一種具有抗菌活性的葎草有效部位及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葎草有效部位及其抗菌活性和在制備抗菌藥物中的用途。以葎草全草為原料，用水或5％-100％的醇提取，經初步處理后，再通過大孔樹脂-聚酰胺樹脂聯用技術或硅膠柱層析方法得到葎草有效部位，主要為黃酮類化合物，總黃酮含量為20％-90％，其組成以芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等為主。該有效部位具有顯著地抗菌活性，尤其對臨床耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、大腸屎球菌和大腸糞球菌顯示了較強的抑菌活性；其可作為藥物原料，制成抗菌藥物片劑、膠囊等，尤其是制備成治療細菌感染引起的腹瀉、腸胃炎及腎盂腎炎、急性腎炎等泌尿系統(tǒng)疾病的藥物和具有助消化、預防和保健功能的食品。
【專利說明】一種具有抗菌活性的蘀草有效部位及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥制劑領域，具體涉及一種潷草的有效部位黃酮類化合物，以及該有效部位的抗菌活性及其在制備抗菌藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]近年來，由于抗生素的濫用和細菌的進化，臨床上細菌感染耐藥問題愈發(fā)嚴重，作為抗生素生產和使用大國，耐藥感染性疾病已成為我國臨床感染性疾病死亡的主要因素。因此，研制低毒、有效的耐藥性抑制劑具有廣泛的應用價值和良好前景。研究發(fā)現某些中草藥具有廣譜抗菌作用、且可提高機體免疫力，所以由抗生素應用引起的耐藥性問題使國內外醫(yī)藥研發(fā)人員把注意力轉向具有抗菌活性的中草藥，中草藥抗菌活性成分與抗生素聯合用藥將大大降低病菌的耐藥性。為進一步充分發(fā)揮我國中草藥資源優(yōu)勢，尋找具有抗耐藥菌活性的中藥有效部位或成分解決耐藥菌感染問題無疑將是一條行之有效的途徑。
[0003]_草 Humulus scandens (Lour.)Merr.為?？?Moraceae) _ 草屬(Humulus)植物潷草的干燥全草，為一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全國各地均有分布，另外東北亞、北美洲也有分布。別名剌刺秧、降龍草、簕草、五爪龍、割人藤等，潷草味甘苦，性寒，歸腎、肺經，具有清熱解毒、利尿通淋的功效，始載于《唐本草》；內服用于肺結核潮熱、感冒發(fā)熱、痢疾、腸胃炎、腎盂腎炎、急性腎炎、膀胱炎、泌尿系結石等病癥；外用可治癰疽腫毒、濕疹、毒蛇咬傷等。該植物主要含有黃酮類、萜類、揮發(fā)油類、留體類等化合物?？v觀國內外報道，對潷草提取物及藥理活性的研究，多集中在潷草提取物對抗炎鎮(zhèn)痛、抗結核、抗氧化等方面的報道，目前鮮有對潷草有效部位抑制細菌生長的研究，尤其是沒有針對臨床耐藥菌抗菌活性的報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種潷草有效部位及其制備方法，該部位主要為具有一定含量的黃酮類化合物及其成分組成。
[0005]本發(fā)明的另一個目的在于提供潷草有效部位的抗菌活性，尤其是對臨床耐藥菌的抗菌活性。
[0006]本發(fā)明的進一步的目的在于提供潷草有效部位的制劑及其在治療細菌感染性引起的腹瀉、腸胃炎及腎盂腎炎、急性腎炎、膀胱炎等泌尿系統(tǒng)疾病的藥物聯合用藥方面的應用和制備助消化、預防和保健食品方面的應用。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下途徑實現的:
[0008]本發(fā)明提出的潷草有效部位系從潷草干燥全草中提取富集純化得到的，其制備工藝過程為:
[0009](I)提取:取潷草全草，采用水或5% -100%的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一種或幾種的混合物)提取，過濾，得提取液。
[0010] (2)初步處理:取步驟(1)中制得的提取液，減壓回收濃縮，加入適當乙醇使乙醇濃度達到50% -90%，靜置沉淀，過濾得濾液，減壓回收至濾液無醇味，得濾液A備用，或者取步驟(1)中制得的提取液，用石油醚萃取除去脂溶性成分，得濾液B備用。
[0011](3)粗制和精制:取步驟(2)中的濾液A或濾液B通過大孔樹脂吸附洗脫，洗脫劑采用水、10% -95%醇(乙醇或甲醇)進行梯度洗脫，分段收集10% -95%醇洗脫物，濃縮后得粗制物，取粗制物通過聚酰胺樹脂吸附洗脫，洗脫液采用水、20% -95%醇(乙醇或甲醇)進行梯度洗脫，分段收集20% -95%醇洗脫物，濃縮干燥后得潷草有效部位；或者取步驟
(2)中的濾液A或濾液B進行硅膠柱層析，洗脫劑采用體積比為50: 1-40: I的氯仿-甲醇混合液、20: 1-5: I的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為20:1-5:1的氯仿-甲醇洗脫液，濃縮干燥后得潷草有效部位。
[0012]本發(fā)明提出的潷草有效部位主要為黃酮類化學成分，其組成主要包括芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、牡荊素、蒙花苷及N-P-香豆酰酪胺等；上述潷草有效部位中黃酮類成分百分含量為20% -90%。
[0013]本發(fā)明提出的潷草有效部位具有顯著地抗菌活性，體外抗菌試驗證實其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(含耐藥金黃色葡萄球菌)、表皮葡萄球菌(含耐藥表皮葡萄球菌)、肺炎克雷伯桿菌、大腸屎球菌、大腸糞球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等均具有較明顯的抑菌活性，尤其對臨床耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、大腸屎球菌、大腸糞球菌顯示了較強的抑菌活性。
[0014]本發(fā)明提出的潷草有效部位可作為藥物原料，進一步制成抗菌藥物片劑、膠囊等，尤其是制備成治療細菌感染性引起的腹瀉、腸胃炎及腎盂腎炎、急性腎炎、膀胱炎等泌尿系統(tǒng)疾病的藥物和具有助消化、預防和保健功能的食品。
[0015]本發(fā)明采用在我國廣泛分布、具有較強生命繁殖能力的潷草作為原料制備抗菌活性有效部位，藥材來源極為豐富，通過對潷草資源的有效利用，將有助于推進對潷草植物侵略擴張的防控，具有潛在的經濟和生態(tài)效益。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實例對本發(fā)明進行詳細說明，但不局限于所列舉的實例。
[0017]實施例1
[0018](I)提取和初步處理:取潷草全草，采用5% -100%的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一種或幾種的混合物)約8倍量，在70°C下回流提取2h，反復2次，得潷草提取液；取潷草提取液減壓回收濃縮，加入適當乙醇使乙醇濃度達到50% -90%，靜置沉淀，過濾得濾液，減壓回收至濾液無醇味，得濾液；或者取潷草提取液，用石油醚萃取除去脂溶性成分，得濾液。
[0019](2)粗制和精制:將步驟(1)中的濾液采用大孔樹脂吸附洗脫，洗脫劑采用0-30%稀醇(甲醇或乙醇)溶液洗脫進行除雜，用40% -90%醇(甲醇或乙醇)溶液進行洗脫，收集40% -90%醇洗脫液，減壓回收濃縮干燥得粗制物；取大孔樹脂粗制物以水或稀醇溶解通過聚酰胺樹脂吸附洗脫，洗脫劑采用0-20%醇(甲醇或乙醇)溶液洗脫進行除雜，用30% -90%醇(甲醇或乙醇)溶液進行洗脫，收集30% -90%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮干燥得潷草有效部位1，其總黃酮含量為20% -80%，主要為芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-0- β -D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等。[0020]實施例2
[0021](I)提取和初步處理:取潷草全草，采用5% -100%的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一種或幾種的混合物)約8倍量，在70°C下回流提取2h，反復2次，得潷草提取液；取潷草提取液減壓回收濃縮，加入適當乙醇使乙醇濃度達到50% -90%，靜置沉淀，過濾得濾液，減壓回收至濾液無醇味，得濾液，或者取潷草提取液，用石油醚萃取除去脂溶性成分，得濾液，將上述所得濾液濃縮干燥得粗提物。
[0022](2)精制:將步驟(1)中制得的粗提物進行硅膠柱層析，洗脫劑采用體積比為50: 1-40: I的氯仿-甲醇混合液進行洗脫除雜，再用體積比20: 1-5: I的氯仿-甲醇混合液進行梯度洗脫，收集體積比為20: 1-5: I的氯仿-甲醇洗脫液，濃縮干燥后得潷草有效部位2，其總黃酮含量為30%-80%,主要為芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等。
[0023]實施例3
[0024]對實施例1和實施例2所得的潷草有效部位進行單體化合物的分離，經反復硅膠柱層析、MCI柱色譜、葡聚糖凝膠Sephadex-LH20 (CHCl3-MeOH =1:1, MeOH)柱層析、ODS反相柱色譜和重結晶等分離方法，從中分離得到芹菜素、木犀草素、牡荊素、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、蒙花苷和N-P-香豆酰酪胺等單體化合物，其中以芹菜素、木犀草素、牡荊素、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等黃酮類化合物為主。
[0025]實施例4
[0026]取實施例1、實施例2中制備的潷草有效部位及實施例3中分離得到的主要黃酮類化合物芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷和大波斯菊苷等進行抗菌活性試驗。
[0027](I)實驗用藥:潷草有效部位I (A1)、潷草有效部位2 (A2)、芹菜素(A3)、木犀草素(A4)、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷(A5)和大波斯菊苷(A6)，陽性對照藥:阿莫西林原料藥(阿)
[0028](2)實驗菌種:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、肺炎克雷伯桿菌、大腸屎球菌、大腸糞球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌
[0029](3)實驗方法用試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC):
[0030]以阿莫西林為陽性對照，用DMSO-H2O混合溶劑溶解實驗用藥，配制實驗用藥初始濃度為20mg/mL，再按試管二倍稀釋，用液體瓊脂稀釋獲得各實驗濃度為2000、1000、500、250,125,62.5,31.25,15.625μ g/mL。同法配制陽性對照藥物阿莫西林實驗濃度為256、128、64、32、16、8、4、2μ g/mL，并以DMSO-H2O混合溶劑為空白對照，接入試驗菌種后于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察得到最低抑菌濃度(MIC)。如表1所示:
[0031] 表1潷草有效部位及單體化合物對10種細菌的最低抑菌濃度(MIC，μ g/mL)
[0032]
【權利要求】
1.一種潷草的有效部位，其特征在于系從潷草全草通過下述方法制備獲得: (1)提取:取潷草全草，采用水或5%-100%的醇(甲醇、乙醇、正丁醇中的的任意一種或幾種的混合物)提取，過濾，得提取液。 (2)初步處理:取步驟(1)中制得的提取液，回收濃縮，醇沉濃度50%-90%，靜置沉淀，過濾得濾液，回收至濾液無醇味，得濾液A備用，或者取步驟(1)中制得的提取液，用石油醚萃取除雜，得濾液B備用。(3)粗制和精制:取步驟(2)中的濾液A或濾液B通過大孔樹脂洗脫，洗脫劑采用水、10%-95%醇(乙醇或甲醇)梯度洗脫，分段收集10%-95%醇洗脫物，濃縮得粗制物，粗制物通過聚酰胺樹脂洗脫，洗脫液采用水、20% -95%醇(乙醇或甲醇)梯度洗脫，分段收集20% -95%醇洗脫物，濃縮干燥得潷草有效部位；或取步驟(2)中的濾液A或濾液B進行硅膠柱層析，洗脫劑采用體積比為50: 1-40: I的氯仿-甲醇混合液洗脫除雜，再以20: 1-5: I的氯仿-甲醇混合液梯度洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥得潷草有效部位。
2.如權利要求1所述的潷草有效部位，其特征在于該有效部位主要為黃酮類化合物，其總黃酮含量為20%-90%,其組成主要包括芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-0-β -D-葡萄糖苷、大波斯菊苷、牡荊素、蒙花苷及N-P-香豆酰酪胺等。
3.如權利要求1所述的潷草有效部位，其特征在于該有效部位具有顯著地抗菌活性，尤其對大腸桿菌、大腸屎球菌、大腸糞球菌具有較強的抗菌活性，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌顯示了較明顯的抑制耐藥菌活性。
4.如權利要求1所述的潷草有效部位的應用，其特征在于該有效部位在治療細菌感染性引起的腹瀉、腸胃炎 及腎盂腎炎、急性腎炎、膀胱炎等泌尿系統(tǒng)疾病的藥物聯合用藥方面的應用和制備助消化、預防和保健食品方面的應用。
5.如權利要求1所述的潷草有效部位在中藥制劑中的應用，其特征在于該有效部位可加入藥物輔料制成片劑、膠囊劑、口服液等劑型。
【文檔編號】A23L1/29GK104000881SQ201410258812
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權日:2014年6月12日
【發(fā)明者】蔣建勤, 徐保磊, 陽文波 申請人:中國藥科大學