物為 CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA?？寺』蚰┒?RACE 試劑盒為 Clontech Smart RACE cDNAAmplification Kit,反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。3'端擴(kuò)增到600bp左右的片段,5'端擴(kuò)增到500bp左右的片段。回收后進(jìn)行測序，并與核心序列拼接獲得NtHMA4全長cDNA。再對基因NtHMA4進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得NtHMA4基因的過表達(dá)和RNAi植株，對NtHMM進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明NtHMM基因具有將鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片的功能。理論上，可通過調(diào)控NtHMA4基因的表達(dá)，控制煙葉重金屬鎘含量，為生產(chǎn)綠色優(yōu)質(zhì)煙葉提供了基因資源。[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
1、基因的克隆，為降低煙葉鎘含量分子育種提供新的基因資源，該基因資源的開發(fā)利用有利于生產(chǎn)低鎘含量煙草和實(shí)現(xiàn)綠色優(yōu)質(zhì)煙葉的開發(fā)。
[0021]2、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得該基因過表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)生物學(xué)功能驗(yàn)證，表明本發(fā)明克隆的基因具有將鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片的功倉泛。
[0022]實(shí)施例1——NtHMA4基因的分離克隆
利用同源基因擬南芥At HMA4序列搜索NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtHMA4的EST序列得到煙草NtHMA4的EST序列(NCBI號:FG135138.1);利用FG135138.1比對煙草基因組數(shù)據(jù)庫(行業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫)，獲得一個基因序列(Ntom0672570);以此序列為核心序列通過RACE獲得基因全長，具體步驟為:以煙草基因組數(shù)據(jù)庫(行業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫)基因Ntom0672570為核心序列設(shè)計(jì)RACE引物，3' RACE基因特異引物為AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA，5' RACE 基因特異引物為 CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA?？寺』蚰┒薘ACE試劑盒為Clontech Smart RACE cDNA Amplification Kit,反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。3'端擴(kuò)增到600bp左右的片段，5'端擴(kuò)增到500bp左右的片段?；厥蘸筮M(jìn)行測序，并與核心序列拼接獲得NtHMM全長cDNA。根據(jù)全長cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物克隆基因全長。
[0023]對目的產(chǎn)物測序，得到新基因NtHMA4，其核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，其中131~4342 bp為該基因的編碼區(qū)，包含4212bp的開放閱讀框；編碼1404個氨基酸，如序列表 SEQIDN0.2 所示。
[0024]提取煙草根部RNA,抽提使用Trizol試劑盒(Invitrogen,按該試劑盒提供的說明書操作)。
[0025]取2 μ g RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用 PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)試劑盒進(jìn)行基因組DNA去除并反轉(zhuǎn)錄(按試劑盒操作手冊操作)。
[0026]將反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA作為模板，用于PCR擴(kuò)增NtHMA4基因全長，并設(shè)計(jì)特性行引物如下:
正向引物:NtHMA4F:5/ - CTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3/ ；
反向引物:NtHMMR:5/ - CTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3'
PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L,包括:200ng cDNA, I XPhusion HF 反應(yīng)緩沖液，IOmM dNTP, 2U 的Phusion? High-Fidelity DNA Polymerase,上述引物各 I μ M。PCR 反應(yīng)在 Mastercycler?pro (Eppendorf，德國)擴(kuò)增儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?98°C，30秒；98°C，10秒，60°C，20秒，72°C，2分鐘，40個循環(huán)；72°C延伸7分鐘。
[0027]產(chǎn)物經(jīng)1% (g/mL)的瓊脂糖凝膠電泳分離，擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生一條單一 PCR條帶，見圖1。用QIAquickGel Extraction Kit (QIAGEN,德國)回收擴(kuò)增條帶,提取步驟參照試劑盒使用說明。回收純化的 DNA 與 Τ0Ρ0 載體(Invitrogen ZERO Blunt T0P0 RCR Cloning kit)連接，按說明書操作。連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，在含有50mg/L卡那霉素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取5個克隆測序(大連寶生物工程有限公司)。測序結(jié)果表明
基因的全長為4377bp，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示，通過測序、比對確定是本發(fā)明需要的目的基因， 申請人:將該基因命名為#_1基因包括4335bp的開放閱讀框；編碼1445個氨基酸。推導(dǎo)的基因的氨基酸序列與擬南芥具有53%的相似性。
[0028]實(shí)施例2——植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
(I)過表達(dá)載體構(gòu)建。根據(jù)ρΒΙ121載體序列酶切位點(diǎn),利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)出構(gòu)建基因過表達(dá)的引物對，其序列如下所示:
正向引物:5, - GGGTGGATCCCTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3'；
反向引物:5' - TAATGAGCTCCTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3'。
[0029]下劃線所示為酶切位點(diǎn)。
[0030]以基因陽性克隆DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系激擴(kuò)增程序同實(shí)例I。雙酶切體系:反應(yīng)總體積為40 μ L，含PCR純化后的產(chǎn)物10 μ L，10ΧΝΕΒ Bufferl.14 μ L7BamHI和SacI各2 μ L，滅菌雙蒸水22 μ L。37°C酶切過夜后純化。pBI121載體的雙酶切體系:反應(yīng)總體積為40μ L，含純化的ρΒΙ121質(zhì)粒DNA 10 μ L, 10ΧΝΕΒ Bufferl.1 4μ L，BamHI和SacI各2 μ L，滅菌雙蒸水22 μ L。37°C酶切過夜后純化。
[0031]連接反應(yīng)體系中基因與pBI121載體的摩爾比為5:1，反應(yīng)總體積為10 μ L，其中:10Χ連接Buffer I μ L，T4 DNA連接酶I μ L，財挪^基因雙酶切片段6 μ L，PBI121載體雙酶切片段2 μ L。16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌種DH5 α。
[0032]在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后進(jìn)行PCR(圖2)及酶切鑒定(圖3)， 即pBI121-NtHMA4載體測序驗(yàn)證，抓77077707776似似6^以《?ggg^^TM^GGATCCCTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGAGGAAAAATAGAAAGAAGAGAMATGGTGGAAAGTGAGAAAATGAATGACACAAAGAATCTGAGCAAGAGCTATTTTGATGTTTTGGGAATTTGCTGTA ,其中下劃線部分為過表達(dá)載體中部分基因序列斜體部分為載體序列。構(gòu)建的載體命名為pBI121-NtHMA4。
[0033](2)抑制表達(dá)(RNAi)載體構(gòu)建
以pQLi載體為中間載體，PBI121為表達(dá)載體構(gòu)建基因的RNAi載體，構(gòu)建引物
為:
HMARNAiF:CATTCTAGAGAGCTCGGATCCGAATCAAGCAAGATTAGAAGCA
HMARNAiR: TCAACTAGTGATATCCTCGAGAGTGATGACATAGCAGCAGT
HMARNAiF中下劃線分別為Xbal，SacI, BamHI酶切位點(diǎn)；HMARNAiR中下劃線分別為SpeI，EcoRV酶切位點(diǎn)。
[0034]以基因陽性克隆DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(結(jié)果見圖4)。PCR擴(kuò)增體系激擴(kuò)增程序同實(shí)例I。NtHMA4基因RNAi正向片段與pQLi載體連接:利用BamHI和EcoRV分別雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和pQLi載體，反應(yīng)體系同過表達(dá)載體的構(gòu)建。酶切后回進(jìn)行回收純化并進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系中RNAi正向片段和pQLi的摩爾比為5:1，反應(yīng)程序同過表達(dá)載體構(gòu)建部分。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌種DH5 α后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。
基因RNAi反向片段與連接有正向片段的pQLi載體連接=SacI和SpeI分別雙酶切RNAi反向片段與連接有正向片段的PQLi載體，酶切后回收純化并進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子抽提后進(jìn)行酶切驗(yàn)證。構(gòu)建的中間載體命名為pQL1-HMA4。
[0035]利用XbaI和SacI分別雙酶切pBI121和pQLi_HMA4載體，回收pBI121大片段和pQL1-ΗΜΜ載體酶切后1000bp左右的片段，進(jìn)行連接。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證(圖5)，程序同上。構(gòu)建的載體命名為pBI121-pQL1-NtHMA4。[0036]實(shí)施例3——煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
(I)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
利用凍融法(參照薩姆布魯克，拉塞爾著，黃培堂等譯，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，科學(xué)出版社，2002年)將重組載體pBI121-NtHMA4和pBI121-pQL1-NtHMA4轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌軍中GV3101。
[0037]從-80°C冰箱中取出3管農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上溶解，分別加入重組表達(dá)載體pBI121-NtHMA4、pBI121-pQL1-NtHMA4 和 pBI121 空載體。
[0038]將以上混合物放入液氮速凍I分鐘，轉(zhuǎn)入37°C水浴5分鐘。
[0039]相混合物中加入ImL LB培養(yǎng)基，28°C，220rpm培養(yǎng)3~4小時。
[0040]培養(yǎng)物涂布于含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)2~3天?？梢姾心康妮d體的克隆。
[0041](2)煙草轉(zhuǎn)化
挑取含有目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌在含有卡那霉素和利福平的LB平板上劃線，28 °C培養(yǎng)2~3天。
[0042]刮取劃線菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的MS培養(yǎng)基中，28°C，220rpm震蕩培養(yǎng)，菌液濃度達(dá)到OD= 0.5~0.8時進(jìn)行侵染。
[0043]將菌體收集到離心管中，6，OOOrpm離心分鐘富集菌體，棄上清，再用約20ml液體
MS培養(yǎng)基重懸菌體。
[0044]將葉片置于500mL廣口瓶中，加入適量70%乙醇，漂洗lmin。；倒掉乙醇，加入
0.1% HgCl2溶液(稱取升汞0.1克，用少許酒精溶解，再加水至100毫升)，置搖床上室溫振蕩15~30分鐘；倒掉溶液，用無菌水沖洗6遍；將葉片取出，用滅菌吸水紙洗去表面液體，取無菌葉片用剪刀切成IcmXlcm的小片，將切成小片的植物葉片放入無菌MS液體培養(yǎng)基懸浮的菌液中，靜置15~20min。
[0045]取出材料，用無菌濾紙吸去多余菌液，于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中(MS+6-BA 1.0mg/L + NAA0.lmg/L )，25°C暗培養(yǎng)兩天。
[0046]把材料轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Kan 200mg/L + Carb(羧芐青霉素鈉)500mg/L),切口接觸培養(yǎng)基，于溫室中分化培養(yǎng)，每2-3周將其轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中。切口處逐漸長出愈傷組織，最后分化出芽。
[0047]將長至3~5cm的芽切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS)誘導(dǎo)生根。
[0048]生根后的轉(zhuǎn)基因植株由生根培養(yǎng)基中取出，用自來水凈培養(yǎng)基，移植于滅菌的營養(yǎng)土中。
[0049]轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)NPTII基因特異引物PCR驗(yàn)證擴(kuò)增，鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。
[0050]實(shí)施例4——轉(zhuǎn)基因植株鎘吸收試驗(yàn)
轉(zhuǎn)基因植株移栽到一次性花盆后，置于育苗池中，育苗池內(nèi)IOcm左右含的水(含4ppm氯化鎘)。
[0051]生長30天后，取轉(zhuǎn)基因植株葉片和根，60°C烘干，測定鎘含量，計(jì)算轉(zhuǎn)基因植株鎘轉(zhuǎn)移率(葉片鎘含量/根鎘含量)，結(jié)果見圖6、圖7。!?應(yīng)1植株NtHMARNA1-6、NtHMARNA1-41、NtHMA RNA1-43鎘轉(zhuǎn)移率比空載體對照Vector Control降低50%以上。NtHMA4過表達(dá)植株NtHMA40E-2、NtHMA40E-9、NtHMA40E-22 鎘轉(zhuǎn)移率比空載體對照 Vector Control 提高 2 倍以上。上述結(jié)果表明，基因負(fù)責(zé)煙草鎘從根部向葉片的運(yùn)輸。通過對該基因的遺傳操作，可 以降低煙草葉片鎘含量。
【權(quán)利要求】
1.一種煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMM，其特征在于所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMM核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4，其特征在于所述基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID:N0.2所示。
3.一種權(quán)利要求1所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于包括以下步驟: A、確定NtHMA4基因序列； B、提取煙草RNA，反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA； C、根據(jù)NtHMA4基因序列設(shè)計(jì)合成特異性引物，以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； D、回收和純化PCR產(chǎn)物； E、純化產(chǎn)物與載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞； F、篩選陽性克隆，對陽性克隆PCR擴(kuò)增、測序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于所述的步驟A包括如下步驟: (1)利用同源基因擬南 芥AtHMA4序列搜索NCBI煙草EST數(shù)據(jù)庫，得到煙草NtHMA4的EST序列； (2)利用FG135138.1比對煙草基因組數(shù)據(jù)庫，獲得一個基因序列(Ntom0672570)，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)RACE引物，克隆基因末端RACE試劑盒為Clontech Smart RACE cDNAAmplification KU，反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，3'端擴(kuò)增到50(T700bp左右的片段，5'端擴(kuò)增到40(T600bp左右的片段，回收后進(jìn)行測序； (3)測序結(jié)果與核心序列拼接獲得NtHMM全長cDNA，其序列如SEQID N0.1所示； (4)利用特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對目的產(chǎn)物測序，得到NtHMA4基因序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于步驟(2)所述的RACE特異性引物為: 3' RACE 基因特異引物:5' -AGAAACTGCTCATTGTGACAGCACA-3'； 5' RACE 基因特異引物:5' -CAACTGCAACAGCTGCAAGTGCTA-3'。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的克隆方法，其特征在于步驟C所述的特異性引物為: 正向引物:NtHMA4F:5/ - CTTCCTTAGAGTAGAGTGTAGA -3'； 反向引物:NtHMA4R:5/ - CTACTCTATGACAATTTCTGATAA -3'。
7.—種權(quán)利要求1所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的應(yīng)用，其特征在于用于降低鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到煙葉的轉(zhuǎn)運(yùn)率。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的應(yīng)用，其特征在于所述的降低鎘從煙草根部轉(zhuǎn)運(yùn)到煙葉的轉(zhuǎn)運(yùn)率的方法包括如下步驟: A、構(gòu)建RNAi載體； B、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化； C、RNAi載體導(dǎo)入煙草； D、培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的煙草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtHMA4的應(yīng)用，其特征在于步驟A中所述的RNAi 載體 為 pBI121-pQL1-NtHMA4。
【文檔編號】C12N15/29GK104004770SQ201410254652
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月10日
【發(fā)明者】李文正, 王丙武, 高玉龍, 宋中邦, 曾建敏, 張家瑞, 孔光輝, 李永平 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院