一種清真肉類食品的分子鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種清真肉類食品的分子鑒定方法，該清真肉類食品的分子鑒定方法包括：取將待檢測樣品25mg，使用通用型柱式基因組提取試劑盒提取基因組DNA，操作步驟中Proteinase?K消化時，采取過夜處理，消化時間10個小時以上；使用設(shè)計的引物16SA-SB-ZNYF和16SA-SB-ZNYR，對提取的DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序94度4min，94度30s，53度30s，72度1.5min，72度10分鐘；然后將擴增產(chǎn)物，交生物測序公司使用3730測序儀測序；將測序產(chǎn)物與給出的序列聯(lián)合，使用Clustalx軟件進行比對，并構(gòu)建NJ樹，鑒定是否有豬肉狗肉和驢肉的非清真成分存在。本發(fā)明針對豬肉新設(shè)計了專用擴增引物，可以高效率擴增豬肉DNA，即使食品中含有微量豬肉、狗肉或驢肉DNA也可以被識別，可以準確區(qū)分出豬肉、狗肉或驢肉成分。
【專利說明】一種清真肉類食品的分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種清真肉類食品的分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有檢測技術(shù)的步驟較多，操作程序較為繁瑣，對食品中含有微量豬肉檢測的力度沒有保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明實施例的目的在于提供一種清真肉類食品的分子鑒定方法，旨在解決現(xiàn)有檢測技術(shù)的步驟較多，操作程序較為繁瑣，對食品中含有微量豬肉檢測的力度沒有保證的問題。
[0004]本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種清真肉類食品的分子鑒定方法，該清真肉類食品的分子鑒定方法包括以下步驟:
[0005]第一步，取將待檢測樣品25mg，使用通用型柱式基因組提取試劑盒提取基因組DNA，操作步驟中Proteinase K消化時，采取過夜處理，消化時間10個小時以上；
[0006]第二步，使用設(shè)計的引物16 SA-SB-ZNYF和16SA-SB-ZNYR，對提取的DNA進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序94度4min，94度30s，53度30s，72度1.5min，72度10分鐘；
[0007]第三步，然后將擴增產(chǎn)物，交生物測序公司使用3730測序儀測序；
[0008]第四步，將測序產(chǎn)物與給出的序列聯(lián)合，使用Clustalx軟件進行比對，并構(gòu)建NJ樹，鑒定是否有豬肉狗肉和驢肉的非清真成分存在。
[0009]進一步，在第二步中，16SA-SB-ZNYF引物的5’ -3’基因序列為:
[0010]CGGCCGCGGTATTCTGACCGTGC。
[0011]進一步，在第二步中，16SA-SB-ZNYR引物的5’ _3’基因序列為:
[0012]GATCACGTAGGACTTTAATCGTTG。
[0013]進一步，在第三步中，如果出現(xiàn)測序結(jié)果峰型較亂的情況，使用額外三對引物(16SA-豬 &16SA-SB-ZNYR，16SA-狗 &16SA-SB-ZNYR，16SA-驢 &16SA-SB-ZNYR，分別擴增交生物測序公司使用3730測序儀測序；
[0014]如果依然測序結(jié)果混亂，改用將PCR產(chǎn)物連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，挑選克隆不少于6個進行測序。
[0015]進一步，在第三步中，16SA-豬引物的5’ -3’基因序列為:
[0016]TTAACTATTCCAAAAGTTAAAC ；
[0017]16SA-狗引物的5，-3，基因序列為:
[0018]TTAACTAACCCAAACTTATGGAT ；
[0019]16SA-驢引物的5，-3，基因序列為:
[0020]TTAACTGATTCACAAAAAACAACATAC。
[0021]本發(fā)明提供的清真肉類食品的分子鑒定方法，通過取將待檢測樣品25mg，提取基因組DNA ;使用設(shè)計的引物16SA-SB-ZNYF和16SA-SB-ZNYR，對提取的DNA進行PCR擴增；然后將擴增產(chǎn)物，交生物測序公司使用3730測序儀測序；使用Clustalx軟件進行比對，并構(gòu)建NJ樹，鑒定是否有豬肉狗肉和驢肉的非清真成分存在。本發(fā)明針對豬肉新設(shè)計了專用擴增引物，可以高效率擴增豬肉DNA，即使食品中含有微量豬肉、狗肉或驢肉DNA也可以被識別；擴增產(chǎn)物直接測序或者克隆測序，得到的測序結(jié)果對豬、狗、驢、牛、羊等的分辨率高，可以準確區(qū)分出豬肉、狗肉或驢肉成分；準確檢測肉類制品中是否含有豬肉、狗肉或驢肉。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明實施例提供的清真肉類食品的分子鑒定方法流程圖。
【具體實施方式】
[0023]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0024]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。
[0025]如圖1所示，本發(fā)明實施例的清真肉類食品的分子鑒定方法包括以下步驟:
[0026]SlOl:取將待檢測樣品25mg，使用通用型柱式基因組提取試劑盒提取基因組DNA，操作步驟中Proteinase K消化時，采取過夜處理，消化時間10個小時以上；
[0027]S102:使用設(shè)計的引物，16SA-SB-ZNYF和16SA-SB-ZNYR，對提取的DNA進行PCR擴增，PCR 反應(yīng)程序 94 度 4min，94 度 30s，53 度 30s，72 度 1.5min，72 度 10 分鐘；
[0028]S103:將擴增產(chǎn)物，交生物測序公司使用3730測序儀測序；
[0029]S104:將測序產(chǎn)物與給出的序列聯(lián)合，使用Clustalx軟件進行比對，并構(gòu)建NJ樹，鑒定是否有豬肉狗肉和驢肉的非清真成分存在。
[0030]本發(fā)明的具體步驟為:
[0031]1、取將待檢測樣品25mg，使用通用型柱式基因組提取試劑盒(型號CW2298)提取基因組DNA，操作步驟中稍作優(yōu)化=Proteinase K消化時，采取過夜處理，消化時間10個小時以上；
[0032]2、使用設(shè)計的引物(16SA-SB-ZNYF和16SA-SB-ZNYR)，如表1所示；對提取的DNA進行PCR擴增(使用TaKaRa公司生產(chǎn)的Ex Taq進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序94度4min (94度 30s, 53 度 30s, 72 度 1.5min)，72 度 10 分鐘)；
[0033]表1
[0034]
_名稱I引物序列(5’ -3’ )
16SA-SB-ZNYF CGGCCGCGGTATTCTGACCGTGC_

16SA-SB-ZNYR GATCACGTAGGACTTTAATCGTTG
16SA-豬T?Xactattccaamgttaaac
16SA-狗TTXactaacccaaacttatggat
16SA-驢 Ittaactgattcacmaaaacaacatac '
[0035]3、分以下三種情況:
[0036]a將然后將2的擴增產(chǎn)物，交生物測序公司使用3730測序儀測序；
[0037]b如果出現(xiàn)測序結(jié)果峰型較亂的情況，使用額外三對引物(16SA-豬&16SA-SB-ZNYR, 16SA-狗 &16SA-SB-ZNYR，16SA-驢 &16SA-SB-ZNYR)，分別擴增交生物測序公司使用3730測序儀測序；
[0038]c如果b步依然測序結(jié)果混亂，改用將PCR產(chǎn)物連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，挑選克隆不少于6個進行測序；
[0039]4、將測序產(chǎn)物與給出的序列聯(lián)合，使用Clustalx軟件進行比對，并構(gòu)建NJ樹，鑒定是否有豬肉狗肉和驢肉的非清真成分存在。
[0040]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0041]<110> 申請人:名稱:北方民族大學(xué)
[0042]<120>發(fā)明名稱:一種清真肉類食品的分子鑒定方法，
[0043]<160>序列表中序列的個數(shù):24個序列
[0044]〈211〉序列的長度:羊的每個序列分別為484bp牛每個序列分別為484bp豬的每個序列分別為489bp驢的每個序列分別為490bp狗的每個序列分別為491bp
[0045]〈212〉序列的類型:DNA
[0046]〈213〉序列來源的生物名稱:豬、狗、牛、羊、驢
[0047]〈400〉是核苷酸序列。核苷酸序列:
[0048]> 羊 I (484)
【權(quán)利要求】
1.一種清真肉類食品的分子鑒定方法，其特征在于，該清真肉類食品的分子鑒定方法包括以下步驟: 第一步，取將待檢測樣品25mg，使用通用型柱式基因組提取試劑盒提取基因組DNA，操作步驟中Proteinase K消化時，采取過夜處理，消化時間10個小時以上； 第二步，使用設(shè)計的引物16SA-SB-ZNYF和16SA-SB-ZNYR，對提取的DNA進行PCR擴增，PCR 反應(yīng)程序 94 度 4min, 94 度 30s, 53 度 30s, 72 度 1.5min, 72 度 10 分鐘； 第三步，然后將擴增產(chǎn)物，交生物測序公司使用3730測序儀測序； 第四步，將測序產(chǎn)物與給出的序列聯(lián)合，使用Clustalx軟件進行比對，并構(gòu)建NJ樹，鑒定是否有豬肉狗肉和驢肉的非清真成分存在。
2.如權(quán)利要求1所述的清真肉類食品的分子鑒定方法，其特征在于，在第二步中，16SA-SB-ZNYF引物的5’ -3’基因序列為:
CGGCCGCGGTATTCTGACCGTGC。
3.如權(quán)利要求1所述的清真肉類食品的分子鑒定方法，其特征在于，在第二步中，16SA-SB-ZNYR引物的5，-3，基因序列為:
GATCACGTAGGACT TTAATCGTTG。
4.如權(quán)利要求1所述的清真肉類食品的分子鑒定方法，其特征在于，在第三步中，如果出現(xiàn)測序結(jié)果峰型較亂的情況，使用額外三對引物(16SA-豬&16SA-SB-ZNYR，16SA-狗&16SA-SB-ZNYR, 16SA-驢&16SA-SB-ZNYR，分別擴增交生物測序公司使用3730測序儀測序; 如果依然測序結(jié)果混亂，改用將PCR產(chǎn)物連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，挑選克隆不少于6個進行測序。
5.如權(quán)利要求4所述的清真肉類食品的分子鑒定方法，其特征在于，在第三步中，16SA-豬引物的5’ -3’基因序列為:
TTAACTATTCCAAAAGTTAAAC ； 16SA-狗引物的5’ -3’基因序列為:
TTAACTAACCCAAACTTATGGAT ； 16SA-驢引物的5’ -3’基因序列為:
TTAACTGATTCACAAAAAACAACATAC。
【文檔編號】C12Q1/68GK104032004SQ201410259544
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】曹曉虹, 陳?？? 于淑坤, 龔波林 申請人:北方民族大學(xué)